山羊早期胎兒組織TET1與Wnt通路基因的 表達(dá)變化及其相關(guān)性

譚強(qiáng)，羅南劍，張艷麗，安炳星，陳秋羊，趙永聚

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山羊早期胎兒組織TET1與Wnt通路基因的 表達(dá)變化及其相關(guān)性

譚強(qiáng)，羅南劍，張艷麗，安炳星，陳秋羊，趙永聚

（西南大學(xué)動物科技學(xué)院/重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市草食動物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

【目的】通過檢測TET1和Wnt信號通路相關(guān)基因以及DKK家族基因在山羊胎兒發(fā)育早期的表達(dá)變化，分析TET1與Wnt通路基因的相關(guān)性，為TET1調(diào)控山羊胎兒發(fā)育研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取12只健康大足黑山羊母羊，自然發(fā)情后與同一只種公羊自然交配。采用剖腹產(chǎn)手術(shù)的方法，分別獲得妊娠20、25、30、60和90d的胎兒，對胎兒的生長指標(biāo)（體重、體長）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并采集了60和90d胎兒的組織器官樣品（心、肝、肺、腎、腦、皮膚），通過Real-time PCR（RT-PCR）檢測各樣品中TET1基因，DKK家族基因（DKK1、DKK2、DKK3）和Wnt家族基因（Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16）的相對表達(dá)量。利用SPSS軟件分析山羊胎兒發(fā)育早期不同階段TET1與WNT信號通路相關(guān)基因相關(guān)性以及基因表達(dá)顯著性（＜0.05）?！窘Y(jié)果】山羊妊娠早期胎兒生長在60d后有顯著變化。熒光定量檢測結(jié)果表明，TET1基因表達(dá)隨妊娠天數(shù)的增加呈上升趨勢。Wnt家族基因在山羊胎兒發(fā)育中都檢測到表達(dá)（Wnt2，-2b，-4，-5a，-5b，-7b，-16）。其中，Wnt2和Wnt7b表達(dá)量隨胎兒發(fā)育逐漸增高；Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d時(shí)有顯著高表達(dá)(＜0.05)；Wnt4在胎兒發(fā)育20 d時(shí)表達(dá)顯著(＜0.05)；Wnt16基因在妊娠25 d有顯著高表達(dá)(＜0.05)。DKK家族基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，DKK1在胎兒發(fā)育早期階段都有表達(dá)，DKK2/3在妊娠初期表達(dá)量較低，后期表達(dá)增高。通過組織中基因表達(dá)檢測顯示，TET1在90d胎兒肝、肺、腎和腦中的表達(dá)水平相比于60d胎兒組織升高，肝中表達(dá)量顯著（＜0.05）。Wnt家族基因Wnt2在組織器官中有相對活躍的表達(dá)，妊娠90d胎兒肺中表達(dá)量極顯著（＜0.01）；Wnt16基因在胎兒皮膚組織中表達(dá)顯著（＜0.05），且維持在一個(gè)較高的水平；Wnt5a和Wnt7b在腎中表達(dá)顯著（＜0.05），其他Wnt基因在組織中都有表達(dá)。相關(guān)性分析顯示，胎兒生長指標(biāo)（體重、體長）變化與TET1的表達(dá)呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；TET1在胎兒發(fā)育早期的表達(dá)與Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈現(xiàn)正相關(guān)，與Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈負(fù)相關(guān)，其中與Wnt5b呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與Wnt7b呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。Wnt通路基因之間也有相互關(guān)系，Wnt2與Wnt4呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。Wnt2與Wnt7b，Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b，Wnt5a與Wnt5b呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。Wnt4與Wnt5a呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。【結(jié)論】獲得了TET1與Wnt基因在山羊胎兒發(fā)育早期的表達(dá)模式，并進(jìn)行了相關(guān)性分析，填補(bǔ)了這些基因在山羊方面的研究空白；TET1與Wnt基因?qū)ι窖蛱涸缙诘陌l(fā)育和組織的形成是一個(gè)動態(tài)的調(diào)控變化過程；TET1基因表達(dá)與部分Wnt基因呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，部分呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；Wnt通路基因之間表達(dá)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)為TET1與Wnt分子調(diào)控山羊早期胎兒發(fā)育的機(jī)制深入研究提供了參考。

山羊胎兒；TET1；Wnt通路基因；表達(dá)變化；相關(guān)性

0 引言

【研究意義】TET1（Ten-Eleven-Translocation1）是參與主動去甲基化過程的主要作用酶之一[1-2]。其介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)在哺乳動物中普遍存在[3]。Wnt （wingless-type MMTV integration site family）信號通路，關(guān)系到胚胎附植前后的胎兒發(fā)育、胎盤發(fā)生等生理事件[4]。而妊娠早期胚胎發(fā)育對妊娠期間胎兒的發(fā)育及出生后發(fā)育都有影響，因此明確TET1與Wnt基因在山羊胎兒早期發(fā)育的表達(dá)模式，對于優(yōu)質(zhì)羔羊生產(chǎn)研究提供指導(dǎo)作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TET1屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族成員，是一種5mC羥化酶，主要在胎兒組織和干細(xì)胞中表達(dá)，能啟動DNA去甲基化程序，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的發(fā)育[2, 5]。TET1家族蛋白參與整個(gè)胚胎的發(fā)育過程，相關(guān)研究顯示同時(shí)敲除TET家族基因TET1/3后，胚胎早期發(fā)育中轉(zhuǎn)錄組多樣性有所增加[6]，在父系小鼠TET1敲除的后代胎兒出現(xiàn)生長缺陷、死亡率增高、發(fā)育遲緩等現(xiàn)象[7]。Wnt基因由NUSSE等[8]發(fā)現(xiàn)，后來相繼發(fā)現(xiàn)多個(gè)Wnt家族基因。Wnt通路關(guān)系到生物體生長、發(fā)育、疾病和細(xì)胞癌變等過程，并通過細(xì)胞間信號傳遞對許多不同組織器官的形成進(jìn)行調(diào)控，包括腎、腸、骨、皮膚、心臟和肺等[9-13]。其中經(jīng)典Wnt信號通路（Wnt/β- cantenin）廣泛參與維持干細(xì)胞的多功能性，誘導(dǎo)特定組織和器官的生長等生物學(xué)過程，對哺乳動物發(fā)育生長，包括早期胚胎組織器官發(fā)育都有調(diào)控作用，其通路相關(guān)因子也相繼被發(fā)現(xiàn)[14-17]。DKK 作為Wnt信號通路拮抗物，能夠維持 Wnt信號通路的穩(wěn)態(tài)，調(diào)控通路下游基因表達(dá)，在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[18]，其缺失往往導(dǎo)致胚胎生長發(fā)育障礙，出現(xiàn)胎兒發(fā)育不全或致死[19-20]。同時(shí)，在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)TET1通過抑制Wnt通路拮抗基因DKK來維持一個(gè)低甲基化水平，能夠?qū)nt通路在結(jié)直腸癌發(fā)生調(diào)控中具有相互作用[21]。此外，LI等[22]發(fā)現(xiàn)，TET1/2/3缺失的小鼠胚胎（8.0—8.5d）Wnt通路表現(xiàn)超活性，TET1蛋白在小鼠胚胎和ESCs細(xì)胞中對Wnt通路具有關(guān)鍵性調(diào)控，通過建立神經(jīng)細(xì)胞和中胚層細(xì)胞命運(yùn)決定之間的適當(dāng)平衡?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量研究表明，TET1和Wnt基因?qū)ε咛グl(fā)育調(diào)控過程中具有生理和時(shí)空上的一致性，且能夠相互作用調(diào)節(jié)[7, 23-24]，在人[25]、小鼠[17]、牛[16]、綿羊[4]、馬[26]上都有所研究，而山羊上，TET1和Wnt基因在早期胎兒發(fā)育中的表達(dá)模式不清楚，兩者之間相互關(guān)系在山羊中的研究尚為空白。【擬解決的關(guān)鍵問題】以大足黑山羊妊娠早期胎兒為對象，檢測胎兒早期發(fā)育過程中TET1、Wnt通路相關(guān)基因及DKK家族的動態(tài)表達(dá)變化模式。通過相關(guān)分析，探求基因之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究TET1和Wnt通路調(diào)控山羊胎兒發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)、時(shí)間

本試驗(yàn)于2015年10月至2016年7月在西南大學(xué)畜牧場、重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西南大學(xué)動物醫(yī)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動物

選取西南大學(xué)種羊場12只健康的1.5周歲大足黑山羊空懷母羊，與同一只大足黑山羊公羊進(jìn)行自然交配，交配后觀察返情情況，如果沒有，則以最后一次配種日期為妊娠0 d。在妊娠20 d（n=4）、25 d（n=3）、30 d（n=3）、60 d（n=5）、90 d（n=7），剖腹產(chǎn)手術(shù)獲得胎兒，測胎兒體重及體長。采集心、肝、肺、腎、腦、皮膚組織樣品，液氮中保存待用。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

RNA提取采用TIAN GEN生物公司提供的RNAsimple Total RNA Kit，按照說明書提供步驟進(jìn)行操作。提取RNA通過核酸測定儀檢測RNA濃度，合格樣品-80℃保存。

cDNA合成采用TIAN GEN提供FastQuant RT Kit（with gDNase）。根據(jù)說明書步驟操作，cDNA樣品-80℃保存。

1.4 引物合成和PCR分析

Wnt基因、TET1和DKK家族基因引物序列如表1，委托上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.5 Real-time PCR分析

Real-time PCR用于檢測妊娠早期胎兒發(fā)育各組織中基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系包括：Nuclease-Free Water（3.6μL）、上游引物（0.2μL）、下游引物（0.2μL）、GoTaq?qPCR Master Mix（5μL），樣品1μL，構(gòu)成總體積為10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃變性10min，95℃15s，退火復(fù)性1min，40個(gè)PCR循環(huán)，采用默認(rèn)設(shè)置自動生成Ct值。RT-PCR相對定量的內(nèi)參基因選擇在胚胎發(fā)育階段表達(dá)相對較為穩(wěn)定的β-Actin[14]。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

RT-PCR結(jié)果采用Bio-Rad CFX Manager軟件導(dǎo)出為Excel，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理參考Pfaffl2-ΔΔt方法[27]。采用20 d胎兒組織作為參考樣品，計(jì)算ΔCt（ΔCt= Ct參考樣品目的基因- Ct參考樣品內(nèi)參基因），ΔΔCt=（Ct目標(biāo)樣品中目的基因-Ct目標(biāo)樣品內(nèi)參基因）-ΔCt，根據(jù)公式計(jì)算基因相對表達(dá)量。所有試驗(yàn)都設(shè)有3組重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所得組織相對表達(dá)量采用SPSS18.0進(jìn)行差異性分析（LSD法），顯著水平＜0.05；用Bivariate Correlations 估計(jì)基因與胎兒生長指標(biāo)、基因與基因之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 胎兒生長發(fā)育指標(biāo)

剖腹產(chǎn)獲得山羊發(fā)育前期（20、25、30、60和90d）完整胎兒，并對其重量和體長變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，得到胎兒生長變化趨勢（圖1）。從圖1-A、B可以看出，山羊胎兒早期發(fā)育體重在60 d后顯著增加，體長在30 d后顯著增加。

2.2 TET1基因在胎兒發(fā)育早期階段的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明，在胎兒發(fā)育早期階段，TET1基因均有表達(dá)。檢測發(fā)現(xiàn)TET1表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升的趨勢（圖2），與胎兒體重、體長指標(biāo)具有一致性。其中在25 d有突出表達(dá)，但經(jīng)過差異比較，與20 d和30 d表達(dá)量差異不顯著（>0.05），不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。妊娠90 d的胎兒，TET1具有顯著高表達(dá)，表達(dá)量顯著高于20、25、30和60 d表達(dá)量（＜0.05）。

表1 熒光定量基因引物列表

* P＜0.05

2.3 WNT家族基因在胎兒發(fā)育早期階段的表達(dá)

WNT家族基因Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b 、Wnt16在發(fā)育早期胎兒組織中都有表達(dá)。Wnt2和Wnt7b表達(dá)量隨胎兒發(fā)育逐漸增高，在發(fā)育后期表達(dá)量較高，妊娠90 d胎兒中表達(dá)顯著（＜0.05）；Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d胎兒中有顯著高表達(dá)（＜0.05）；Wnt4基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的變化，在妊娠20 d胎兒中表達(dá)顯著（＜0.05）；Wnt16基因在妊娠25 d胎兒中有顯著表達(dá)（＜0.05）。胎兒早期發(fā)育階段，Wnt2與Wnt7b表達(dá)變化相似；Wnt2b表達(dá)量較低；Wnt4在早期階段的表達(dá)較高，而Wnt5a和Wnt5b的表達(dá)量的變化趨勢與Wnt4相反，在妊娠30d胎兒有顯著表達(dá)（＜0.05）。Wnt7b表達(dá)量在20、25 d不顯著。Wnt16基因20、30和90d表達(dá)水平相似，在60 d表達(dá)量較低，25 d相對于60 d顯著表達(dá)。其中Wnt2與Wnt7b表達(dá)變化趨勢與胎兒TET1基因的變化（圖2）有相似性，與胎兒生長發(fā)育變化也具有一致性。

* P＜0.05

A: Wnt2; B: Wnt2b; C: Wnt4; D: Wnt5a; E: Wnt5b; F: Wnt7b; G: Wnt16. * P＜0.05

2.4 DKK家族基因的相對表達(dá)

DKK家族基因RT-PCR檢測結(jié)果表明，胎兒發(fā)育早期階段DKK1都有表達(dá)（圖4），表達(dá)量變化由升高到降低，但都不具有顯著性（>0.05）；DKK2在妊娠30和90 d胎兒中表達(dá)量顯著高（＜0.05）；DKK3在妊娠60 d胎兒中表達(dá)顯著高（＜0.05），25 d時(shí)表達(dá)量低?？梢钥闯?，DKK2與DKK3在胎兒發(fā)育早期階段（20、25、30 d）的表達(dá)具有同步性。通過與Wnt家族基因表達(dá)變化對比發(fā)現(xiàn)，DKK1表達(dá)變化趨勢與Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt16其有一致性，而與Wnt4的變化呈現(xiàn)相反趨勢。DKK3與Wnt7b表達(dá)變化趨勢具有一致性。

2.5 TET1、Wnt家族基因在胎兒不同組織中的表達(dá)

妊娠60、90 d胎兒各組織TET1均檢測到了表達(dá)。60 d胎兒組織中TET1基因表達(dá)較低，在肺中幾乎不表達(dá)。與60 d表達(dá)相比較，在90d胎兒中，TET1在肝、肺、腎和腦中的表達(dá)變化升高，肝中表達(dá)量顯著（＜0.05、圖5-A）。

* P＜0.05

通過單因素ANOVA同一組織中WNT基因的表達(dá)分析（圖5-B和圖5-C），可以看出，Wnt2基因在組織器官中有相對較高的表達(dá)量，表達(dá)活躍，與其他WNT家族基因相比，差異顯著（＜0.05），其中妊娠90d胎兒肺中表達(dá)量極顯著（＜0.01）；Wnt2b，Wnt4，Wnt5b在各組織中表達(dá)較低；Wnt16基因在妊娠60、90 d胎兒皮膚組織中表達(dá)顯著（＜0.05），維持在一個(gè)較高的水平；Wnt5a在60 d胎兒腦、腎和皮膚組織中表達(dá)顯著（＜0.05），在90 d胎兒腎組織中表達(dá)顯著；Wnt7b在妊娠60d胎兒腎、腦和皮膚組織中有顯著表達(dá)（＜0.05），但發(fā)育生長到90d胎兒各組織中，Wnt7b表達(dá)較低，不具有顯著性。

A: TET1; B: WNT family on 60 days; C: WNT family on 90days. * P＜0.05

2.6 相關(guān)性分析

2.6.1 生長指標(biāo)與基因 由表2可見，胎兒生長指標(biāo)（體重、體長）變化與TET1的表達(dá)呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；體長變化與DKK1呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與Wnt2呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（＜0.05），與Wnt5b呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)。Wnt7b與體重變化呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，而Wnt5b呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。

表2 山羊早期胎兒生長指標(biāo)和基因之間的相關(guān)性

同行數(shù)據(jù)無*表示差異不顯著（＞0.05），肩標(biāo)*表示差異顯著（＜0.05），**表示差異極顯著(＜0.01）。下同

In the same row， values with no * superscripts mean no significant difference (＞0.05)， while with * mean significant difference (＜0.05)，** mean highly significant difference(＜0.01）. The same as below

2.6.2 基因與基因 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)TET1在胎兒發(fā)育早期的表達(dá)與Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈現(xiàn)正相關(guān)，與Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中與Wnt5b呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與Wnt7b呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），TET1與山羊胎兒發(fā)育早期調(diào)控相關(guān)的WNT基因有一定聯(lián)系性和相關(guān)性的。WNT通路相關(guān)拮抗物DKK家族的表達(dá)同樣具有一定的聯(lián)系，DKK3與Wnt4、Wnt16呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。除此之外，通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，WNT通路中的各因子之間也有一定的關(guān)聯(lián)性，通路基因之間有一定的互作性。Wnt2與Wnt4呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。Wnt2與Wnt7b，Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b，Wnt5a與Wnt5b呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。Wnt4與Wnt5a呈顯著正相關(guān)（＜0.05，表3）。

表3 TET1與WNT通路基因以及DKK家族基因之間的相關(guān)性分析

3 討論

TET1屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族成員，可催化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC）的反應(yīng)，是參與主動去甲基化過程（5mC→ 5hmC→5fC→5caC→C）的主要作用酶之一[28]。最近研究發(fā)現(xiàn)TET家族酶催化5mC形成5hmC已經(jīng)成為哺乳動物發(fā)育中一個(gè)重要的表觀遺傳修飾，5hmC作為去甲基化的中間產(chǎn)物，是一種重要表觀遺傳標(biāo)記?；蚪M甲基化修飾有利于胚胎干細(xì)胞的自我更新分化形成胚胎，進(jìn)一步分化發(fā)育為胎兒各組織器官及胎盤[29]。CAO等[30]的研究顯示在豬體內(nèi)外，核移植胚胎發(fā)育早期細(xì)胞階段中表現(xiàn)5mC向5hmC的轉(zhuǎn)化，TET1參在此過程起主要作用，說明其通過甲基化參與過程調(diào)控早期胚胎發(fā)育。TET蛋白可能是對某些細(xì)胞內(nèi)的通路進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育調(diào)控作用[6]。目前在山羊胎兒發(fā)育中的研究較少，其具體的分子調(diào)控尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示：伴隨胎兒的生長發(fā)育，TET1表達(dá)量逐漸增加，而且與胎兒生長（體重、體長）是極顯著正相關(guān)的，說明TET1基因可能調(diào)控山羊胎兒早期的生長發(fā)育。在妊娠90 d時(shí)，TET1組織表達(dá)量最高，在此階段，由于前期TET1表達(dá)量積累以及顯著高表達(dá)，增加了組織中TET蛋白維持基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào)性，促進(jìn)了胎兒的組織器官細(xì)胞大量分化[6]。KIM等[5]的研究也表明TET1在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠早期神經(jīng)發(fā)生形成中具有調(diào)節(jié)作用。從TET1組織的表達(dá)可以證實(shí)這一點(diǎn)，在妊娠90d階段，胎兒的組織器官細(xì)胞大量分化，所以TET1在這一時(shí)段表達(dá)增加，發(fā)揮重要的組織形成調(diào)控作用。在本試驗(yàn)中，還檢測到TET1在山羊胎兒肝組織中的表達(dá)顯著，肝臟是機(jī)體血糖代謝的重要組織器官，在機(jī)體中具有高的活性，在形成的過程中可能存在相應(yīng)的去甲基化介導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)。

目前關(guān)于Wnt基因的研究多采用小鼠模型。動物發(fā)育的研究領(lǐng)域也多在小鼠胚胎、胎盤[17, 31]、綿羊胎兒胎盤[4]。在山羊，尤其是胎兒早期發(fā)育中鮮有研究。Wnt信號通路是哺乳動物中普遍存在的一條信號通路，Wnt蛋白家族是一類保守性較高的信號分子，在脊椎動物中共有19個(gè)成員，它們通過細(xì)胞跨膜受體FZD以及LRP5/6 co-receptors實(shí)現(xiàn)信號傳遞[15]，參與胚胎的生長，形態(tài)發(fā)育、組織的穩(wěn)定、能量代謝的平衡以及干細(xì)胞的維持等多種生物學(xué)發(fā)育過程[32]。本研究檢測了7種Wnt家族基因（Wnt2，-2b，-4，-5a，-5b，-7b，-16）在山羊胎兒發(fā)育早期的變化情況，值得關(guān)注的是，Wnt2b、Wnt5a和Wnt5b只在胎兒發(fā)育30d階段顯著高表達(dá)，說明它們在妊娠30d這個(gè)階段有相似的調(diào)控作用，關(guān)于山羊胎兒這一階段的研究未見報(bào)道。QUINN等[33]在綿羊25，30d等階段研究表明有多種胎盤血管形成因子?；蛳嚓P(guān)分析顯示，Wnt2b與Wnt5a、Wnt5b具有極顯著的正相關(guān)，在后期的組織表達(dá)的檢測（Fig.5）中，Wnt2b和Wnt5b表達(dá)水平很低，在早期發(fā)育的后面階段，調(diào)控作用較小?？梢酝茰y，Wnt2b與Wnt5b對山羊早期胎兒的發(fā)育調(diào)控中可能是一種協(xié)同關(guān)系。此外，Wnt2基因在筆者所鑒定胎兒組織中都呈現(xiàn)顯著性表達(dá)，Wnt2對多種組織器官的發(fā)育形成是不可或缺的[34]，對肝和肺的形成具有很重要作用，其表達(dá)變化模式也是維持增長的趨勢。所以，Wnt2可能是Wnt家族中調(diào)控山羊早期胎兒發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵因子，作為候選分子，值得后續(xù)的深入研究。

Wnt通路相關(guān)基因與組織的發(fā)育是緊密關(guān)聯(lián)的， CAPRIOLI等[35]報(bào)道的Wnt4基因?qū)π∈髿夤芎头蔚陌l(fā)育中都是必須的，尤其是在氣管及支氣管的發(fā)育，此外，很多Wnt基因被證實(shí)與肺的發(fā)育有關(guān)，這些基因的缺陷會導(dǎo)致肺的發(fā)育不全，包括Wnt7b[36]，Wnt5a[37]，Wnt2/2b[38]等。本試驗(yàn)中，只有Wnt2在山羊胎兒肺組織中表達(dá)顯著，其他基因表達(dá)較少，可能是存在試驗(yàn)誤差或者山羊胎兒肺的發(fā)育與這些基因的關(guān)系較小。PIETIL?在研究中提出，DKK1控制Wnt7b在腎乳頭中的水平來調(diào)控腎臟的發(fā)育[39]，相關(guān)分析也顯示，這兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。Wnt家族編碼的其他基因也關(guān)系到腎臟的發(fā)育和形成，包括Wnt4、Wnt7b、Wnt2b、Wnt11等[40]，本試驗(yàn)中檢測到Wnt7b在胎兒腎中有顯著表達(dá)，這與以上研究相符合，但其他基因并沒有突出表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt5a在腎臟中也有顯著表達(dá)，目前研究未見到報(bào)道，說明Wnt5a對山羊胎兒腎臟形成具有很重要作用，而且Wnt5a在大腦和心臟中表達(dá)較高，也參與這些器官的形成和發(fā)育。TEH等[41]證明Wnt16的兩種亞型在成人不同組織中表達(dá)，而且Wnt16能活躍角化細(xì)胞的增殖。在此試驗(yàn)中，Wnt16基因僅在胎兒皮膚組織中顯著表達(dá)，說明對山羊皮膚上皮組織的形成有突出作用。

TET1蛋白對Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)其拮抗物DKK家族（DKK1/2/3），對各種疾病或者正常組織的發(fā)生產(chǎn)生作用。有研究表明，TET1蛋白通過降低DKK1/2/3[21]或者Sfrp4[22]等基因甲基化程度，調(diào)節(jié)DKK基因表達(dá)，抑制Wnt信號通路表達(dá)，從而抑制各種疾病產(chǎn)生或促進(jìn)正常組織的生長發(fā)育。本試驗(yàn)通過檢測不同組織TET1和Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)量，并且進(jìn)行了基因間表達(dá)量相關(guān)性分析。結(jié)果表明TET1與Wnt通路部分基因之間存在顯著的相關(guān)性，可作為篩選與山羊胎兒早期發(fā)育相關(guān)候選基因的理論依據(jù)。而對于TET1、Wnt基因家族和通路相關(guān)基因在胎兒早期發(fā)育中的功能需要進(jìn)一步深入研究，TET1與Wnt信號通路的對應(yīng)調(diào)節(jié)作用還需要分子生物學(xué)功能驗(yàn)證。胎兒早期進(jìn)行調(diào)控及其生理分子機(jī)制則需要進(jìn)一步研究闡明。

4 結(jié)論

明確了山羊胎兒發(fā)育早期不同組織TET1與Wnt家族基因及其通路相關(guān)基因表達(dá)變化，補(bǔ)充了山羊上這一領(lǐng)域研究空白。相關(guān)性分析揭示了基因之間的相互關(guān)系，可作為篩選與山羊胎兒早期發(fā)育相關(guān)候選基因的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Expression Patterns and Correlation of Wnts and TET1 Genes in Early Fetal Tissues of Dazu Black Goat

TAN Qiang, LUO NanJian, ZHANG YanLi, AN BingXing，CHEN QiuYang, ZHAO YongJu

(College of Animal Science and Technology, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Forage&Herbivore/Chongqing Engineering Research Center for Herbivores Resource Protection and Utilization, Chongqing 400715)

【Objective】The aim of the research was to quantitate the relative expression level of TET1, Wnt and DKK genes during early fetus development in goat, analyze the correlation between TET1 and Wnts genes in further. 【Method】Twelve healthy Dazu black goats copulated with the same ram by wild pairing while these goats with spontaneous estrus. Caesarean section was used to obtain fetus that pregnancy on days 20, 25, 30, 60 and 90, respectively, the growth indexes of the fetus (fetal weight, fetal length) were tested, and the tissue samples of 60d and 90d (fetal heart, liver, lung, kidney, brain and skin) were collected. Real-time (RT-PCR) was used to detect the relative expression level of TET1 gene, DKK family genes (DKK1, DKK2, DKK3) and Wnt family genes (Wnt2, Wnt2b, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt7b, Wnt16). SPSS software was used to analyze the correlation between TET1 and Wnt signaling pathway genes (＜0.05) at different stages of fetal development. 【Result】According to the statistics, there were significant changes in fetal development in early pregnancy after 60d. The results showed that the expression of TET1 gene increased with the development of gestational days. All Wnt family genes were detected in the fetus (Wnt2, -2b, -4, -5a, -5b, -7b, -16). Among these changes of fetal development, Wnt2 and Wnt7b expression increase with fetal development gradually; Wnt2b, Wnt5a, Wnt5b, and Wnt7b genes has a significant highly expression on pregnancy 30d (＜0.05); the expression of Wnt4 was significantly in fetus on pregnancy 20d (＜0.05); Wnt16 gene was significantly in fetus on pregnancy 25d (＜0.05). The expression level of DKK family genes showed that DKK1 was detected in the early pregnancy of fetal development, and DKK2/3 performed a low expression level in the early pregnancy, whereas increased in later stage. The expression level of TET1 in liver, lung, kidney and brain in 90d fetus was higher than 60d fetal tissue, there was a significantly expression in liver (＜0.05). Interestingly, Wnt2 had a highly significant expression level in all tissues of fetus on pregnancy 60 and 90d, especially in lung (＜0.01); Wnt16 had a highly expression in fetal skin (＜0.05); Wnt5a and Wnt7b had a significantly expression level in kidney (＜0.05), other Wnt genes of Wnt family were detected in fetal tissues as well. Correlation analysis showed that the fetal growth indexes (fetal weight, body length) were positively correlated to changes in the expression of TET1 (＜0.01); TET1 in early fetal development and the expression of Wnt2, Wnt7b and Wnt16 gene showed a positive correlation, and negatively correlated with Wnt2b, Wnt4, Wnt5a and Wnt5b, which was negatively correlated with Wnt5b (＜0.05), and significantly and positively correlated with Wnt7b (＜0.01). There was also a correlation between Wnt pathway genes, Wnt2 and Wnt4 showed a significant negative correlation (＜0.01). Wnt2 and Wnt7b, Wnt2b and Wnt5a, Wnt5b, Wnt5a and Wnt5b showed a significant positive correlation (＜0.01). Wnt4 was positively correlated with Wnt5a (＜0.05). 【Conclusion】The dynamic expression patterns of TET1 and Wnt genes in early fetal development of goat, and correlation of these genes were obtained from this study which fill the blank of those genes in this research field. The article revealed TET1 and Wnts regulate the embryonic development and the formation of tissues by a dynamic pattern. TET1appeared a positively correlation with some Wnt genes while negatively with others. It is also showed interactive in Wnt signaling pathway genes. The data obtained from the research will provide a reference for molecular mechanism research of TET1 and Wnts.

goat fetus; TET1; Wnt signaling pathway; expression pattern; correlation

2016-09-01；接受日期：2017-05-22

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201510635013）、重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXTDG201602004）、中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（XDJK2017A003）、重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目（cstc2016shmszx80064）

譚強(qiáng)，Tel：18883394145；E-mail：tq19952010@126.com。羅南劍，Tel：13996488708；E-mail：luonanjian28@sina.cn。譚強(qiáng)和羅南劍為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者趙永聚，Tel：023-68251255；E-mail：zyongju@163.com