• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山羊早期胎兒組織TET1與Wnt通路基因的 表達(dá)變化及其相關(guān)性

    2017-07-31 23:47:33譚強(qiáng)羅南劍張艷麗安炳星陳秋羊趙永聚
    中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年14期
    關(guān)鍵詞:負(fù)相關(guān)山羊胚胎

    譚強(qiáng),羅南劍,張艷麗,安炳星,陳秋羊,趙永聚

    ?

    山羊早期胎兒組織TET1與Wnt通路基因的 表達(dá)變化及其相關(guān)性

    譚強(qiáng),羅南劍,張艷麗,安炳星,陳秋羊,趙永聚

    (西南大學(xué)動物科技學(xué)院/重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市草食動物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心,重慶 400715)

    【目的】通過檢測TET1和Wnt信號通路相關(guān)基因以及DKK家族基因在山羊胎兒發(fā)育早期的表達(dá)變化,分析TET1與Wnt通路基因的相關(guān)性,為TET1調(diào)控山羊胎兒發(fā)育研究提供理論依據(jù)?!痉椒ā窟x取12只健康大足黑山羊母羊,自然發(fā)情后與同一只種公羊自然交配。采用剖腹產(chǎn)手術(shù)的方法,分別獲得妊娠20、25、30、60和90d的胎兒,對胎兒的生長指標(biāo)(體重、體長)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并采集了60和90d胎兒的組織器官樣品(心、肝、肺、腎、腦、皮膚),通過Real-time PCR(RT-PCR)檢測各樣品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相對表達(dá)量。利用SPSS軟件分析山羊胎兒發(fā)育早期不同階段TET1與WNT信號通路相關(guān)基因相關(guān)性以及基因表達(dá)顯著性(<0.05)?!窘Y(jié)果】山羊妊娠早期胎兒生長在60d后有顯著變化。熒光定量檢測結(jié)果表明,TET1基因表達(dá)隨妊娠天數(shù)的增加呈上升趨勢。Wnt家族基因在山羊胎兒發(fā)育中都檢測到表達(dá)(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表達(dá)量隨胎兒發(fā)育逐漸增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d時(shí)有顯著高表達(dá)(<0.05);Wnt4在胎兒發(fā)育20 d時(shí)表達(dá)顯著(<0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有顯著高表達(dá)(<0.05)。DKK家族基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示,DKK1在胎兒發(fā)育早期階段都有表達(dá),DKK2/3在妊娠初期表達(dá)量較低,后期表達(dá)增高。通過組織中基因表達(dá)檢測顯示,TET1在90d胎兒肝、肺、腎和腦中的表達(dá)水平相比于60d胎兒組織升高,肝中表達(dá)量顯著(<0.05)。Wnt家族基因Wnt2在組織器官中有相對活躍的表達(dá),妊娠90d胎兒肺中表達(dá)量極顯著(<0.01);Wnt16基因在胎兒皮膚組織中表達(dá)顯著(<0.05),且維持在一個(gè)較高的水平;Wnt5a和Wnt7b在腎中表達(dá)顯著(<0.05),其他Wnt基因在組織中都有表達(dá)。相關(guān)性分析顯示,胎兒生長指標(biāo)(體重、體長)變化與TET1的表達(dá)呈極顯著正相關(guān)(<0.01);TET1在胎兒發(fā)育早期的表達(dá)與Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈現(xiàn)正相關(guān),與Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈負(fù)相關(guān),其中與Wnt5b呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與Wnt7b呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。Wnt通路基因之間也有相互關(guān)系,Wnt2與Wnt4呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)。Wnt2與Wnt7b,Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a與Wnt5b呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。Wnt4與Wnt5a呈顯著正相關(guān)(<0.05)。【結(jié)論】獲得了TET1與Wnt基因在山羊胎兒發(fā)育早期的表達(dá)模式,并進(jìn)行了相關(guān)性分析,填補(bǔ)了這些基因在山羊方面的研究空白;TET1與Wnt基因?qū)ι窖蛱涸缙诘陌l(fā)育和組織的形成是一個(gè)動態(tài)的調(diào)控變化過程;TET1基因表達(dá)與部分Wnt基因呈現(xiàn)顯著正相關(guān),部分呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān);Wnt通路基因之間表達(dá)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)為TET1與Wnt分子調(diào)控山羊早期胎兒發(fā)育的機(jī)制深入研究提供了參考。

    山羊胎兒;TET1;Wnt通路基因;表達(dá)變化;相關(guān)性

    0 引言

    【研究意義】TET1(Ten-Eleven-Translocation1)是參與主動去甲基化過程的主要作用酶之一[1-2]。其介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)在哺乳動物中普遍存在[3]。Wnt (wingless-type MMTV integration site family)信號通路,關(guān)系到胚胎附植前后的胎兒發(fā)育、胎盤發(fā)生等生理事件[4]。而妊娠早期胚胎發(fā)育對妊娠期間胎兒的發(fā)育及出生后發(fā)育都有影響,因此明確TET1與Wnt基因在山羊胎兒早期發(fā)育的表達(dá)模式,對于優(yōu)質(zhì)羔羊生產(chǎn)研究提供指導(dǎo)作用?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】TET1屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族成員,是一種5mC羥化酶,主要在胎兒組織和干細(xì)胞中表達(dá),能啟動DNA去甲基化程序,調(diào)控胚胎干細(xì)胞的發(fā)育[2, 5]。TET1家族蛋白參與整個(gè)胚胎的發(fā)育過程,相關(guān)研究顯示同時(shí)敲除TET家族基因TET1/3后,胚胎早期發(fā)育中轉(zhuǎn)錄組多樣性有所增加[6],在父系小鼠TET1敲除的后代胎兒出現(xiàn)生長缺陷、死亡率增高、發(fā)育遲緩等現(xiàn)象[7]。Wnt基因由NUSSE等[8]發(fā)現(xiàn),后來相繼發(fā)現(xiàn)多個(gè)Wnt家族基因。Wnt通路關(guān)系到生物體生長、發(fā)育、疾病和細(xì)胞癌變等過程,并通過細(xì)胞間信號傳遞對許多不同組織器官的形成進(jìn)行調(diào)控,包括腎、腸、骨、皮膚、心臟和肺等[9-13]。其中經(jīng)典Wnt信號通路(Wnt/β- cantenin)廣泛參與維持干細(xì)胞的多功能性,誘導(dǎo)特定組織和器官的生長等生物學(xué)過程,對哺乳動物發(fā)育生長,包括早期胚胎組織器官發(fā)育都有調(diào)控作用,其通路相關(guān)因子也相繼被發(fā)現(xiàn)[14-17]。DKK 作為Wnt信號通路拮抗物,能夠維持 Wnt信號通路的穩(wěn)態(tài),調(diào)控通路下游基因表達(dá),在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[18],其缺失往往導(dǎo)致胚胎生長發(fā)育障礙,出現(xiàn)胎兒發(fā)育不全或致死[19-20]。同時(shí),在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)TET1通過抑制Wnt通路拮抗基因DKK來維持一個(gè)低甲基化水平,能夠?qū)nt通路在結(jié)直腸癌發(fā)生調(diào)控中具有相互作用[21]。此外,LI等[22]發(fā)現(xiàn),TET1/2/3缺失的小鼠胚胎(8.0—8.5d)Wnt通路表現(xiàn)超活性,TET1蛋白在小鼠胚胎和ESCs細(xì)胞中對Wnt通路具有關(guān)鍵性調(diào)控,通過建立神經(jīng)細(xì)胞和中胚層細(xì)胞命運(yùn)決定之間的適當(dāng)平衡?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量研究表明,TET1和Wnt基因?qū)ε咛グl(fā)育調(diào)控過程中具有生理和時(shí)空上的一致性,且能夠相互作用調(diào)節(jié)[7, 23-24],在人[25]、小鼠[17]、牛[16]、綿羊[4]、馬[26]上都有所研究,而山羊上,TET1和Wnt基因在早期胎兒發(fā)育中的表達(dá)模式不清楚,兩者之間相互關(guān)系在山羊中的研究尚為空白。【擬解決的關(guān)鍵問題】以大足黑山羊妊娠早期胎兒為對象,檢測胎兒早期發(fā)育過程中TET1、Wnt通路相關(guān)基因及DKK家族的動態(tài)表達(dá)變化模式。通過相關(guān)分析,探求基因之間的相互關(guān)系,為進(jìn)一步研究TET1和Wnt通路調(diào)控山羊胎兒發(fā)育提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間

    本試驗(yàn)于2015年10月至2016年7月在西南大學(xué)畜牧場、重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西南大學(xué)動物醫(yī)院進(jìn)行。

    1.2 試驗(yàn)動物

    選取西南大學(xué)種羊場12只健康的1.5周歲大足黑山羊空懷母羊,與同一只大足黑山羊公羊進(jìn)行自然交配,交配后觀察返情情況,如果沒有,則以最后一次配種日期為妊娠0 d。在妊娠20 d(n=4)、25 d(n=3)、30 d(n=3)、60 d(n=5)、90 d(n=7),剖腹產(chǎn)手術(shù)獲得胎兒,測胎兒體重及體長。采集心、肝、肺、腎、腦、皮膚組織樣品,液氮中保存待用。

    1.3 總RNA提取和cDNA合成

    RNA提取采用TIAN GEN生物公司提供的RNAsimple Total RNA Kit,按照說明書提供步驟進(jìn)行操作。提取RNA通過核酸測定儀檢測RNA濃度,合格樣品-80℃保存。

    cDNA合成采用TIAN GEN提供FastQuant RT Kit(with gDNase)。根據(jù)說明書步驟操作,cDNA樣品-80℃保存。

    1.4 引物合成和PCR分析

    Wnt基因、TET1和DKK家族基因引物序列如表1,委托上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。

    1.5 Real-time PCR分析

    Real-time PCR用于檢測妊娠早期胎兒發(fā)育各組織中基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系包括:Nuclease-Free Water(3.6μL)、上游引物(0.2μL)、下游引物(0.2μL)、GoTaq?qPCR Master Mix(5μL),樣品1μL,構(gòu)成總體積為10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃變性10min,95℃15s,退火復(fù)性1min,40個(gè)PCR循環(huán),采用默認(rèn)設(shè)置自動生成Ct值。RT-PCR相對定量的內(nèi)參基因選擇在胚胎發(fā)育階段表達(dá)相對較為穩(wěn)定的β-Actin[14]。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    RT-PCR結(jié)果采用Bio-Rad CFX Manager軟件導(dǎo)出為Excel,數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理參考Pfaffl2-ΔΔt方法[27]。采用20 d胎兒組織作為參考樣品,計(jì)算ΔCt(ΔCt= Ct參考樣品目的基因- Ct參考樣品內(nèi)參基因),ΔΔCt=(Ct目標(biāo)樣品中目的基因-Ct目標(biāo)樣品內(nèi)參基因)-ΔCt,根據(jù)公式計(jì)算基因相對表達(dá)量。所有試驗(yàn)都設(shè)有3組重復(fù),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所得組織相對表達(dá)量采用SPSS18.0進(jìn)行差異性分析(LSD法),顯著水平<0.05;用Bivariate Correlations 估計(jì)基因與胎兒生長指標(biāo)、基因與基因之間的相關(guān)性。

    2 結(jié)果

    2.1 胎兒生長發(fā)育指標(biāo)

    剖腹產(chǎn)獲得山羊發(fā)育前期(20、25、30、60和90d)完整胎兒,并對其重量和體長變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),得到胎兒生長變化趨勢(圖1)。從圖1-A、B可以看出,山羊胎兒早期發(fā)育體重在60 d后顯著增加,體長在30 d后顯著增加。

    2.2 TET1基因在胎兒發(fā)育早期階段的表達(dá)

    RT-PCR結(jié)果表明,在胎兒發(fā)育早期階段,TET1基因均有表達(dá)。檢測發(fā)現(xiàn)TET1表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(圖2),與胎兒體重、體長指標(biāo)具有一致性。其中在25 d有突出表達(dá),但經(jīng)過差異比較,與20 d和30 d表達(dá)量差異不顯著(>0.05),不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。妊娠90 d的胎兒,TET1具有顯著高表達(dá),表達(dá)量顯著高于20、25、30和60 d表達(dá)量(<0.05)。

    表1 熒光定量基因引物列表

    * P<0.05

    2.3 WNT家族基因在胎兒發(fā)育早期階段的表達(dá)

    WNT家族基因Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b 、Wnt16在發(fā)育早期胎兒組織中都有表達(dá)。Wnt2和Wnt7b表達(dá)量隨胎兒發(fā)育逐漸增高,在發(fā)育后期表達(dá)量較高,妊娠90 d胎兒中表達(dá)顯著(<0.05);Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d胎兒中有顯著高表達(dá)(<0.05);Wnt4基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的變化,在妊娠20 d胎兒中表達(dá)顯著(<0.05);Wnt16基因在妊娠25 d胎兒中有顯著表達(dá)(<0.05)。胎兒早期發(fā)育階段,Wnt2與Wnt7b表達(dá)變化相似;Wnt2b表達(dá)量較低;Wnt4在早期階段的表達(dá)較高,而Wnt5a和Wnt5b的表達(dá)量的變化趨勢與Wnt4相反,在妊娠30d胎兒有顯著表達(dá)(<0.05)。Wnt7b表達(dá)量在20、25 d不顯著。Wnt16基因20、30和90d表達(dá)水平相似,在60 d表達(dá)量較低,25 d相對于60 d顯著表達(dá)。其中Wnt2與Wnt7b表達(dá)變化趨勢與胎兒TET1基因的變化(圖2)有相似性,與胎兒生長發(fā)育變化也具有一致性。

    * P<0.05

    A: Wnt2; B: Wnt2b; C: Wnt4; D: Wnt5a; E: Wnt5b; F: Wnt7b; G: Wnt16. * P<0.05

    2.4 DKK家族基因的相對表達(dá)

    DKK家族基因RT-PCR檢測結(jié)果表明,胎兒發(fā)育早期階段DKK1都有表達(dá)(圖4),表達(dá)量變化由升高到降低,但都不具有顯著性(>0.05);DKK2在妊娠30和90 d胎兒中表達(dá)量顯著高(<0.05);DKK3在妊娠60 d胎兒中表達(dá)顯著高(<0.05),25 d時(shí)表達(dá)量低??梢钥闯?,DKK2與DKK3在胎兒發(fā)育早期階段(20、25、30 d)的表達(dá)具有同步性。通過與Wnt家族基因表達(dá)變化對比發(fā)現(xiàn),DKK1表達(dá)變化趨勢與Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt16其有一致性,而與Wnt4的變化呈現(xiàn)相反趨勢。DKK3與Wnt7b表達(dá)變化趨勢具有一致性。

    2.5 TET1、Wnt家族基因在胎兒不同組織中的表達(dá)

    妊娠60、90 d胎兒各組織TET1均檢測到了表達(dá)。60 d胎兒組織中TET1基因表達(dá)較低,在肺中幾乎不表達(dá)。與60 d表達(dá)相比較,在90d胎兒中,TET1在肝、肺、腎和腦中的表達(dá)變化升高,肝中表達(dá)量顯著(<0.05、圖5-A)。

    * P<0.05

    通過單因素ANOVA同一組織中WNT基因的表達(dá)分析(圖5-B和圖5-C),可以看出,Wnt2基因在組織器官中有相對較高的表達(dá)量,表達(dá)活躍,與其他WNT家族基因相比,差異顯著(<0.05),其中妊娠90d胎兒肺中表達(dá)量極顯著(<0.01);Wnt2b,Wnt4,Wnt5b在各組織中表達(dá)較低;Wnt16基因在妊娠60、90 d胎兒皮膚組織中表達(dá)顯著(<0.05),維持在一個(gè)較高的水平;Wnt5a在60 d胎兒腦、腎和皮膚組織中表達(dá)顯著(<0.05),在90 d胎兒腎組織中表達(dá)顯著;Wnt7b在妊娠60d胎兒腎、腦和皮膚組織中有顯著表達(dá)(<0.05),但發(fā)育生長到90d胎兒各組織中,Wnt7b表達(dá)較低,不具有顯著性。

    A: TET1; B: WNT family on 60 days; C: WNT family on 90days. * P<0.05

    2.6 相關(guān)性分析

    2.6.1 生長指標(biāo)與基因 由表2可見,胎兒生長指標(biāo)(體重、體長)變化與TET1的表達(dá)呈極顯著正相關(guān)(<0.01);體長變化與DKK1呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與Wnt2呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(<0.05),與Wnt5b呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)。Wnt7b與體重變化呈現(xiàn)顯著正相關(guān),而Wnt5b呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。

    表2 山羊早期胎兒生長指標(biāo)和基因之間的相關(guān)性

    同行數(shù)據(jù)無*表示差異不顯著(>0.05),肩標(biāo)*表示差異顯著(<0.05),**表示差異極顯著(<0.01)。下同

    In the same row, values with no * superscripts mean no significant difference (>0.05), while with * mean significant difference (<0.05),** mean highly significant difference(<0.01). The same as below

    2.6.2 基因與基因 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TET1在胎兒發(fā)育早期的表達(dá)與Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈現(xiàn)正相關(guān),與Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),其中與Wnt5b呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05),與Wnt7b呈極顯著正相關(guān)(<0.01),TET1與山羊胎兒發(fā)育早期調(diào)控相關(guān)的WNT基因有一定聯(lián)系性和相關(guān)性的。WNT通路相關(guān)拮抗物DKK家族的表達(dá)同樣具有一定的聯(lián)系,DKK3與Wnt4、Wnt16呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)。除此之外,通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),WNT通路中的各因子之間也有一定的關(guān)聯(lián)性,通路基因之間有一定的互作性。Wnt2與Wnt4呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)。Wnt2與Wnt7b,Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a與Wnt5b呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。Wnt4與Wnt5a呈顯著正相關(guān)(<0.05,表3)。

    表3 TET1與WNT通路基因以及DKK家族基因之間的相關(guān)性分析

    3 討論

    TET1屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族成員,可催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)的反應(yīng),是參與主動去甲基化過程(5mC→ 5hmC→5fC→5caC→C)的主要作用酶之一[28]。最近研究發(fā)現(xiàn)TET家族酶催化5mC形成5hmC已經(jīng)成為哺乳動物發(fā)育中一個(gè)重要的表觀遺傳修飾,5hmC作為去甲基化的中間產(chǎn)物,是一種重要表觀遺傳標(biāo)記?;蚪M甲基化修飾有利于胚胎干細(xì)胞的自我更新分化形成胚胎,進(jìn)一步分化發(fā)育為胎兒各組織器官及胎盤[29]。CAO等[30]的研究顯示在豬體內(nèi)外,核移植胚胎發(fā)育早期細(xì)胞階段中表現(xiàn)5mC向5hmC的轉(zhuǎn)化,TET1參在此過程起主要作用,說明其通過甲基化參與過程調(diào)控早期胚胎發(fā)育。TET蛋白可能是對某些細(xì)胞內(nèi)的通路進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)果,實(shí)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育調(diào)控作用[6]。目前在山羊胎兒發(fā)育中的研究較少,其具體的分子調(diào)控尚不清楚。

    本研究結(jié)果顯示:伴隨胎兒的生長發(fā)育,TET1表達(dá)量逐漸增加,而且與胎兒生長(體重、體長)是極顯著正相關(guān)的,說明TET1基因可能調(diào)控山羊胎兒早期的生長發(fā)育。在妊娠90 d時(shí),TET1組織表達(dá)量最高,在此階段,由于前期TET1表達(dá)量積累以及顯著高表達(dá),增加了組織中TET蛋白維持基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào)性,促進(jìn)了胎兒的組織器官細(xì)胞大量分化[6]。KIM等[5]的研究也表明TET1在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠早期神經(jīng)發(fā)生形成中具有調(diào)節(jié)作用。從TET1組織的表達(dá)可以證實(shí)這一點(diǎn),在妊娠90d階段,胎兒的組織器官細(xì)胞大量分化,所以TET1在這一時(shí)段表達(dá)增加,發(fā)揮重要的組織形成調(diào)控作用。在本試驗(yàn)中,還檢測到TET1在山羊胎兒肝組織中的表達(dá)顯著,肝臟是機(jī)體血糖代謝的重要組織器官,在機(jī)體中具有高的活性,在形成的過程中可能存在相應(yīng)的去甲基化介導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)。

    目前關(guān)于Wnt基因的研究多采用小鼠模型。動物發(fā)育的研究領(lǐng)域也多在小鼠胚胎、胎盤[17, 31]、綿羊胎兒胎盤[4]。在山羊,尤其是胎兒早期發(fā)育中鮮有研究。Wnt信號通路是哺乳動物中普遍存在的一條信號通路,Wnt蛋白家族是一類保守性較高的信號分子,在脊椎動物中共有19個(gè)成員,它們通過細(xì)胞跨膜受體FZD以及LRP5/6 co-receptors實(shí)現(xiàn)信號傳遞[15],參與胚胎的生長,形態(tài)發(fā)育、組織的穩(wěn)定、能量代謝的平衡以及干細(xì)胞的維持等多種生物學(xué)發(fā)育過程[32]。本研究檢測了7種Wnt家族基因(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)在山羊胎兒發(fā)育早期的變化情況,值得關(guān)注的是,Wnt2b、Wnt5a和Wnt5b只在胎兒發(fā)育30d階段顯著高表達(dá),說明它們在妊娠30d這個(gè)階段有相似的調(diào)控作用,關(guān)于山羊胎兒這一階段的研究未見報(bào)道。QUINN等[33]在綿羊25,30d等階段研究表明有多種胎盤血管形成因子?;蛳嚓P(guān)分析顯示,Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b具有極顯著的正相關(guān),在后期的組織表達(dá)的檢測(Fig.5)中,Wnt2b和Wnt5b表達(dá)水平很低,在早期發(fā)育的后面階段,調(diào)控作用較小??梢酝茰y,Wnt2b與Wnt5b對山羊早期胎兒的發(fā)育調(diào)控中可能是一種協(xié)同關(guān)系。此外,Wnt2基因在筆者所鑒定胎兒組織中都呈現(xiàn)顯著性表達(dá),Wnt2對多種組織器官的發(fā)育形成是不可或缺的[34],對肝和肺的形成具有很重要作用,其表達(dá)變化模式也是維持增長的趨勢。所以,Wnt2可能是Wnt家族中調(diào)控山羊早期胎兒發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因子,作為候選分子,值得后續(xù)的深入研究。

    Wnt通路相關(guān)基因與組織的發(fā)育是緊密關(guān)聯(lián)的, CAPRIOLI等[35]報(bào)道的Wnt4基因?qū)π∈髿夤芎头蔚陌l(fā)育中都是必須的,尤其是在氣管及支氣管的發(fā)育,此外,很多Wnt基因被證實(shí)與肺的發(fā)育有關(guān),這些基因的缺陷會導(dǎo)致肺的發(fā)育不全,包括Wnt7b[36],Wnt5a[37],Wnt2/2b[38]等。本試驗(yàn)中,只有Wnt2在山羊胎兒肺組織中表達(dá)顯著,其他基因表達(dá)較少,可能是存在試驗(yàn)誤差或者山羊胎兒肺的發(fā)育與這些基因的關(guān)系較小。PIETIL?在研究中提出,DKK1控制Wnt7b在腎乳頭中的水平來調(diào)控腎臟的發(fā)育[39],相關(guān)分析也顯示,這兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Wnt家族編碼的其他基因也關(guān)系到腎臟的發(fā)育和形成,包括Wnt4、Wnt7b、Wnt2b、Wnt11等[40],本試驗(yàn)中檢測到Wnt7b在胎兒腎中有顯著表達(dá),這與以上研究相符合,但其他基因并沒有突出表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt5a在腎臟中也有顯著表達(dá),目前研究未見到報(bào)道,說明Wnt5a對山羊胎兒腎臟形成具有很重要作用,而且Wnt5a在大腦和心臟中表達(dá)較高,也參與這些器官的形成和發(fā)育。TEH等[41]證明Wnt16的兩種亞型在成人不同組織中表達(dá),而且Wnt16能活躍角化細(xì)胞的增殖。在此試驗(yàn)中,Wnt16基因僅在胎兒皮膚組織中顯著表達(dá),說明對山羊皮膚上皮組織的形成有突出作用。

    TET1蛋白對Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)其拮抗物DKK家族(DKK1/2/3),對各種疾病或者正常組織的發(fā)生產(chǎn)生作用。有研究表明,TET1蛋白通過降低DKK1/2/3[21]或者Sfrp4[22]等基因甲基化程度,調(diào)節(jié)DKK基因表達(dá),抑制Wnt信號通路表達(dá),從而抑制各種疾病產(chǎn)生或促進(jìn)正常組織的生長發(fā)育。本試驗(yàn)通過檢測不同組織TET1和Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)量,并且進(jìn)行了基因間表達(dá)量相關(guān)性分析。結(jié)果表明TET1與Wnt通路部分基因之間存在顯著的相關(guān)性,可作為篩選與山羊胎兒早期發(fā)育相關(guān)候選基因的理論依據(jù)。而對于TET1、Wnt基因家族和通路相關(guān)基因在胎兒早期發(fā)育中的功能需要進(jìn)一步深入研究,TET1與Wnt信號通路的對應(yīng)調(diào)節(jié)作用還需要分子生物學(xué)功能驗(yàn)證。胎兒早期進(jìn)行調(diào)控及其生理分子機(jī)制則需要進(jìn)一步研究闡明。

    4 結(jié)論

    明確了山羊胎兒發(fā)育早期不同組織TET1與Wnt家族基因及其通路相關(guān)基因表達(dá)變化,補(bǔ)充了山羊上這一領(lǐng)域研究空白。相關(guān)性分析揭示了基因之間的相互關(guān)系,可作為篩選與山羊胎兒早期發(fā)育相關(guān)候選基因的理論依據(jù)。

    References

    [1] ITO S, D'ALESSIO A C, TARANOVA O V, HONG K, SOWERS L CZHANG Y. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification2010, 466(7310):1129-1151.

    [2] TAHILIANI M, KOH K P, SHEN Y H, PASTOR W A, BANDUKWALA H, BRUDNO Y, AGARWAL S, IYER L M, LIU D R, ARAVIND LRAO A. Conversion of 5-Methylcytosine to 5- Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET12009, 324(5929):930-935.

    [3] FRAUER C, ROTTACH A, MEILINGER D, BULTMANN S, FELLINGER K, HASENODER S, WANG M X, QIN W H, SODING J, SPADA FLEONHARDT H. Different binding properties and function of CXXC zinc finger domains in dnmt1 and tet12011, 6(2): e166217.

    [4] HAYASHI K, BURGHARDT R C, BAZER F WSPENCER T E. WNTs in the ovine uterus: Potential regulation of periimplantation ovine conceptus development2007, 148(7): 3496-3506.

    [5] KIM H, JANG W Y, KANG M C, JEONG J, CHOI M, SUNG Y, PARK S, KWON W, JANG S, KIM M O, KIM S HRYOO Z Y. TET1 contributes to neurogenesis onset time during fetal brain development in mice2016, 471(4):437-443.

    [6] KANG J, LIENHARDA M, PASTOR W A, CHAWLA A, NOVOTNY M, TSAGARATOU A, LASKEN R S, THOMPSON E C, SURANI M A, KORALOV S B, KALANTRY S, CHAVEZ LRAO A. Simultaneous deletion of the methylcytosine oxidases Tet1 and Tet3 increases transcriptome variability in early embryogenesis2015, 112(31):E4236-E4245.

    [7] YAMAGUCHI S, SHEN L, LIU Y T, SENDLER DZHANG Y. Role of Tet1 in erasure of genomic imprinting2013, 504(7480): 460-464.

    [8] NUSSE RVARMUS H E. Many tumors induced by the mouse mammary-tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome1982, 31(1):99-109.

    [9] DAS A, TANIGAWA S, KARNER C M, XIN M, LUM L, CHEN C, OLSON E N, PERANTONI A OCARROLL T J. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation2013, 15(9):1035.

    [10] DASGUPTA RFUCHS E. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation1999, 126(20):4557-4568.

    [11] GRIGORYAN T, WEND P, KLAUS ABIRCHMEIER W. Deciphering the function of canonical Wnt signals in development and disease: conditional loss- and gain-of-function mutations of beta-catenin in mice2008, 22(17):2308-2341.

    [12] KIM B M, BUCHNER G, MILETICH I, SHARPE P TSHIVDASANI R A. The stomach mesenchymal transcription factor Barx1 specifies gastric epithelial identity through inhibition of transient Wnt signaling2005, 8(4):611-622.

    [13] PINTO D, GREGORIEFF A, BEGTHEL HCLEVERS H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium2003, 17(14):1709-1713.

    [14] KEMP C, WILLEMS E, ABDO S, LAMBIV LLEYNS L. Expression of all Wnt genes and their secreted antagonists during mouse blastocyst and postimplantation development2005, 233(3):1064-1075.

    [15] SONDEREGGER S, POLLHEIMER JKNOFLER M. Wnt Signalling in Implantation, Decidualisation and Placental Differentiation - Review2010, 31(10):839-847.

    [16] LU W G, TU Z W, WANG S M, LU J H, WANG Q, WANG W X, WANG B Y, WANG H B, NI H MGUO Y. Spatiotemporal expression of Wnt signaling pathway components during bovine placental development2013, 80(8):893-902.

    [17] MARIKAWA Y. Wnt/beta-catenin signaling and body plan formation in mouse embryos2006, 17(2):175-184.

    [18] NIEHRS C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators2006, 25(57):7469-7481.

    [19] LIEVEN O, KNOBLOCH JRUTHER U.The regulation of Dkk1 expression during embryonic development2010, 340(2):256-268.

    [20] FOSSAT N, JONES V, KHOO P L, BOGANI D, HARDY A, STEINER K, MUKHOPADHYAY M, WESTPHAL H, NOLAN P M, ARKELL RTAM P P L. Stringent requirement of a proper level of canonical WNT signalling activity for head formation in mouse embryo2011, 138(4):667-676.

    [21] NERI F, DETTORI D, INCARNATO D, KREPELOVA A, RAPELLI S, MALDOTTI M, PARLATO C, PALIOGIANNIS POLIVIERO S. TET1 is a tumour suppressor that inhibits colon cancer growth by derepressing inhibitors of the WNT pathway2015, 34(32):4168-4176.

    [22] LI X, YUE X J, PASTOR W A, LIN L Z, GEORGES R, CHAVEZ L, EVANS S MRAO A. Tet proteins influence the balance between neuroectodermal and mesodermal fate choice by inhibiting Wnt signaling2016, 113(51):E8267-E8276.

    [23] ISHIKAWA T, TAMAI Y, ZORN A M, YOSHIDA H, SELDIN M F, NISHIKAWA STAKETO M M. Mouse Wnt receptor gene Fzd5 is essential for yolk sac and placental angiogenesis2001, 128(1):25-33.

    [24] PARR B A, CORNISH V A, CYBULSKY M IMCMAHON A P. Wnt7b regulates placental development in mice2001, 237(2):324-332.

    [25] NUSSE R.Wnt signaling in disease and in development2005. 15(1):28-32.

    [26] ATLI M O, GUZELOGLU ADINC D A. Expression of wingless type (WNT) genes and their antagonists at mRNA levels in equine endometrium during the estrous cycle and early pregnancy2011, 125(1-4):94-102.

    [27] PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR2001, 29(9):e45.

    [28] WU H, ZHANG Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions2014, 156(1-2):45-68.

    [29] MEISSNER A, MIKKELSEN T S, GU H C, WERNIG M, HANNA J, SIVACHENKO A, ZHANG X L, BERNSTEIN B E, NUSBAUM C, JAFFE D B, GNIRKE A, JAENISCH RLANDER E S. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells2008, 454(7205):766-791.

    [30] CAO Z B, ZHOU N R, ZHANG Y, ZHANG Y L, WU R H, LI Y S, ZHANG Y HLI N. Dynamic reprogramming of 5-hydroxymethylcytosine during early porcine embryogenesis2014, 81(3): 496-508.

    [31] MOHAMED O A, DUFORT DCLARKE H J. Expression and estradiol regulation of Wnt genes in the mouse blastocyst identify a candidate pathway for embryo-maternal signaling at implantation2004, 71(2):417-424.

    [32] REYA TCLEVERS H. Wnt signalling in stem cells and cancer2005, 434(7035):843-850.

    [33] QUINN K E, ASHLEY A K, REYNOLDS L P, GRAZUL-BILSKA A TASHLEY R L. Activation of the CXCL12/CXCR4 signaling axis may drive vascularization of the ovine placenta2014, 47:11-21.

    [34] POULAIN MOBER E A. Interplay between Wnt2 and Wnt2bb controls multiple steps of early foregut-derived organ development2011, 138(16):3557-3568.

    [35] CAPRIOLI A, VILLASENOR A, WYLIE L A, BRAITSCH C, MARTY-SANTOS L, BARRY D, KARNER C M, FU S, MEADOWS S M, CARROLL T JCLEAVER O. Wnt4 is essential to normal mammalian lung development2015, 406(2): 222-234.

    [36] RAJAGOPAL J, CARROLL T J, GUSEH J S, BORES S A, BLANK L J, ANDERSON W J, YU J, ZHOU Q, MCMAHON A PMELTON D A. Wnt7b stimulates embryonic lung growth by coordinately increasing the replication of epithelium and mesenchyme2008, 135(9):1625-1634.

    [37] LI C G, XIAO J, HORMI K, BOROK ZMINOO P. Wnt5a participates in distal lung morphogenesis2002, 248(1): 68-81.

    [38] GOSS A M, TIAN Y, TSUKIYAMA T, COHEN E D, ZHOU D, LU M M, YAMAGUCHI T PMORRISEY E E. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut2009, 17(2):290-298.

    [39] PIETILA I, ELLWANGER K, RAILO A, JOKELA T, BARRANTES I D, SHAN J D, NIEHRS CVAINIO S J. Secreted Wnt antagonist Dickkopf-1 controls kidney papilla development coordinated by Wnt-7b signalling2011, 353(1):50-60.

    [40] MERKEL C E, KARNER C MCARROLL T J. Molecular regulation of kidney development: is the answer blowing in the Wnt?2007, 22(11):1825-1838.

    [41] TEH M T, BLAYDON D, GHALI L R, BRIGGS V, EDMUNDS S, PANTAZI E, BARNES M R, LEIGH I M, KELSELL D PPHILPOTT M P. Role for WNT16B in human epidermal keratinocyte proliferation and differentiation .2007, 120(Ptz):330-339.

    (責(zé)任編輯 林鑒非)

    Expression Patterns and Correlation of Wnts and TET1 Genes in Early Fetal Tissues of Dazu Black Goat

    TAN Qiang, LUO NanJian, ZHANG YanLi, AN BingXing,CHEN QiuYang, ZHAO YongJu

    (College of Animal Science and Technology, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Forage&Herbivore/Chongqing Engineering Research Center for Herbivores Resource Protection and Utilization, Chongqing 400715)

    【Objective】The aim of the research was to quantitate the relative expression level of TET1, Wnt and DKK genes during early fetus development in goat, analyze the correlation between TET1 and Wnts genes in further. 【Method】Twelve healthy Dazu black goats copulated with the same ram by wild pairing while these goats with spontaneous estrus. Caesarean section was used to obtain fetus that pregnancy on days 20, 25, 30, 60 and 90, respectively, the growth indexes of the fetus (fetal weight, fetal length) were tested, and the tissue samples of 60d and 90d (fetal heart, liver, lung, kidney, brain and skin) were collected. Real-time (RT-PCR) was used to detect the relative expression level of TET1 gene, DKK family genes (DKK1, DKK2, DKK3) and Wnt family genes (Wnt2, Wnt2b, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt7b, Wnt16). SPSS software was used to analyze the correlation between TET1 and Wnt signaling pathway genes (<0.05) at different stages of fetal development. 【Result】According to the statistics, there were significant changes in fetal development in early pregnancy after 60d. The results showed that the expression of TET1 gene increased with the development of gestational days. All Wnt family genes were detected in the fetus (Wnt2, -2b, -4, -5a, -5b, -7b, -16). Among these changes of fetal development, Wnt2 and Wnt7b expression increase with fetal development gradually; Wnt2b, Wnt5a, Wnt5b, and Wnt7b genes has a significant highly expression on pregnancy 30d (<0.05); the expression of Wnt4 was significantly in fetus on pregnancy 20d (<0.05); Wnt16 gene was significantly in fetus on pregnancy 25d (<0.05). The expression level of DKK family genes showed that DKK1 was detected in the early pregnancy of fetal development, and DKK2/3 performed a low expression level in the early pregnancy, whereas increased in later stage. The expression level of TET1 in liver, lung, kidney and brain in 90d fetus was higher than 60d fetal tissue, there was a significantly expression in liver (<0.05). Interestingly, Wnt2 had a highly significant expression level in all tissues of fetus on pregnancy 60 and 90d, especially in lung (<0.01); Wnt16 had a highly expression in fetal skin (<0.05); Wnt5a and Wnt7b had a significantly expression level in kidney (<0.05), other Wnt genes of Wnt family were detected in fetal tissues as well. Correlation analysis showed that the fetal growth indexes (fetal weight, body length) were positively correlated to changes in the expression of TET1 (<0.01); TET1 in early fetal development and the expression of Wnt2, Wnt7b and Wnt16 gene showed a positive correlation, and negatively correlated with Wnt2b, Wnt4, Wnt5a and Wnt5b, which was negatively correlated with Wnt5b (<0.05), and significantly and positively correlated with Wnt7b (<0.01). There was also a correlation between Wnt pathway genes, Wnt2 and Wnt4 showed a significant negative correlation (<0.01). Wnt2 and Wnt7b, Wnt2b and Wnt5a, Wnt5b, Wnt5a and Wnt5b showed a significant positive correlation (<0.01). Wnt4 was positively correlated with Wnt5a (<0.05). 【Conclusion】The dynamic expression patterns of TET1 and Wnt genes in early fetal development of goat, and correlation of these genes were obtained from this study which fill the blank of those genes in this research field. The article revealed TET1 and Wnts regulate the embryonic development and the formation of tissues by a dynamic pattern. TET1appeared a positively correlation with some Wnt genes while negatively with others. It is also showed interactive in Wnt signaling pathway genes. The data obtained from the research will provide a reference for molecular mechanism research of TET1 and Wnts.

    goat fetus; TET1; Wnt signaling pathway; expression pattern; correlation

    2016-09-01;接受日期:2017-05-22

    國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510635013)、重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目(CXTDG201602004)、中央高?;緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(XDJK2017A003)、重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(cstc2016shmszx80064)

    譚強(qiáng),Tel:18883394145;E-mail:tq19952010@126.com。羅南劍,Tel:13996488708;E-mail:luonanjian28@sina.cn。譚強(qiáng)和羅南劍為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者趙永聚,Tel:023-68251255;E-mail:zyongju@163.com

    猜你喜歡
    負(fù)相關(guān)山羊胚胎
    N-末端腦鈉肽前體與糖尿病及糖尿病相關(guān)并發(fā)癥呈負(fù)相關(guān)
    夏季如何讓山羊增膘
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    山羊受騙
    聰明的山羊
    更 正
    翻譯心理與文本質(zhì)量的相關(guān)性探析
    考試周刊(2016年63期)2016-08-15 14:33:26
    技術(shù)應(yīng)用型本科院校非英語專業(yè)本科生英語學(xué)習(xí)焦慮的調(diào)查與研究
    科技視界(2016年1期)2016-03-30 14:08:41
    DiI 在已固定人胚胎周圍神經(jīng)的示蹤研究
    亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产野战对白在线观看| 哪里可以看免费的av片| 午夜福利高清视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级毛片高清免费大全| 免费看日本二区| 久久久久国内视频| 亚洲美女视频黄频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲av五月六月丁香网| 中文字幕久久专区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 91av网站免费观看| 亚洲中文av在线| 亚洲美女黄片视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 日日夜夜操网爽| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| cao死你这个sao货| 床上黄色一级片| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲av美国av| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产伦在线观看视频一区| 丁香六月欧美| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美黑人巨大hd| 麻豆国产97在线/欧美| 无遮挡黄片免费观看| 男女午夜视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| av国产免费在线观看| 日韩国内少妇激情av| 色尼玛亚洲综合影院| 久9热在线精品视频| 在线观看午夜福利视频| 黄频高清免费视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av成人精品一区久久| 国产v大片淫在线免费观看| 女警被强在线播放| 精品久久久久久久末码| 亚洲国产欧美人成| 一区福利在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产欧美日韩精品一区二区| 成人18禁在线播放| 国产v大片淫在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 听说在线观看完整版免费高清| 色吧在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 身体一侧抽搐| 久久热在线av| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 精品一区二区三区视频在线 | aaaaa片日本免费| 国产真人三级小视频在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 一区福利在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品福利观看| 午夜激情福利司机影院| 午夜免费成人在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩欧美免费精品| 日韩精品青青久久久久久| 午夜成年电影在线免费观看| 99国产综合亚洲精品| 久久亚洲精品不卡| 色av中文字幕| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品女同一区二区软件 | 日本成人三级电影网站| 真人做人爱边吃奶动态| 九色国产91popny在线| 日本在线视频免费播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看午夜福利视频| 极品教师在线免费播放| 男女下面进入的视频免费午夜| 成人国产一区最新在线观看| 精品国产亚洲在线| 国产午夜福利久久久久久| h日本视频在线播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 九色国产91popny在线| 欧美大码av| 国产av一区在线观看免费| 亚洲avbb在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| aaaaa片日本免费| bbb黄色大片| av女优亚洲男人天堂 | 免费看光身美女| 91在线观看av| 可以在线观看毛片的网站| 校园春色视频在线观看| 色视频www国产| 国产亚洲精品久久久com| 色播亚洲综合网| 日本免费a在线| 18禁美女被吸乳视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 91av网站免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 日本免费a在线| 欧美在线一区亚洲| 亚洲七黄色美女视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产成人精品无人区| 亚洲五月天丁香| 国产高清有码在线观看视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久久久久黄片| 婷婷六月久久综合丁香| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 最新美女视频免费是黄的| 中亚洲国语对白在线视频| 在线免费观看的www视频| 999精品在线视频| 一级毛片精品| 热99re8久久精品国产| 国产一区二区激情短视频| 日本五十路高清| 亚洲av成人一区二区三| 男插女下体视频免费在线播放| 在线免费观看的www视频| 免费在线观看影片大全网站| 免费在线观看日本一区| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩欧美免费精品| 亚洲18禁久久av| 亚洲国产精品999在线| 国产三级在线视频| 搡老岳熟女国产| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品人妻1区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品电影一区二区在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 久久人人精品亚洲av| 午夜免费成人在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲国产看品久久| 一区福利在线观看| 丰满的人妻完整版| 99热6这里只有精品| 亚洲五月天丁香| 国产精品久久视频播放| 午夜免费激情av| 毛片女人毛片| 黄色片一级片一级黄色片| av片东京热男人的天堂| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲欧美精品综合久久99| 性欧美人与动物交配| 色av中文字幕| 伦理电影免费视频| 级片在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 怎么达到女性高潮| 美女被艹到高潮喷水动态| 波多野结衣巨乳人妻| 波多野结衣巨乳人妻| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产亚洲精品av在线| 怎么达到女性高潮| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 又紧又爽又黄一区二区| 国产av在哪里看| 久久久久久九九精品二区国产| 我的老师免费观看完整版| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 十八禁人妻一区二区| www.熟女人妻精品国产| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 淫秽高清视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 久9热在线精品视频| bbb黄色大片| www国产在线视频色| 午夜成年电影在线免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产激情偷乱视频一区二区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产乱人伦免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 天堂动漫精品| 国产精品久久视频播放| 老司机福利观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲成人久久性| 精品国产三级普通话版| 变态另类丝袜制服| 成人午夜高清在线视频| 欧美3d第一页| 99久久99久久久精品蜜桃| 黄色日韩在线| 日本五十路高清| 97超视频在线观看视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久久九九精品影院| 免费观看的影片在线观看| 美女高潮的动态| 精品久久久久久久久久免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 麻豆久久精品国产亚洲av| 搡老岳熟女国产| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产69精品久久久久777片 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品乱码一区二三区的特点| 18禁观看日本| 成人特级av手机在线观看| 久久久国产成人免费| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美最黄视频在线播放免费| 99国产精品一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产看品久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品av久久久久免费| 中国美女看黄片| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲avbb在线观看| 99热这里只有是精品50| 成人精品一区二区免费| 亚洲最大成人中文| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av免费在线观看| 岛国在线免费视频观看| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品一区二区免费欧美| 在线观看66精品国产| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久久九九精品影院| 91麻豆av在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲国产精品999在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 嫩草影院精品99| 在线观看日韩欧美| 色av中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 免费在线观看成人毛片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区在线观看成人免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日本一本二区三区精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美丝袜亚洲另类 | 成熟少妇高潮喷水视频| 国产免费男女视频| 91av网一区二区| 舔av片在线| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲av片天天在线观看| 男人舔奶头视频| 十八禁网站免费在线| 久久精品91无色码中文字幕| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲一区二区三区不卡视频| 嫩草影视91久久| 国产三级黄色录像| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久人妻av系列| 91九色精品人成在线观看| h日本视频在线播放| 又粗又爽又猛毛片免费看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | а√天堂www在线а√下载| 久久九九热精品免费| 狂野欧美激情性xxxx| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜a级毛片| 午夜福利免费观看在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费在线观看亚洲国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本黄色片子视频| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av成人一区二区三| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产亚洲精品av在线| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜影院日韩av| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲自拍偷在线| 国产av不卡久久| 国产精品久久视频播放| 国产日本99.免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线a可以看的网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 观看美女的网站| 校园春色视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人系列免费观看| 亚洲av电影在线进入| tocl精华| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美不卡视频在线免费观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产欧美人成| 香蕉国产在线看| 伦理电影免费视频| www日本在线高清视频| 午夜福利18| 综合色av麻豆| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 美女被艹到高潮喷水动态| 一区二区三区激情视频| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲中文av在线| 欧美色视频一区免费| 99久久成人亚洲精品观看| www日本在线高清视频| 国产99白浆流出| 亚洲国产精品999在线| 国产不卡一卡二| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲av熟女| 天堂√8在线中文| 黄频高清免费视频| 在线观看午夜福利视频| 一级作爱视频免费观看| 一进一出抽搐动态| svipshipincom国产片| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品99久久99久久久不卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av在线蜜桃| 手机成人av网站| 免费观看精品视频网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美黑人巨大hd| 午夜福利免费观看在线| 久久亚洲精品不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产视频一区二区在线看| 91麻豆av在线| 级片在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 十八禁网站免费在线| 少妇丰满av| 国产爱豆传媒在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久大精品| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 舔av片在线| 嫩草影院入口| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久国产成人免费| 婷婷丁香在线五月| 中文在线观看免费www的网站| 日日夜夜操网爽| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 大型黄色视频在线免费观看| 一区福利在线观看| 久久香蕉国产精品| 午夜亚洲福利在线播放| 又大又爽又粗| 国产视频内射| 国产高清三级在线| 在线国产一区二区在线| 亚洲av五月六月丁香网| 成人av一区二区三区在线看| 国产高清激情床上av| 成人特级av手机在线观看| cao死你这个sao货| 国产美女午夜福利| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产成人精品久久二区二区免费| 婷婷亚洲欧美| 午夜福利在线在线| 亚洲18禁久久av| 一个人免费在线观看的高清视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中文字幕高清在线视频| 久久精品91蜜桃| 午夜a级毛片| 久久久久久久午夜电影| aaaaa片日本免费| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产一区二区在线观看日韩 | 观看美女的网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产免费男女视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 哪里可以看免费的av片| 成人无遮挡网站| 久久草成人影院| 国产亚洲精品av在线| av在线蜜桃| 宅男免费午夜| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄色日韩在线| 深夜精品福利| 久久久久九九精品影院| 女人被狂操c到高潮| 国产精品野战在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 日本一二三区视频观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 色哟哟哟哟哟哟| 色吧在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 日本一本二区三区精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲自拍偷在线| 亚洲无线在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美日本视频| 悠悠久久av| 99精品欧美一区二区三区四区| 日韩精品中文字幕看吧| 麻豆成人av在线观看| 少妇丰满av| 一夜夜www| 女人被狂操c到高潮| 在线观看66精品国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产黄色小视频在线观看| 久久这里只有精品19| 免费观看精品视频网站| 老汉色∧v一级毛片| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久久久性生活片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 三级国产精品欧美在线观看 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一级a爱片免费观看的视频| 久久亚洲真实| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品国产综合久久久| 久久人人精品亚洲av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩国内少妇激情av| 十八禁网站免费在线| 后天国语完整版免费观看| 99热精品在线国产| 一级a爱片免费观看的视频| 一个人免费在线观看电影 | 狂野欧美激情性xxxx| 全区人妻精品视频| 日韩欧美三级三区| 久久午夜亚洲精品久久| 中文字幕高清在线视频| 波多野结衣高清无吗| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲av熟女| 看免费av毛片| 日韩欧美 国产精品| av欧美777| 欧美日韩一级在线毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 成人精品一区二区免费| 国产爱豆传媒在线观看| 国产一区二区激情短视频| 69av精品久久久久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美黄色淫秽网站| 天堂影院成人在线观看| 丁香六月欧美| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91麻豆精品激情在线观看国产| 床上黄色一级片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费看日本二区| 99热精品在线国产| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产不卡一卡二| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久国产成人免费| 窝窝影院91人妻| 在线a可以看的网站| АⅤ资源中文在线天堂| 黄色视频,在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 免费看光身美女| 国产主播在线观看一区二区| 99国产综合亚洲精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 黑人操中国人逼视频| 成年女人永久免费观看视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| ponron亚洲| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲 国产 在线| 欧美激情在线99| 精品国内亚洲2022精品成人| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 不卡一级毛片| 免费看十八禁软件| 久久久久久久久中文| 亚洲国产精品999在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 特级一级黄色大片| 国产私拍福利视频在线观看| www国产在线视频色| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久中文看片网| 亚洲成人久久爱视频| 日韩国内少妇激情av| 午夜a级毛片| 99久国产av精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲最大成人中文| 免费电影在线观看免费观看| 在线看三级毛片| www日本在线高清视频| 国产私拍福利视频在线观看| 久9热在线精品视频| 成人永久免费在线观看视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人无遮挡网站| 窝窝影院91人妻| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产真实乱freesex| 欧美日韩综合久久久久久 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 草草在线视频免费看| 俺也久久电影网| 色综合婷婷激情| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 老司机福利观看| 一区二区三区高清视频在线| 一本一本综合久久| 91在线观看av| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产激情久久老熟女| 免费在线观看影片大全网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费看日本二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 免费高清视频大片| 51午夜福利影视在线观看| 国产高清激情床上av| 国产精品一及| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩高清专用| 一级毛片女人18水好多| 91av网一区二区| 国产真实乱freesex|