• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    山東省辣椒主要病毒種類的分子檢測與鑒定

    2017-07-31 23:47:33王少立譚瑋萍楊園園代惠潔孫曉輝喬寧竺曉平
    中國農(nóng)業(yè)科學 2017年14期
    關鍵詞:進化樹侵染辣椒

    王少立,譚瑋萍,楊園園,代惠潔,孫曉輝,喬寧 , ,竺曉平

    ?

    山東省辣椒主要病毒種類的分子檢測與鑒定

    王少立1,譚瑋萍1,楊園園1,代惠潔2,孫曉輝1,喬寧1, 2,竺曉平1

    (1山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室,山東泰安 271018;2濰坊科技學院,山東壽光262700)

    【目的】鑒定山東省辣椒上的主要病毒種類,明確該地區(qū)辣椒上的主要病毒病原?!痉椒ā?014—2015年,在山東省臨沂、日照、青島、煙臺、濰坊、淄博、濟寧、菏澤、聊城、德州共10個市(區(qū))采集253份疑似感病的辣椒植株葉片,提取葉片總RNA和總DNA,利用雙生病毒的通用引物(PA/PB)、馬鈴薯卷葉病毒屬通用引物(POL-F/POL-R)及已報道侵染辣椒的主要病毒的檢測引物對樣品進行PCR、RT-PCR分子檢測與鑒定,將擴增得到的目的條帶經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接到pMD18-T載體上,再送至公司進行克隆測序。分別將所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進行檢索,利用DNAStar軟件中的Megalign將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進行同源性比對,利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹,系統(tǒng)進化樹中各分支置信度(Bootstrap)進行1 000次重復分析?!窘Y果】 PMMoV、CMV總檢出率分別為61.66%、60.08%;TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV發(fā)生也比較普遍,檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV發(fā)生侵染現(xiàn)象較少,檢出率分別為11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%;未檢測到CaCV、PSV、ChiRSV、TSWV和ToMMV。通過對病毒復合侵染現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn),病毒復合侵染率高達89.92%,其中3種病毒復合侵染現(xiàn)象最多,所占比例達28.63%,4種病毒復合侵染率為25.00%,2種病毒復合侵染率為21.77%,5種病毒復合侵染率為13.31%,一個辣椒樣品最多可同時感染6種病毒,侵染率為1.21%;對山東省10個地區(qū)的辣椒病毒檢測,結果表明在辣椒上檢出病毒種類最多的為臨沂、濟寧,檢測到12種病毒,其次是煙臺、聊城,檢測到11種病毒,濰坊、菏澤檢測到9種病毒,青島、德州檢測到8種病毒,日照檢測到7種病毒,淄博檢測到6種病毒,日照地區(qū)辣椒病毒復合侵染率最高,為100%,菏澤地區(qū)復合侵染率最低,為69.23%。分別根據(jù)PMMoV的部分基因序列、PeVYV部分、、基因序列以及BWYV部分、基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果表明本研究PMMoV山東分離物SD60與中國貴州分離物的親緣關系最近,PeVYV山東分離物SDRZ31-1與意大利IT83分離物的親緣關系最近,BWYV山東分離物SD與韓國分離物LS的親緣關系最近?!窘Y論】在山東省采集的253份辣椒樣品可被15種病毒侵染,PMMoV、CMV為主要病毒種類;在山東新檢測到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2;明確了山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況以及病毒種類的主次關系。

    辣椒病毒?。焕苯份p斑駁病毒;甜菜西方黃化病毒;甜瓜蚜傳黃化病毒;復合侵染

    0 引言

    【研究意義】辣椒()作為一種重要的蔬菜作物,不僅營養(yǎng)價值高,還是重要的調(diào)味料。近年來,中國辣椒種植面積不斷擴大,年播種面積在150—200萬hm2,占全國蔬菜總播種面積的8%—10%,居蔬菜首位[1]。隨著辣椒種植規(guī)模的逐步擴大,辣椒病毒病也愈發(fā)嚴重,已成為危害辣椒生產(chǎn)中的首要病害,給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失,制約著辣椒產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。山東省是全國6大辣椒主產(chǎn)區(qū)之一,種植規(guī)模逐年擴大,但是辣椒病毒病的發(fā)生也比較普遍,是制約辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。因此,明確山東省辣椒主要病毒種類,對于辣椒病毒病的防控預警具有重要意義。【前人研究進展】國外報道侵染辣椒的病毒達67種[2],而國內(nèi)現(xiàn)已鑒定出侵染辣椒的病毒種類有22種。辣椒能被黃瓜花葉病毒(,CMV)、煙草花葉病毒(,TMV)、辣椒輕斑駁病毒(,PMMoV)、辣椒斑駁病毒(,PepMoV)、辣椒脈斑駁病毒(,PVMV)、蠶豆萎蔫病毒(,BBWV)、馬鈴薯Y病毒(,PVY)、馬鈴薯X病毒(,PVX)、煙草蝕紋病毒(,TEV)、辣椒環(huán)斑病毒(,ChiRSV)、苜?;ㄈ~病毒(,AMV)、煙草脆裂病毒(,TRV)、番茄斑萎病毒(,TSWV)、花生黃斑病毒(,GYSV)、辣椒褪綠病毒(,CaCV)、番茄花葉病毒(,ToMV)、蕪菁花葉病毒(,TuMV)[3-12]、煙草輕型綠花葉病毒(,TMGMV)[13]、辣椒脈斑駁病毒(,ChiVMV)[14-15]等RNA病毒侵染;另外還被番茄黃化曲葉病毒(,TYLCV)、煙草曲莖病毒(,TbCSV)及中國辣椒黃化曲葉病毒(,PYLCCNV)[16-18]等DNA病毒侵染。近幾年發(fā)現(xiàn)侵染辣椒的病毒還有甜菜西方黃化病毒(,BWYV)[19]、番茄褪綠病毒(,ToCV)[20]。山東省作為重要的辣椒產(chǎn)區(qū),辣椒病毒病發(fā)生也比較嚴重,楊超等[21]對侵染山東辣椒的黃瓜花葉病毒進行了研究,結果表明CMV是山東省辣椒病毒病的主要毒源之一;劉春香等[22]對壽光地區(qū)侵染辣椒的TYLCV進行了研究,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的辣椒TYLCV感染率較高。【本研究切入點】山東是蔬菜大省,設施和露地辣椒種植面積較大,辣椒連作導致病毒病暴發(fā),對辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大影響,對辣椒生產(chǎn)的危害日益擴大,目前還缺少對侵染山東地區(qū)辣椒的主要病毒種類全面系統(tǒng)的研究,也沒有山東省辣椒上病毒復合侵染情況的相關報道?!緮M解決的關鍵問題】明確山東辣椒病毒病病原的具體種類和病毒種類的主次關系,以及是否出現(xiàn)新病毒病害,為針對性地預警和防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    試驗于2014—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院完成。

    1.1 材料

    2014—2015年,在山東省的臨沂、日照、青島、煙臺、濰坊、淄博、濟寧、菏澤、聊城、德州等地共采集花葉、畸形、壞死等疑似感染病毒病的辣椒樣品253份,于-20℃冰箱中備用。

    植物RNA提取試劑Trizol、DNA聚合酶、dNTPs及植物總RNA、DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;分子量標準Normal Run 250 bp-Ⅱ DNA ladder由上海捷瑞生物技術有限公司提供;凝膠回收試劑盒由AXYGEN生物技術有限公司提供;反轉錄試劑RNase M-MLV(RNase H-)、Recombinant Rnase Inhibitor由寶生物工程(TaKaRa)有限公司提供;其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

    1.2 總RNA和DNA提取、RT-PCR和PCR

    分別根據(jù)試劑盒說明從辣椒樣品中提取總RNA、DNA。以辣椒感病葉片總RNA為模板,以各病毒特異性引物的下游引物為反轉錄引物,使用M-MLV合成病毒cDNA。反轉錄反應體系(5 μL):RNA模板1.5 μL,下游引物0.5 μL,Rnase-Free H2O 1.0 μL,70℃變性10 min,立即放置冰上2 min,再加入以下試劑:5×M-MLV Buffer 1.0 μL,dNTP mixture(10 mmol·L-1)0.25 μL,RTase M-MLV(RNase H-)(200 U·μL-1)0.25 μL,RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.125 μL,RNase-Free H2O 0.375 μL,總體積為5 μL。42℃保溫60 min,再70℃保溫15 min。

    PCR反應體系:取上述合成的cDNA或DNA液2 μl,加入2.5 μL 10×EasyTaq Buffer,1 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1),上下游引物各1 μL,0.5 μLDNA聚合酶,17 μL ddH2O。擴增條件:94℃3 min后,94℃ 30 s、X℃ 30 s(溫度見表1)、72℃ 50 s,共30次循環(huán),最后,72℃10 min。取PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳,檢測并拍照。

    1.3 PCR產(chǎn)物的回收及測序

    將PCR電泳目的條帶參照凝膠回收試劑盒說明書進行純化、克隆,測序由鉑尚生物技術(上海)有限公司完成,測序結果提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列比對。

    1.4 PMMoV、PeVYV和BWYV序列分析

    從采集的感病樣品中分別選取具有代表性PMMoV、辣椒脈黃化病毒(,PeVYV)和BWYV陽性克隆送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。分別將所得PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進行檢索,利用DNAStar軟件中的Megalign 將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進行同源性比對,利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹,系統(tǒng)進化樹中各分支置信度(Bootstrap)進行1 000次重復分析。

    2 結果

    2.1 侵染山東省辣椒的主要病毒種類及檢測結果

    對采集的253份辣椒樣品提取總RNA,利用特異性引物進行RT-PCR擴增,取10 μL擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測分析(圖1)。

    對采集的辣椒樣品進行PCR、RT-PCR檢測,結果表明(表2)檢出的病毒種類有15種:PMMoV、CMV、TMGMV、BBWV、BWYV、TMV、ToMV、TYLCV、PVY、甜瓜蚜傳黃化病毒(,MABYV)、PeVYV、辣椒潛隱病毒1(,PCV-1)、辣椒潛隱病毒2(2,PCV-2)、AMV和ChiVMV,而未檢測到CaCV、花生矮化病毒(,PSV)、ChiRSV、TSWV和番茄斑駁花葉病毒(,ToMMV)。有5個樣品未檢測到病毒,病毒檢出率高達98.02%。

    表1 山東省辣椒病毒檢測所用引物

    山東省10個地區(qū)的辣椒病毒檢測結果表明在辣椒上檢出病毒種類最多的地區(qū)是臨沂、濟寧,檢測到12種病毒,其次是煙臺、聊城,檢測到11種病毒,濰坊、菏澤檢測到9種病毒,青島、德州檢測到8種病毒,日照檢測到7種病毒,淄博檢測到6種病毒。

    在檢出的病毒中(圖2),PMMoV與CMV的檢出率較高,分別為61.66%、60.08%,可能是危害山東省辣椒的主要病毒;TMGMV、BBWV、BWYV和TMV的侵染現(xiàn)象普遍,總檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、CABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV和AMV的侵染現(xiàn)象較少,檢出率分別為9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、0.79%和0.40%,其中MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2,是山東省最新檢測到侵染辣椒的病毒。

    表2 山東省辣椒上主要病毒的檢測結果

    2.2 辣椒上病毒的復合侵染情況

    在248份陽性樣品中,僅發(fā)現(xiàn)25份樣品為單一病毒的侵染,其余樣品為2種及以上病毒的復合侵染,復合侵染率為89.92%,其中以3種病毒復合侵染所占比例最高,為28.63%,4種病毒復合侵染率為25.00%,2種病毒的復合侵染率為21.77%,5種病毒復合侵染率為13.31%,6種病毒復合侵染率為1.21%。結果表明,山東地區(qū)辣椒上病毒復合侵染現(xiàn)象嚴重。

    病毒復合侵染類型由圖3可知,2種病毒復合侵染類型主要是CMV+PMMoV,3種病毒復合侵染類型復雜,主要是CMV+BWYV+PMMoV,4種病毒復合侵染類型主要是CMV+PMMoV+BWYV+BBWV,5種病毒復合侵染現(xiàn)象較少,其中CMV+PMMoV+TMGMV+ BBWV+TMV是主要侵染類型,在所有樣品中只發(fā)現(xiàn)了3個樣品為6種病毒復合侵染,侵染類型是CMV+ TMV+ToMV+TMGMV+BWYV+PMMoV、CMV+ TMV+PVY+ToMV+PeVYV+PCV-2、CMV+TMV+ TMGMV+BWYV+ PCV-1+PCV-2。

    對山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)的復合侵染現(xiàn)象進行分析,發(fā)現(xiàn)日照地區(qū)辣椒病毒復合侵染率最高,為100%,菏澤地區(qū)復合侵染率最低,為69.23%。聊城、德州、濟寧、煙臺、淄博地區(qū)以3種病毒復合侵染為主,濰坊、菏澤地區(qū)以4種病毒復合侵染為主,臨沂地區(qū)以5種病毒復合侵染為主,青島地區(qū)多以4種、5種病毒復合侵染為主,日照地區(qū)多為3種、4種、5種病毒復合侵染。

    2.3 PMMoV、PeVYV、BWYV系統(tǒng)進化樹分析

    2.3.1 PMMoV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 將PMMoV的基因序列與NCBI上的相應序列進行了比對,并對其進行核苷酸相似性分析,結果表明所得到的分離物與其他序列相似性為94.7%—99.5%,其中與中國貴州分離物(KC571248)相似性最高,為99.5%。所構建的系統(tǒng)進化樹也顯示,本研究所得的PMMoV山東分離物SD60(KR261606)與中國貴州分離物(KC571248)的親緣關系最近,聚集在一個進化枝上,并且與核苷酸相似性分析結果相同(圖4)。

    2.3.2 PeVYV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 本研究所獲得的PeVYV部分序列(對應基因組2 888—3 843位,共956 bp,NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中PeVYV這一段序列登錄較多)上傳到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中,序列包括部分編碼區(qū),并獲得了相應的登錄號(KR226803)。運用DNAStar的Megalign軟件,將本研究所得的PeVYV的序列與世界各地的相關序列進行核苷酸相似性分析,結果表明其與選取序列的核苷酸相似性為94.4%—97.8%,與意大利分離物IT83相似性最高,為97.8%。利用Mega 5.05的NJ法構建系統(tǒng)進化樹,如圖5所示。本研究所得的PeVYV分離物SDRZ31-1(KR226803)與意大利分離物IT83(KU886193)的親緣關系最近,聚類在同一分支上,這與核苷酸相似性分析結果一致。

    2.3.3 BWYV基因序列的系統(tǒng)進化樹分析 由于在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中,BWYV的全基因組序列較少,因此本研究選取其中長411 bp的序列(對應基因組3 562—3 972位,NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中這一段序列登錄較多),包含部分的,將該段序列與世界各地的相應序列進行比對。對BWYV序列進行核苷酸相似性分析,結果表明與選取的國內(nèi)外序列核苷酸相似性為86.6%—98.5%,與韓國分離物LS(KM076647)相似性最高,為98.5%。為了更好地分析BWYV的進化歷程和親緣關系,選取世界各地有代表性的BWYV序列構建系統(tǒng)進化樹。從系統(tǒng)進化樹中,可以看出BWYV山東分離物SD與韓國分離物LS(KM076647)的親緣關系最近,與核苷酸相似性分析結果一致,從而明確了該分離物隸屬于BWYV(圖6)。

    3 討論

    辣椒是一種重要的蔬菜,近年來,中國辣椒的種植面積逐年上升,但受辣椒病毒病的危害日益嚴重,對辣椒生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟損失。北京[3]、天津[3,34]、遼寧[3]、江蘇[3]、吉林[3]、新疆[3]、重慶[4,20]、陜西[5,13]、四川[8]等地均對辣椒上的病毒種類進行過系統(tǒng)的研究。雖然前人對山東省侵染辣椒的CMV、TYLCV進行過研究,但缺乏對山東省辣椒上的病毒進行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。

    本研究對山東省辣椒病毒病進行系統(tǒng)的調(diào)查與檢測,結果表明目前侵染山東省辣椒的病毒種類有15種,病毒檢出率較高,且復合侵染現(xiàn)象比較嚴重。通過對病毒復合侵染現(xiàn)象進行分析發(fā)現(xiàn),其中3種病毒復合侵染現(xiàn)象最多,4種和2種復合侵染的次之,一個辣椒樣品最多被6種病毒同時侵染。PMMoV能與CMV、TMV、PVY、ToMV、BBWV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復合侵染,CMV與TMV、PVY、ToMV、BBWV、PMMoV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復合侵染,同樣地,能與10種以上病毒發(fā)生復合侵染病毒的還有TMV、TMGMV、BWYV、BBWV、PCV-2,并且這幾種病毒的檢出率都比較高,這可能與病毒的傳播方式以及辣椒的品種有關。辣椒病毒病的癥狀多種多樣,可能是由多種病毒復合侵染導致的,多種茄科蔬菜的大面積種植、種子土壤帶毒以及廣泛的傳毒媒介等均能導致復合侵染的發(fā)生,特別是傳毒介體,如CMV、TMV、BBWV、BWYV等病毒均能通過蚜蟲進行傳播,有的傳毒介體能攜帶傳播多種病毒,從而出現(xiàn)一種植物可被多種病毒侵染現(xiàn)象。病毒復合侵染能夠導致植物抗性喪失,危害更為嚴重。此外,本研究發(fā)現(xiàn)采集的一些樣本疑似感染辣椒病毒,但是在該樣本中未檢測到病毒,可能是由于植物的一些生理性病害或是藥害所致。

    本研究中,PMMoV在辣椒上檢出率最高,而PeVYV和BWYV是侵染山東辣椒的新記錄,由于MABYV、PCV-1、PCV-2在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中登錄的序列較少,沒有構建系統(tǒng)發(fā)育樹,因而分別對PMMoV的基因序列、PeVYV的部分基因序列以及BWYV的部分基因序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。從進化關系上來說,PMMoV和BWYV在進化上與寄主種類沒有關聯(lián),可能與地域有一定關系,而PeVYV從進化樹上不能得出其與寄主和地域來源有無關聯(lián)。

    MABYV[35]、BWYV、PeVYV[25]、PCV-1和PCV-2是山東省內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的侵染辣椒的病毒。MABYV、PeVYV、BWYV同屬于黃癥病毒科()馬鈴薯卷葉病毒屬()成員,通過蚜蟲持久性傳播。發(fā)病植株上主要癥狀表現(xiàn)為葉脈黃化,嚴重時整個葉片黃化并向上卷曲,畸形,且發(fā)病植株矮化,果實變小。本研究發(fā)現(xiàn),這3種病毒之間復合侵染現(xiàn)象普遍,這與該屬病毒能依靠蚜蟲進行傳播有關。2011年在土耳其和突尼斯等地的辣椒上發(fā)現(xiàn)了BWYV[36],中國于2015年也報道了BWYV能侵染辣椒[18]。本研究在山東省辣椒上也發(fā)現(xiàn)了該病毒,且這一病毒的檢出率達到了33.2%,其發(fā)展已十分普遍,應該引起足夠的重視,防止出現(xiàn)這一病毒的大暴發(fā),對這一病毒還需要進一步研究。PCV-1和PCV-2屬于雙分體病毒科,該科成員在寄主中含量很低,不引起寄主明顯的癥狀,這兩種病毒的基因組信息和功能研究較少,還需要進一步研究。

    本研究所測到的15種病毒,大多是可以通過蚜蟲進行傳播,部分病毒通過粉虱進行傳播,且研究發(fā)現(xiàn)溫室種植的辣椒病毒檢出率明顯低于露天種植的辣椒病毒檢出率。目前山東省溫室大棚的蚜蟲防治初見成效,但大田種植防治蚜蟲環(huán)節(jié)薄弱,使蚜蟲量增加并加速了植物病毒的傳播,導致病毒危害日益加重。山東省是蔬菜大省,擁有國內(nèi)先進的工廠化育苗,并銷售國內(nèi)各地,因此要做好辣椒病毒病的相關調(diào)查,及時做好相關防治措施,以防止辣椒病毒病的大量暴發(fā)和傳播,造成經(jīng)濟損失。

    4 結論

    對采自山東省10個市(區(qū))的253份辣椒樣品進行20種病毒的檢測,發(fā)現(xiàn)目前侵染山東辣椒的病毒種類有15種,其中PMMoV、CMV為主要病毒毒原,病毒檢出率均達到了60%以上,并且病毒的復合侵染現(xiàn)象比較嚴重。新發(fā)現(xiàn)了5種侵染山東省辣椒的病毒,分別為PeVYV、BWYV、MABYV、PCV-1和PCV-2。

    References

    [1] 王立浩, 張正海, 曹亞從, 張寶璽. “十二五”我國辣椒遺傳育種研究進展及其展望. 中國蔬菜, 2016(1): 1-7.

    WANG L H, ZHANG Z H, CAO Y C, ZHANG B X. Research progress and prospect of pepper genetics and breeding in China in 12th five-year., 2016(1): 1-7. (in Chinese)

    [2] CHENG Y H, ZHENG Y X, TAI C H, YEN J H, CHEN Y K, JAN F J. Identification, characterisation and detection of a new tospovirus on sweet pepper., 2014, 164(1): 107-115.

    [3] 楊永林, 閆淑珍, 田茹燕, 馮蘭香, 梁訓生, 王志源. 中國六省、市辣 (甜)椒病毒種群及其分布的研究. 中國病毒學, 1995, 10(4): 332-339.

    YANG Y L, YAN S Z, TIAN R Y, FENG L X, LIANG X S, WANG Z Y. A report on the research of virus populations on pepper (L.) and their distributions in six provinces or cities of China., 1995, 10(4): 332-339. (in Chinese)

    [4] 雷蕾, 林清, 呂中華, 黃任中, 黃啟中, 史思茹. 重慶市辣椒病毒病毒原種類鑒定及株系確認. 中國辣椒, 2001(1): 27-29.

    LEI L, LIN Q, Lü Z H, HUANG R Z, HUANG Q Z, SHI S R. Pathogens and its isolates inducing virus disease in hot peppers round Chongqing Municipality Areas., 2001(1): 27-29. (in Chinese)

    [5] 趙尊練, 史聯(lián)聯(lián), 譚根堂, 嚴小良. 陜西省辣椒主產(chǎn)區(qū)辣椒病毒病病原種類鑒定及其分布研究. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37(11): 1738-1742.

    ZHAO Z L, SHI L L, TAN G T, YAN X L. Study on pepper (L.) virus disease and its distribution in the Guanzhong area of Shaanxi Province., 2004, 37(11): 1738-1742. (in Chinese)

    [6] 王亞南, 趙緒生, 袁文龍, 劉淑香. 辣椒輕斑駁病毒研究現(xiàn)狀. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(14): 7401-7402, 7404.

    WANG Y N, ZHAO X S, YUAN W L, LIU S X. Research status of(PMMoV)., 2010, 38(14): 7401-7402, 7404. (in Chinese)

    [7] 劉勇, 李媛媛, 吳竹妍, 饒雪琴. 廣州辣椒上番茄斑萎病毒屬病毒的鑒定. 植物保護學報, 2010, 37(4): 383-384.

    LIU Y, LI Y Y, WU Z Y, RAO X Q. Identification ofon pepper in Guangzhou., 2010, 37(4): 383-384. (in Chinese)

    [8] 楊會房, 阮濤, 包凌云, 于云奇, 楊水英, 青玲. 四川省攀西地區(qū)南瓜、甜菜和辣椒部分病毒種類的ELISA檢測. 中國蔬菜, 2011(16): 91-94.

    YANG H F, RUAN T, BAO L Y, YU Y Q, YANG S Y, QING L. ELISA detection for certain virus types of squash, beet and chili in Panxi District of Sichuan Province., 2011(16): 91-94. (in Chinese)

    [9] 王健華, 章紹延, 龔殿, 張雨良, 劉志昕. 辣椒環(huán)斑病毒分子檢測方法的建立及應用. 熱帶作物學報, 2012, 33(2): 342-345.

    WANG J H, ZHANG S Y, GONG D, ZHANG Y L, LIU Z X. Establishment and application for molecular detection of., 2012, 33(2): 342-345. (in Chinese)

    [10] 張仲凱, 何躍鋒, 方琦, 程曉非, 董家紅, 尹躍艷, 丁銘. 3種番茄斑萎病毒屬病毒侵染寄主植物的細胞病理特征. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2010, 23(5): 1522-1524.

    ZHANG Z K, HE Y F, FANG Q, CHENG X F, DONG J H, YIN Y Y, DING M. Cytopathological characterization of three distinctspecies in infected host plants., 2010, 23(5): 1522-1524. (in Chinese)

    [11] 郭思瑤, 童艷, 黃婭, 羅信福, 青玲. 重慶辣椒病毒病病原初步鑒定和分析. 園藝學報, 2015, 42(2): 263-270.

    GUO S Y, TONG Y, HUANG Y, LUO X F, QING L. Preliminary identification and analyses of viruses causing pepper virus disease in Chongqing, China., 2015, 42(2): 263-270.(in Chinese)

    [12] 馮蘭香, 張寶璽, 謝丙炎, 王立浩, 楊宇紅, 毛勝利. 3種辣椒新病毒的發(fā)生與血清學鑒定. 中國蔬菜, 2005(12): 33-34.

    FENG L X, ZHANG B X, XIE B Y, WANG L H, YANG Y H, MAO S L. Occurrence and serological identification of 3 new viruses on pepper., 2005(12): 33-34. (in Chinese)

    [13] 陳青, 廖富榮, 陳紅運, 謝毅璇, 陳加福, 蔡金鐳, 林石明. 辣椒上煙草輕型綠花葉病毒的鑒定. 植物病理學報, 2013, 43(6): 651-654.

    CHEN Q, LIAO F R, CHEN H Y, XIE Y X, CHEN J F, CAI J L, LIN S M. Identification ofinfecting pepper., 2013, 43(6): 651-654. (in Chinese)

    [14] 譚根堂, 史聯(lián)聯(lián), 尚惠蘭, 鞏振輝. 陜西線辣椒病毒病病原檢測簡報. 辣椒雜志, 2003(3): 32-33.

    TAN G T, SHI L L, SHANG H L, GONG Z H. Diagnosis of viruses in chili pepper in Shaanxi province., 2003(3): 32-33. (in Chinese)

    [15] WANG J, LIU Z, NIU S, PENG M, WANG D, WENG Z, XIONG Z. Natural occurrence ofonin China., 2006, 90(3): 377.

    [16] QING L, XIONG Y, SUN X C, YANG S Y, ZHOU C Y. First report ofinfecting pepper in China., 2010, 94(5): 637.

    [17] 阮濤. 我國三種寄主上雙生病毒的分子鑒定及序列分析[D]. 重慶: 西南大學, 2012.

    RUAN T. Molecular identification and sequence analysis of Geminiviruses on three host plants in China[D]. Chongqing: Southwest University, 2012. (in Chinese)

    [18] 丁英娜, 李世訪, 張升, 崔元圩, 楊華, 何偉, 孫曉軍. 新疆番茄黃化曲葉病毒檢測及其DNA基因組序列分析. 植物保護, 2013, 39(3): 51-55.

    DING Y N, LI S F, ZHANG S, CUI Y Y, YANG H, HE W, SUN X J. Molecular detection and analysis of the complete nucleotide sequences of TYLCV isolates from Xinjiang., 2013,39(3): 51-55. (in Chinese)

    [19] YUAN W, YONG R J, ZUO L Y, DU K T, ZHOU T. First report ofon pepper in China., 2015, 97(2): 391-403.

    [20] 趙汝娜, 王蓉, 師迎春, 張桂娟, 原鍇, 范在豐, 周濤. 侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定. 植物保護, 2014, 40(1): 128-130.

    ZHAO R N, WANG R, SHI Y C, ZHANG G J, YUAN K, FAN Z F, ZHOU T. Molecular identification ofon sweet pepper., 2014, 40(1): 128-130. (in Chinese)

    [21] 楊超, 孫秀東. 應用RT-PCR檢測辣椒上的黃瓜花葉病毒. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2009(2): 94-96.

    YANG C, SUN X D. Detection of CMV on hot pepper by RT-PCR., 2009(2): 94-96. (in Chinese)

    [22] 劉春香, 劉彩云, 李會平, 曹京. 壽光地區(qū)感病辣椒TYLCV的分子鑒定和病毒DNA-A序列分析. 華北農(nóng)學報, 2012, 27(3): 46-49.

    LIU C X, LIU C Y, LI H P, CAO J. Molecular identification and DNA-A gene sequence analysis ofon pepper () in Shouguang region., 2012, 27(3): 46-49. (in Chinese)

    [23] Hinrichs J, Berger S, Shaw J G. Induction of antibodies to plant viral proteins by DNA-based immunization., 1997, 66: 195-202.

    [24] 鄭興華, 洪鯤, 楊立昌, 乙引, 萬晴姣. 貴州辣椒輕斑駁病毒分離物的分子鑒定. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2013, 41(5): 30-32.

    ZHENG X H, HONG K, YANG L C, YI Y, WAN Q J. Molecular identification of pepper mild mottle virus isolate in Guizhou., 2013, 41(5): 30-32. (in Chinese)

    [25] TAN W P, DONG Y Z, SUN X H, LIANG Y C, LIU H X, ZHU X P. The first identification ofin Shandong province, China., 2015, 99(9): 1288.

    [26] 謝艷, 張仲凱, 李正和, 丁銘, 周雪平. 粉虱傳雙生病毒的TAS-ELISA及PCR快速檢測. 植物病理學報, 2002, 32(2): 182-186.

    XIE Y, ZHANG Z K, LI Z H, DING M, ZHOU X P. Rapid detection of whitefly-transmitted Geminiviruses by TAS-ELISA and PCR., 2002, 32(2): 182-186. (in Chinese)

    [27] ZHAO F F, XI D H, LIU J, DENG X G, LIN H H. First report ofinfecting tomato () in China., 2014, 98(11): 1589.

    [28] Knierim D, Deng T C, Tsai W S, Green S K, Kenyon L.Molecular identification of three distinctspecies and a recombinantstrain infecting cucurbit crops in Taiwan., 2010, 59: 991-1002.

    [29] Obrepalska-Steplowska A, Budziszewska M, Pospieszny H. Complete nucleotide sequence of a Polish strain of(PSV-P) that is related to but not a typical member of subgroup I., 2008, 55(4): 731-739.

    [30] WANG J H, ZHANG S Y, GONG D, WU Y P, ZHANG Y L, YU N T, LIU Z X. First report ofon chili pepper in China., 2012, 96(3): 462.

    [31] Nischwitz C, Mullis S W, Gitaitis R D, Csinos A S. First report ofin leek () in the United States., 2006, 90(4): 525.

    [32] LI Y Y, WANG C L, XIANG D, LI R H, LIU Y, LI F. First report ofinfection of pepper in China., 2014, 98(10): 1447.

    [33] Sabanadzovic S, Valverde R A. Properties and detection of two cryptoviruses from pepper., 2011, 43: 307-312.

    [34] 高葦, 王勇, 張春祥, 張安盛, 竺曉平. 天津地區(qū)辣椒病毒病調(diào)查及毒源種類初步鑒定. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2016, 48(3) : 91-94.

    GAO W, WANG Y, ZHANG C X, ZHANG A S, ZHU X P. Investigation and pathogen preliminary identification of pepper virus disease in Tianjin., 2016, 48(3): 91-94. (in Chinese)

    [35] WANG S L, SUN X H, TAN W P, WANG C L, YANG Y Y, WANG X Y, ZHU X P. First report of(MABYV) in pepper plants in China., 2017, 101(1): 262.

    [36] Buzkan N, Arpaci B B, Simon V, Fakhfakh H, Moury B. High prevalence of poleroviruses in field-grown pepper in Turkey and Tunisia., 2013, 158: 881-885.

    (責任編輯 岳梅)

    Molecular Detection and Identification of Main Viruses on Pepper in Shandong Province

    WANG ShaoLi1, TAN WeiPing1, YANG YuanYuan1, DAI HuiJie2, SUN XiaoHui1, QIAO Ning1,2, ZHU XiaoPing1

    (1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University/Shandong provincial key laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Taian 271018, Shandong;2WeiFang University of Science and Technology, Shouguang 262700, Shandong)

    【Objective】 The objective of this study is to identify the main viruses causing pepper virus diseases in Shandong Province, China.【Method】In 2014-2015, a total of 253 susceptible pepper plant samples were collected from 10 urban areas (Linyi, Rizhao, Qingdao, Yantai, Weifang, Zibo, Jining, Heze, Liaocheng, Dezhou) in Shandong Province. Total RNA and DNA were extracted from the leaves of pepper samples, and were subjected to detect viruses with Geminivirus universal primers (PA/PB), Polerovirus universal primers (POL-F/POL-R) and specific primers of main viruses infecting pepper have been reported by PCR and reverse transcription-PCR (RT-PCR). Each amplified fragment was purified by DNA gel extraction kit, cloned into pMD18-T vector and sequenced. The obtained sequences of PMMoV, PeVYV and BWYV were subjected to BLAST search, and compared with the representative sequences of GenBank which had been registered around the world using the Megalign in DNAStar software. Clustal W method of Mega 5.05 was used for multiple sequence alignment analysis and the phylogenetic tree were constructed by neighbor-joining (NJ) of Mega 5.05, with the bootstrap of each branch of phylogenetic tree analyzed 1 000 times. 【Result】The PMMoV and CMV had the highest detection rate, were 61.66% and 60.08%, respectively. TMGMV, BBWV-2, BWYV and TMV were popular with the detection rate of 41.90%, 34.78%, 33.20% and 24.90%, respectively. The detection rates of PCV-2, ToMV, TYLCV, PVY, MABYV, PeVYV, PCV-1, ChiVMV andAMV were 11.86%, 9.88%, 9.09%, 6.72%, 5.53%, 3.56%, 3.16%, 0.79% and 0.40%, respectively. No CaCV, PSV, ChiRSV, TSWVand ToMMV were detected. The complex infection phenomenon showed that co-infections were up to 89.92%, three kinds of viruses mixed infection occurs the highest rate, up to 28.63%, followed by four kinds of viruses mixed infection, up to 25.00%, two kinds of viruses mixed infection, up to 21.77%, five kinds of viruses mixed infection up to 13.31%, and 6 viruses detected in one sample is the extreme case, with the mixed infection rate up to 1.21%. Phylogenetic trees were constructed with partialof PMMoV, partial,andgenesof PeVYV and partialandgenes of BWYV, respectively. PMMoV Shandong isolate SD60 and the China Guizhou isolate had the closest relationship, PeVYV-SDRZ31-1 and Italy isolate IT83 shared the closest relationship, BWYV Shandong isolate SD clustered with Korean isolate LS. 【Conclusion】 Fifteen viruses were detected, among which PMMoV and CMV were the main pathogens. The newly detected viruses are MABYV, PeVYV, BWYV, MABYV, PCV-1 and PCV-2 in pepper in Shandong Province. The occurrence of viral diseases and the primary and secondary relationship of the main types of pepper viruses in Shandong province were clarified.

    pepper virus diseases;(PMMoV);(BWYV);(MABYV); complex infection

    2017-01-18;接受日期:2017-03-23

    國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028)、山東省科技發(fā)展計劃(2014GNC111008)

    王少立,E-mail:wangshaolisdau@163.com。通信作者竺曉平,Tel:0538-8247781-8510;E-mail:zhuxp@sdau.edu.cn

    猜你喜歡
    進化樹侵染辣椒
    原來,你還是這樣的辣椒
    你的辣椒結出果實了嗎?
    揭示水霉菌繁殖和侵染過程
    基于心理旋轉的小學生物進化樹教學實驗報告
    辣椒也瘋狂
    常見的進化樹錯誤概念及其辨析*
    生物學通報(2021年9期)2021-07-01 03:24:44
    揀辣椒
    中外文摘(2020年9期)2020-06-01 13:47:56
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    蕓薹根腫菌侵染過程及影響因子研究
    甘藍根腫病菌休眠孢子的生物學特性及侵染寄主的顯微觀察
    亚洲最大成人中文| 搡老妇女老女人老熟妇| 热99re8久久精品国产| 欧美大码av| 亚洲av五月六月丁香网| 男人舔女人下体高潮全视频| 两个人视频免费观看高清| 免费在线观看成人毛片| 国产激情欧美一区二区| www日本黄色视频网| 久久久国产精品麻豆| a在线观看视频网站| 成人国语在线视频| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲中文字幕日韩| 久热这里只有精品99| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品久久视频播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美一级a爱片免费观看看 | 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲专区字幕在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲激情在线av| 午夜亚洲福利在线播放| 首页视频小说图片口味搜索| 人人妻人人看人人澡| 国产午夜福利久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美乱妇无乱码| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品国产亚洲在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线天堂中文资源库| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久草成人影院| 久久 成人 亚洲| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品 国内视频| 两人在一起打扑克的视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 白带黄色成豆腐渣| 99re在线观看精品视频| 极品教师在线免费播放| 女警被强在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久国产精品影院| 国产主播在线观看一区二区| 色播亚洲综合网| 美女 人体艺术 gogo| 中文在线观看免费www的网站 | 女同久久另类99精品国产91| 美女午夜性视频免费| 露出奶头的视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产午夜福利久久久久久| 免费看a级黄色片| 90打野战视频偷拍视频| 可以在线观看的亚洲视频| 我的亚洲天堂| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久性视频一级片| 免费观看精品视频网站| 好男人电影高清在线观看| 成人免费观看视频高清| 国产视频内射| 女性被躁到高潮视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精华一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 老司机福利观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| a级毛片在线看网站| 国产精品永久免费网站| 身体一侧抽搐| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品 欧美亚洲| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久亚洲精品不卡| 久久精品91无色码中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品99久久99久久久不卡| 黄色女人牲交| a在线观看视频网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美大码av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产av不卡久久| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 后天国语完整版免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| www.自偷自拍.com| а√天堂www在线а√下载| 校园春色视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 99re在线观看精品视频| 国产精品 国内视频| 91大片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品一区二区三区四区久久 | av免费在线观看网站| 午夜福利一区二区在线看| 在线观看午夜福利视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲片人在线观看| 香蕉国产在线看| 国内精品久久久久精免费| 少妇粗大呻吟视频| 免费看美女性在线毛片视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一级黄色大片毛片| 亚洲中文av在线| 在线av久久热| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品久久久久久精品电影 | 成人国产一区最新在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 啦啦啦免费观看视频1| 最近最新免费中文字幕在线| 免费观看精品视频网站| 美女午夜性视频免费| 免费看十八禁软件| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲七黄色美女视频| 色av中文字幕| 欧美成人午夜精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 91麻豆av在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产黄a三级三级三级人| xxxwww97欧美| 又紧又爽又黄一区二区| 色综合站精品国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 久9热在线精品视频| 国产精品野战在线观看| avwww免费| 午夜精品在线福利| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产私拍福利视频在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 午夜激情av网站| 波多野结衣高清作品| 亚洲欧美激情综合另类| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久久午夜电影| 国产久久久一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 黄色视频,在线免费观看| 欧美中文综合在线视频| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av熟女| 最新美女视频免费是黄的| 自线自在国产av| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美一级a爱片免费观看看 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜福利成人在线免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久国产精品麻豆| 色av中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 露出奶头的视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久亚洲真实| 久久国产亚洲av麻豆专区| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜精品在线福利| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 三级毛片av免费| 久久久久免费精品人妻一区二区 | www国产在线视频色| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人av激情在线播放| 91成人精品电影| 俺也久久电影网| 一级毛片高清免费大全| 久久天堂一区二区三区四区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲三区欧美一区| 精品免费久久久久久久清纯| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美一区二区精品小视频在线| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 十分钟在线观看高清视频www| 黑人操中国人逼视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 长腿黑丝高跟| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人久久性| 草草在线视频免费看| 免费看美女性在线毛片视频| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲专区字幕在线| 日韩精品青青久久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 中文字幕高清在线视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 91字幕亚洲| 最近最新免费中文字幕在线| 韩国av一区二区三区四区| 在线观看一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 中国美女看黄片| netflix在线观看网站| 国产一卡二卡三卡精品| 校园春色视频在线观看| 久久人人精品亚洲av| 成年人黄色毛片网站| av电影中文网址| 国产精品免费一区二区三区在线| 人妻久久中文字幕网| 日本免费一区二区三区高清不卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲中文av在线| 成人18禁在线播放| 99re在线观看精品视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产高清有码在线观看视频 | 黑人操中国人逼视频| 在线免费观看的www视频| 国产97色在线日韩免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费无遮挡裸体视频| 色综合站精品国产| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产成人精品久久二区二区91| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美黑人精品巨大| 国产成人欧美在线观看| 午夜免费成人在线视频| av福利片在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 搡老岳熟女国产| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲熟女毛片儿| 两个人视频免费观看高清| 一区二区三区国产精品乱码| 黄色视频不卡| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产日本99.免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 大型av网站在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| АⅤ资源中文在线天堂| 91大片在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲成国产人片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久久久久精品吃奶| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 他把我摸到了高潮在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久人人精品亚洲av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美成人午夜精品| 麻豆av在线久日| 女性被躁到高潮视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产熟女xx| 国产一区二区激情短视频| 日本一本二区三区精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久久九九精品二区国产 | 国产精品一区二区免费欧美| 在线永久观看黄色视频| www.熟女人妻精品国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产v大片淫在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久国产成人免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 香蕉丝袜av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成av人片免费观看| 香蕉久久夜色| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 9191精品国产免费久久| av有码第一页| 一级毛片女人18水好多| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费av毛片视频| 欧美中文综合在线视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人三级做爰电影| avwww免费| 国产v大片淫在线免费观看| 男女午夜视频在线观看| 性欧美人与动物交配| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 午夜老司机福利片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产精品 国内视频| 亚洲最大成人中文| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕精品免费在线观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| or卡值多少钱| 国产伦在线观看视频一区| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲男人天堂网一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产又爽黄色视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产成年人精品一区二区| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文字幕久久专区| АⅤ资源中文在线天堂| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕av电影在线播放| 美女高潮到喷水免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产黄a三级三级三级人| 日韩大尺度精品在线看网址| 成人免费观看视频高清| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| av电影中文网址| 日韩欧美免费精品| 色老头精品视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人影院久久av| 亚洲熟女毛片儿| 一区二区三区精品91| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久久人人人人人| 热99re8久久精品国产| 韩国精品一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| www国产在线视频色| 美女免费视频网站| 成人18禁在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产99久久九九免费精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 真人做人爱边吃奶动态| 91av网站免费观看| 曰老女人黄片| 午夜免费激情av| 亚洲熟女毛片儿| 制服诱惑二区| 亚洲 国产 在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 午夜精品在线福利| 91字幕亚洲| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品日产1卡2卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 好男人在线观看高清免费视频 | www国产在线视频色| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久精品影院6| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美免费精品| 黄色成人免费大全| 好男人在线观看高清免费视频 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线免费观看的www视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲国产精品sss在线观看| av片东京热男人的天堂| 久久精品人妻少妇| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线观看66精品国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久 成人 亚洲| 深夜精品福利| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久久大精品| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 黄色毛片三级朝国网站| 午夜亚洲福利在线播放| 久久国产精品影院| 欧美日韩福利视频一区二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产成年人精品一区二区| 正在播放国产对白刺激| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 女人被狂操c到高潮| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品第一国产精品| 亚洲av电影在线进入| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲五月婷婷丁香| 身体一侧抽搐| 国产日本99.免费观看| 午夜福利欧美成人| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产伦在线观看视频一区| 免费搜索国产男女视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | avwww免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| av在线天堂中文字幕| 亚洲专区字幕在线| a在线观看视频网站| 亚洲全国av大片| 91麻豆av在线| 波多野结衣高清作品| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品在线美女| 亚洲免费av在线视频| 黄色女人牲交| 丁香六月欧美| 亚洲av熟女| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 制服丝袜大香蕉在线| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜免费成人在线视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 哪里可以看免费的av片| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费看十八禁软件| 韩国精品一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 久热爱精品视频在线9| tocl精华| 国产在线观看jvid| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品av久久久久免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美国产日韩亚洲一区| 哪里可以看免费的av片| 超碰成人久久| 黄片大片在线免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 最新美女视频免费是黄的| 午夜福利免费观看在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99精品久久久久人妻精品| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久久免费视频了| 免费观看人在逋| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费在线观看亚洲国产| 丰满的人妻完整版| 在线国产一区二区在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一个人观看的视频www高清免费观看 | 在线观看免费午夜福利视频| 一a级毛片在线观看| 国产99久久九九免费精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产成人欧美在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 老鸭窝网址在线观看| 91字幕亚洲| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久久久大精品| 婷婷亚洲欧美| 可以在线观看的亚洲视频| 久久亚洲精品不卡| 窝窝影院91人妻| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 女性生殖器流出的白浆| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 怎么达到女性高潮| 欧美在线一区亚洲| 久久精品人妻少妇| 在线播放国产精品三级| 国产精品精品国产色婷婷| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | www.www免费av| 国产99白浆流出| 免费在线观看黄色视频的| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色片一级片一级黄色片| 免费看a级黄色片| 欧美一级毛片孕妇| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 天堂影院成人在线观看| 国产精品二区激情视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美成人性av电影在线观看| 黄色成人免费大全| 两性夫妻黄色片| 18禁观看日本| 国产精品亚洲av一区麻豆| 搡老岳熟女国产| 中文字幕最新亚洲高清| 精品乱码久久久久久99久播| 可以在线观看毛片的网站| 黄色视频,在线免费观看| 岛国在线观看网站| 久久久久国内视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品一区av在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产乱人伦免费视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产99白浆流出| 免费在线观看成人毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产v大片淫在线免费观看| 免费在线观看完整版高清| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜福利免费观看在线| 在线观看舔阴道视频| 国产成人精品无人区| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩有码中文字幕| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲在线自拍视频| 日韩欧美免费精品| 中文亚洲av片在线观看爽|