貓科動(dòng)物DNA條形碼及線粒體假基因?qū)ξ锓N鑒定的影響

蔡延森， 李佳凌， 趙矯， 張亮

(1.西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，四川瀘州646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)研究室，四川瀘州646000；3. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610081)

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貓科動(dòng)物DNA條形碼及線粒體假基因?qū)ξ锓N鑒定的影響

蔡延森1， 李佳凌2， 趙矯1， 張亮3*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，四川瀘州646000； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)研究室，四川瀘州646000；3. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610081)

在多種動(dòng)物類群中，基于線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因的DNA條形碼是一種高效的物種鑒別手段，然而貓科Felidae動(dòng)物中廣泛存在的線粒體假基因可能影響DNA條形碼的有效性。本研究共涉及貓科動(dòng)物12屬25種119個(gè)樣本。采用3對條形碼通用引物對6屬11種29個(gè)貓科動(dòng)物樣本進(jìn)行了擴(kuò)增及測序。結(jié)果3個(gè)樣本擴(kuò)增失敗，8個(gè)樣本得到假基因，18個(gè)樣本獲得了條形碼序列。結(jié)合另外93條貓科動(dòng)物條形碼序列(源自BOLD Systems)，采用Kimura 2-parameter模型計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)樹。結(jié)果顯示，遺傳距離種內(nèi)為0%～8.1%，平均0.8%；種間為1.4%～13.1%，平均8.7%；屬間為8.2%～21.8%，平均15.1%。NJ樹顯示，除3個(gè)種外，其余物種均以極高的置信度(99%)形成單系分支。而假基因序列有些可以單獨(dú)形成分支，有些夾雜在COⅠ序列形成的分支中，對物種鑒定產(chǎn)生干擾。

COⅠ； 貓科； 線粒體假基因

近年來，DNA條形碼作為一種分子級別的物種鑒定手段，已經(jīng)在多種昆蟲、魚類、鳥類、哺乳類等動(dòng)物中顯示了其準(zhǔn)確、高效、便捷的特點(diǎn)(Hebertetal.，2003，2004；蔡延森等，2009，2014；Caietal.，2011，2017；Kressetal.，2015；Lietal.，2017)。在動(dòng)物中，常用的DNA條形碼是一段標(biāo)準(zhǔn)化的線粒體基因片段，即細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因片段(Hebertetal.，2003)。該段序列帶有豐富的物種信息，適用PCR擴(kuò)增的通用引物，極少出現(xiàn)插入或缺失，并且具有母系遺傳、無內(nèi)含子、重組受限等特點(diǎn)(Brownetal.，1982)。這些特點(diǎn)使得條形碼序列的測序及序列分析較方便快捷，進(jìn)而準(zhǔn)確地顯示出樣本的種屬信息。這種快捷準(zhǔn)確的物種鑒定技術(shù)，對于檢驗(yàn)檢疫、動(dòng)物制品質(zhì)量控制、生物多樣性保護(hù)、圈養(yǎng)動(dòng)物管理等各方面工作有重要意義。

線粒體假基因(nuclear mitochondrial pseudogenes，numts)是起源于線粒體，后來整合到核基因組中并失去功能的DNA序列(Lopezetal.，1994)。用條形碼通用引物從總基因組DNA中擴(kuò)增COⅠ基因片段時(shí)，可能得到numts序列而并非mtDNA上的目的基因片段(周志軍等，2014)。雖然numts并不是普遍存在于所有物種中，但貓科Felidae動(dòng)物核基因組中存在著大段的numts序列，例如家貓線粒體全基因組約17 kb，其核基因組中就有高達(dá)7.9 kb的numts(Lopezetal.，1994)。這不僅會(huì)增加物種鑒定的難度，甚至可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定結(jié)論。

本研究對25種貓科動(dòng)物的樣本進(jìn)行了分析，包括國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物——東北虎Pantheratigrisaltaica、華南虎P.tigrisamoyensis、雪豹P.uncia、金錢豹P.pardus，國家Ⅱ級保護(hù)動(dòng)物亞洲金貓Catopumatemminckii、兔猻Otocolobusmanul、猞猁Lynxlynx、歐洲野貓F(tuán)elissilvestrissilvestris、荒漠貓F(tuán).bieti，以及列入IUCN瀕危物種紅色名錄的獅子P.leo、美洲獅Pumaconcolor、美洲豹P.onca、獵豹Acinonyxjubatus等，并對其中出現(xiàn)較高頻率numts的現(xiàn)象進(jìn)行了分析，探究DNA條形碼對貓科動(dòng)物物種鑒定的可靠性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本研究共涉及貓科動(dòng)物12屬25種119個(gè)樣本，其中6屬11種29個(gè)樣本為本實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。所有樣本均通過非損傷取樣獲得，采集自貓科動(dòng)物的糞便，從中獲取毛發(fā)后提取毛囊DNA，然后保存于4 ℃冰箱中備用或95%乙醇中-80 ℃長期保存。其余序列下載自The Barcode of Life Data Systems(BOLD Systems，http：//www.boldsystems.org)。在BOLD貓科動(dòng)物條形碼目錄中下載了全部323個(gè)序列(截止2017年3月)，刪除非COⅠ基因及長度小于500 bp的COⅠ序列，最后剩下93條序列參與分析(含numts)。

表1 樣本信息Table 1 Sample information

注：*擴(kuò)增得到假基因，☆擴(kuò)增失敗。

Notes:*nuclear mitochondrial pseudogene was obtained，☆amplification was failed.

1.2DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen，Hilden，Germany)。PCR擴(kuò)增共使用了3對引物，首先使用脊椎動(dòng)物COⅠ通用引物對LCOI1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HCOI2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。如果擴(kuò)增失敗或測序結(jié)果為套峰，則替換引物重新擴(kuò)增，使用引物對VF1：5’-TTCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3’，VR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；或Zlf04：5’-TCTCAACTAAYCAYAAAGAYATYGG-3’，Zlr04：5’-TAAACTTCrGGGTGACCAAArAATCA-3’。每25 μL PCR反應(yīng)體系包含：約25 ng DNA模板，2.5 mM MgCl2，1×PCR buffer(TaKaRa，中國大連)，1.0 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)，上下游引物各0.5 μM， 每種dNTP各50 μM。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit)回收約700 bp目的片段，直接雙向測序。

1.3序列分析

將測序所獲正、反向序列導(dǎo)入DNAman，EditSeq等軟件進(jìn)行拼接，使用MEGA 6與同源序列進(jìn)行比對。由于貓科動(dòng)物中numts出現(xiàn)的頻率大大高于其他物種，而COⅠ假基因大多存在提前的終止密碼子或帶有插入/缺失導(dǎo)致的移碼突變，所有序列還逐一進(jìn)行了手工校正并分析其蛋白序列，根據(jù)是否存在終止密碼子、移碼突變進(jìn)而鑒定擴(kuò)增所得為COⅠ基因片段或numts。最后用Kimura 2-parameter(K2P)模型計(jì)算遺傳距離，并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)樹。

線粒體DNA的核轉(zhuǎn)移時(shí)間計(jì)算方法采用Li等(1981)的計(jì)算公式：δ=(μ1+μ2)t。其中t為分歧時(shí)間，δ為序列之間遺傳差異，μ1和μ2分別為線粒體DNA和numts每年每個(gè)核苷酸替換速率，μ1=1.7×10-8，μ2=4.7×10-9。

2 結(jié)果

本研究共提供了29個(gè)貓科動(dòng)物個(gè)體的新樣本，其中3個(gè)樣本(jdPTA01、jdPPA827、jdPPA829)擴(kuò)增失敗，更換引物后擴(kuò)增依然失敗或測序結(jié)果為套峰，無法讀取序列。8個(gè)樣本測序結(jié)果最初為套峰，更換引物重新擴(kuò)增測序后，得到的序列有明顯numt特征，存在堿基插入/缺失或終止密碼子。其余18個(gè)樣本經(jīng)過1～3次擴(kuò)增，得到660 bp左右清晰無套峰的片段，序列用MEGA 6比對分析無插入/缺失、終止密碼子，通過NCBI中Blast相似性檢索，確定為COⅠ序列。

2.1遺傳距離分析

DNA條形碼序列的K2P遺傳距離在貓科動(dòng)物的種內(nèi)差異普遍較高，最低為0，最高達(dá)8.1%，平均為0.8%；同屬種間遺傳距離為1.4%～13.1%，平均為8.7%；同科屬間遺傳距離為8.2%～21.8%，平均為15.1%。種內(nèi)、同屬種間、同科屬間的遺傳距離分布頻率見圖1(numts序列未計(jì)入)。

Hebert等(2004)提出DNA條形碼劃分物種的10×規(guī)則，即種間遺傳差異要高于種內(nèi)遺傳差異10倍。野貓F(tuán)elissilvestris及其圈養(yǎng)亞種家貓F(tuán).s.catus的種內(nèi)個(gè)體間差異最大達(dá)到了10.3%，超過平均值(0.8%)12.8倍，不符合Hebert的10×規(guī)則。

圖1 種內(nèi)、同屬種間、同科屬間的遺傳距離分布頻率Fig. 1 Distribution of genetic distances within species， genus and family of Felidae

2.2聚類分析

本研究中有16個(gè)種含多個(gè)樣本參與分析。MEGA 6構(gòu)建NJ樹結(jié)果顯示，其中13個(gè)種以極高的置信度(99%)各自形成單系分支，表明這些種可被DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定(圖2)，包括獵豹、獰貓Caracalcaracal、亞洲金貓、猞猁、加拿大猞猁L.canadensis、短尾貓L.rufus、兔猻、獅子、老虎P.tigris、金錢豹、雪豹、扁頭豹貓Prionailurusplaniceps、美洲獅。另外3個(gè)種沒有形成單系，分別有2～4個(gè)分支，包括豹貓屬Prionailurus的豹貓P.bengalensis，漁貓P.viverrinus和野貓(F.silvestris和F.s.catus)。其余9個(gè)種只包含1個(gè)樣本參與分析，所有物種沒有共享序列，在NJ樹上物種沒有重疊。

在豹貓屬中，物種的種內(nèi)平均差異為1.1%～5.3%，種間平均差異為4.6%～6.3%，物種之間沒有共享序列。表明雖然存在較大的種內(nèi)分化，但基于聚類分析，DNA條形碼依然能夠?qū)λ鼈冞M(jìn)行有效的物種鑒別。

在NJ樹上，野貓大部分個(gè)體聚在一起形成一個(gè)大支(Felissilvestris和F.s.catus)，該群體內(nèi)遺傳差異平均為0.3%(0～1.6%)，其余部分序列分別形成了3個(gè)小分支(F.s.catus1、F.s.catus2和F.s.catus3)。這3個(gè)小分支同大分支的平均遺傳差異分別為7.9%、3.6%、5.3%，分別有4、1、9處堿基位點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變。在NCBI中用Blast相似性檢索，這3個(gè)分支中的序列同家貓線粒體假基因全序列的相似度分別達(dá)到99%、96%、95%。

2.3假基因的分析

在獅子、老虎、金錢豹、荒漠貓4個(gè)物種中檢測出帶有終止密碼子的序列，為明顯的numts特征。對這些numts序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：獅子、老虎、金錢豹3個(gè)物種的numts以87%的置信度聚在一起，群體內(nèi)遺傳差異為0.5%～1.4%。根據(jù)Li等(1981)對mtDNA和numts的分歧時(shí)間計(jì)算方法，可以得知獅子、老虎、金錢豹的核轉(zhuǎn)移事件發(fā)生的時(shí)間分別為約220萬年前、350萬年前、270萬年前。

荒漠貓假基因序列(圖2，NJ樹上F.bietinumts)同野貓2個(gè)個(gè)體的“COⅠ序列”(圖2，NJ樹上F.s.catus1)以100%的置信度聚為一支，群體內(nèi)遺傳差異僅為0.5%～0.8%；而野貓F(tuán).s.catus1這一支中的2個(gè)序列同野貓其他個(gè)體之間的遺傳差異高達(dá)6.9%～10.3%，因此推測這2個(gè)序列極有可能是numts(GBMA5696-13|Feliscatus|COⅠ-5P|JX426133和GBMIN43334-14|Feliscatus|COⅠ-5P|KF771218)。

3 討論

本研究中貓科動(dòng)物種內(nèi)和種間的平均遺傳差異分別為0.8%和8.7%，NJ樹上大部分物種都以極高置信度形成單系，這些數(shù)據(jù)表明DNA條形碼在很大程度上能夠?qū)ω埧苿?dòng)物實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的鑒定。個(gè)別物種NJ樹上沒有形成單系且種內(nèi)遺傳差異較大，可能有兩方面的原因。

一方面，可能是進(jìn)化方面的原因：新近分化的物種存在不完全譜系分選現(xiàn)象；近源物種的種間雜交導(dǎo)致基因滲透；由于地理/生殖隔離導(dǎo)致較大的種內(nèi)遺傳差異、多亞種等。這些因素都可能導(dǎo)致DNA條形碼對物種的鑒別出現(xiàn)困難甚至失敗。沒有形成單系的豹貓和漁貓都是豹貓屬的近源物種。其中，豹貓至少含8個(gè)亞種(Mukherjeeetal.，2016)；漁貓雖然沒有亞種劃分，但該物種的棲息地碎片化，長期處于地理/生殖隔離狀態(tài)(Mukherjeeetal.，2016)。此外，全世界廣泛分布的野貓有22個(gè)亞種(Wozencraft，2005)，在NJ樹上有4個(gè)分支?？梢姡沁@些進(jìn)化方面的原因?qū)е铝诉@些物種的種內(nèi)分化。

另一方面的原因是numts同COⅠ共擴(kuò)增的現(xiàn)象，會(huì)對物種鑒定造成干擾、錯(cuò)誤，甚至產(chǎn)生不存在的“新種”等。在NJ樹上，獅子、老虎、金錢豹3個(gè)物種看似有多個(gè)分支，種內(nèi)絕大部分個(gè)體形成一個(gè)大支，另一些個(gè)體則形成幾個(gè)小分支。但實(shí)際上，這幾個(gè)小分支里面所包含的都是numts序列。如果將numts誤認(rèn)為是DNA條形碼對其進(jìn)行分析，則會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

誤把numts當(dāng)COⅠ的情況可能是野貓鑒定失敗的主要原因。在NJ樹上，F(xiàn).s.catus1這支野貓和荒漠貓的numts以100%的置信度聚在一起，二者間的遺傳差異僅為0.5%～0.8%，并且這支中的個(gè)體同種內(nèi)其他個(gè)體的差異最高達(dá)10.3%(平均7.9%)。雖然在F.s.catus1中沒有檢測到終止密碼子、插入/缺失，但推測它極有可能是numts：首先，貓科動(dòng)物中不同物種的numts通常聚為一支(如：獅子、老虎、金錢豹)，而它同荒漠貓numts也高度相似聚在一起；其次，該序列在GenBank中Blast，同家貓numts序列相似度為99%；最后，根據(jù)Li等(1981)的方法計(jì)算mtDNA發(fā)生核轉(zhuǎn)移的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)該序列發(fā)生核轉(zhuǎn)移的時(shí)間約350萬年前，該時(shí)間同獅子、老虎、金錢豹的numts發(fā)生時(shí)間相似(220萬年～350萬年)。這些證據(jù)都從側(cè)面暗示了它是numts。

綜上，DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中已有序列的準(zhǔn)確性對基于該技術(shù)的物種鑒定至關(guān)重要，而通用引物從總基因組DNA中擴(kuò)增時(shí)，可能得到numts序列而并非COⅠ目的基因片段，這一現(xiàn)象應(yīng)該得到重視。研究者如果不能正確區(qū)分numts和mtDNA，把錯(cuò)誤的序列關(guān)聯(lián)物種信息并存入數(shù)據(jù)庫，則會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的各項(xiàng)工作出現(xiàn)混亂和錯(cuò)誤。本研究表明該問題在貓科動(dòng)物中普遍存在，其他種類的動(dòng)物中是否也存在大量numts，對條形碼技術(shù)形成類似的干擾影響，有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

圖2 貓科動(dòng)物25種119個(gè)樣本的COⅠ及numts序列所構(gòu)建的NJ樹Fig. 2 NJ tree of 119 COⅠ and numts sequences in 25 species of Felidae

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DNABarcodinginFelidae，andtheEffectsofNuclearMitochondrialPseudogenesonSpeciesIdentification

CAI Yansen1， LI Jialing2， ZHAO Jiao1， ZHANG Liang3*

(1. Department of Medical Cell Biology and Genetics， Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan Province 646000， China；2. Department of Morphology， Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan Province 646000， China； 3. Key Laboratory of Conservation Biology on Endangered Wildlife， Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding， Chengdu 610081， China)

In a variety of animal species， DNA barcoding based on mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene is an efficient tool for species identification. However， the presence of large mitochondrial pseudogenes in felids may affect the effectiveness of DNA barcoding. In this study， 119 felid samples from 25 species of 12 genera were analyzed.3 pairs of universal primers were used to amplify and sequence theCOⅠ genes of 29 felid samples that belonged to 11 species from 6 genera. The results showed that the amplification was failed in 3 samples， nuclear mitochondrial psedogenes (numts) were obtained in 8 samples， and barcode sequences were derived in 18 samples. Combined with the other 93 felid barcode sequences (derived from BOLD Systems)， Kimura 2-parameter model was used to calculate the genetic distance and to construct Neighbor-Joining (NJ) tree. The genetic distance within species were 0%-8.1%， with an average of 0.8%； the interspecific genetic distance were 1.4%-13.1%， with an average of 8.7%； and the genetic distance within family were 8.2%-21.8%， with an average of about 15.1%. The NJ tree showed that most of the species formed a monophyletic clade with high confidence (99%)， except 3 species； some of the numts sequences could form a clade on NJ tree， and the others were inserted in the branches of theCOⅠ sequences， which may compromise the species identification.

COⅠ； Felidae； nuclear mitochondrial pseudogenes

2017-03-13接受日期：2017-06-15

四川省教育廳科研項(xiàng)目(12ZA242)

蔡延森(1982—)， 男， 碩士， 講師， E-mail：cys_cys@aliyun.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：zliang@panda.org.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170079

Q959.8

： A

： 1000-7083(2017)04-0425-06