菠蘿皮渣中乳酸菌的分離鑒定及其生長特性研究

香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，王玲

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

菠蘿皮渣中乳酸菌的分離鑒定及其生長特性研究

香換玲，何艷梅，林峰，冉苒，陳志聰，*王玲

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

從3個不同種植基地來源的菠蘿皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經(jīng)觸酶試驗、革蘭氏染色試驗、溶鈣圈試驗、糖發(fā)酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等生理生化試驗鑒定，證實其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，初步鑒定為乳酸菌；對其生長特性進(jìn)行研究，2株菌的對數(shù)生長期均為6～14 h，在22～47℃溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱能性，在pH值2.5～6.5的環(huán)境中能良好生長，說明試驗分離到的這2株乳酸菌對外界環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

菠蘿皮；乳酸菌；分離鑒定；生長特性

0 引言

菠蘿是我國南方栽培面積較大、產(chǎn)量較多的大宗水果之一，成熟時色澤鮮艷、營養(yǎng)豐富、味道清甜、氣味芳香，深受廣大消費者的喜愛[1]。菠蘿水分含量高、不耐貯藏，產(chǎn)地收貨季節(jié)一般都就地加工成菠蘿罐頭、果醬、蜜餞、果干等產(chǎn)品[2]。在菠蘿果實的加工過程中，會產(chǎn)生占全果質(zhì)量50%～60%的皮渣副產(chǎn)物[3]。這些皮渣中含有大量的糖分、纖維素、半纖維素等碳水化合物及其他適宜微生物生長的營養(yǎng)成分[4]。

目前，國內(nèi)利用果蔬加工副產(chǎn)物生產(chǎn)青貯飼料的研究比較熱門。將菠蘿皮渣粉碎后接種乳酸菌，可以生產(chǎn)適合家畜飼養(yǎng)的青貯飼料[5-6]，這種通過乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的青貯飼料，具有改善飼料的發(fā)酵品質(zhì)、增加營養(yǎng)價值、提高畜禽機(jī)體抵抗力、節(jié)省養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)成本等特點。但是，所使用的發(fā)酵乳酸菌菌種大部分都是購買于一些大型的研究所，對青貯飼料的生產(chǎn)存在專一性不強(qiáng)、生產(chǎn)效率較低等問題。

各種農(nóng)副產(chǎn)品加工下腳料都有自身的特性。有針對性地從菠蘿皮渣中分離乳酸菌，旨在為菠蘿皮渣生產(chǎn)青貯飼料提供更為高效專一的菌種，進(jìn)而提高菠蘿皮渣青貯飼料的品質(zhì)和利用效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菠蘿，采自湛江雷州3家不同種植園。

1.2 試劑

鹽酸、碳酸鈣、葡萄糖、過氧化氫酶、吐溫80，均為AR級。

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基、色氨酸培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、瓊脂粉、酵母提取物。

1.3 主要儀器

HPX-9162MB型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；顯微鏡，OLYPUS公司產(chǎn)品；PHSJ-4A型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法

1.4.1 乳酸菌的富集培養(yǎng)[7-15]

將成熟度為九成熟的菠蘿全果取下表皮并粉碎，取樣25 g置于裝有225 mL無菌水的錐形瓶中搖勻稀釋至10-1，再依次稀釋直至10-5，振蕩培養(yǎng)10 min后，分別吸取100 μL上清液轉(zhuǎn)入MRS培養(yǎng)基中，用無菌棒涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待菌落長成后，選擇具有乳酸菌典型菌落特征的單個菌落進(jìn)一步劃線分離3次，顯微鏡觀察為純菌落后移植在MRS斜面上，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 乳酸菌的鑒定

（1）過氧化氫酶試驗。在載玻片上滴1滴過氧化氫溶液，挑取1環(huán)疑似菌株溶于過氧化氫溶液中，觀察菌體是否產(chǎn)生氣泡。

（2）革蘭氏染色試驗。對疑似菌進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體的個體形狀和顏色。

（3）生理生化鑒定。①溶鈣圈試驗。乳酸菌生長時，乳酸的產(chǎn)生會將菌體周圍的鈣溶解掉，形成透明圈。在MRS固體培養(yǎng)基中加入2%的碳酸鈣制成平板，取1環(huán)疑似菌劃線接種于其上，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基中鈣的溶解性。②糖發(fā)酵試驗。在預(yù)先放有1支小導(dǎo)管的PY培養(yǎng)基中接種1～2環(huán)疑似菌株，搖勻后于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的顏色和小導(dǎo)管是否浮起。③明膠液化試驗。接種1環(huán)疑似菌株于明膠培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基凝固情況。④吲哚試驗。接種1環(huán)疑似菌株于色氨酸培養(yǎng)基中，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，加入2滴吲哚試劑，觀察培養(yǎng)基上層溶液顏色變化。⑤運動性試驗。在MRS肉湯培養(yǎng)基中加入0.4%瓊脂粉制備半固體培養(yǎng)基，在其中接種1環(huán)疑似菌株，在37℃生化恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌體在半固體培養(yǎng)基的生長情況。

1.4.3 乳酸菌生長特性研究

（1）乳酸菌的生長曲線。將疑似菌株接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測OD值，觀察培養(yǎng)時間與菌株生長的關(guān)系，繪制生長曲線。

（2）乳酸菌產(chǎn)酸能力測試。按照上述1.4.3（1）中的培養(yǎng)方法，在37℃的培養(yǎng)條件下，每隔2 h取樣測定細(xì)菌培養(yǎng)液的pH值，觀察疑似菌株的產(chǎn)酸能力。

（3）乳酸菌耐受性試驗。乳酸菌耐受性試驗包括耐熱性、耐酸性試驗等。①乳酸菌耐熱性試驗。將疑似菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別置于17，22，27，32，37，42℃溫度下培養(yǎng)48 h，每株菌每個溫度下重復(fù)試驗3次，設(shè)置1個對照，觀察菌株的生長情況。②乳酸菌耐酸性試驗。用HCl溶液調(diào)節(jié)MRS肉湯培養(yǎng)基的酸度，使其pH值分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，接種疑似菌株到各酸度梯度的MRS肉湯培養(yǎng)基中，每個株菌在同一酸度條件下重復(fù)試驗3次，設(shè)置1個對照，于37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

按1.4.1中的方法進(jìn)行操作，將各稀釋度的樣品稀釋液均勻涂布在MRS固體培養(yǎng)基表面，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。菌落長成后，根據(jù)乳酸菌的菌落特征及顯微鏡下的個體形態(tài)特征，初步分離到10株疑似乳酸菌。

乳酸菌分離結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌分離結(jié)果

由表1可以看出，菌落顏色大多以白色、乳白色、表面白色、底部淡黃色為主，外形以圓形為主，表面光滑、濕潤，質(zhì)地均勻，容易挑取；顯微鏡下觀察其個體形態(tài)有細(xì)長桿狀或成鏈、兩端鈍圓、球狀或卵球狀，不具運動性，無芽孢。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 過氧化氫酶試驗

過氧化氫酶試驗是乳酸菌的一個重要鑒定試驗。乳酸菌一般不會分泌過氧化氫酶，不能將過氧化氫溶液分解代謝生成水和氧氣。根據(jù)1.4.2（1）中描述的試驗方法及步驟，對挑選出的10株疑似乳酸菌進(jìn)行過氧化氫酶試驗。

疑似乳酸菌的過氧化氫酶試驗結(jié)果見表2。

表2 疑似乳酸菌的過氧化氫酶試驗結(jié)果

由表2可以看出，10株疑似乳酸菌與過氧化氫溶液接觸后，A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均呈陽性反應(yīng)，不符合乳酸菌的生理特性；B3和C3呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，符合乳酸菌的生理特性。因此，可以初步判斷A1，A2，B1，B2，B4，C1，C2，D1均不是乳酸菌，B3和C3留待后續(xù)繼續(xù)鑒定。

2.2.2 革蘭氏染色試驗

對B3和C32株疑似菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色情況和菌體細(xì)胞的個體形態(tài)，結(jié)果B3和C32株菌均為紫色，形態(tài)為球狀或桿狀，成對或成鏈排列，具備乳酸菌的基本特征。

2.2.3 生理生化鑒定

根據(jù)1.4.2（3）生理生化鑒定描述的試驗步驟，對B3和C32株疑似乳酸菌菌株分別進(jìn)行溶鈣圈試驗、糖發(fā)酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等。

疑似乳酸菌的生理生化試驗結(jié)果見表3。

表3 疑似乳酸菌的生理生化試驗結(jié)果

由表3中可以看出，B3和C3菌株均具備乳酸菌該有的生理生化特性，結(jié)合以上試驗，基本可以確定為乳酸菌。

2.3 乳酸菌的生長特性

2.3.1 乳酸菌的生長曲線

按照1.4.3（1）中的方法，按5%的接種量將疑似菌株B3和C3分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測OD值，觀察培養(yǎng)時間與菌株生長的關(guān)系，繪制生長曲線。

乳酸菌的生長曲線見圖1。

圖1 乳酸菌的生長曲線

從圖1可以看出，乳酸菌B3在0～8 h的生長遲緩期內(nèi)菌體數(shù)量增加比較小，曲線緩慢上升；在之后的8～14 h，菌體生成量明顯增多，為該菌生長的對數(shù)期；14 h后，菌體生成量變化不大，乳酸菌的生長進(jìn)入了穩(wěn)定期。乳酸菌C3生長的遲緩期在0～6 h，6～14 h為其生長的對數(shù)期，14～20 h為其穩(wěn)定期。因此，B3和C32菌株均能在MRS肉湯培養(yǎng)基中良好生長，但C3比B3能較早進(jìn)入對數(shù)期，且對數(shù)期持續(xù)時間較長。

2.3.2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

根據(jù)1.4.3（2）乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定方法，測定不同培養(yǎng)時間下B3和C3在培養(yǎng)基中酸度的變化情況。

乳酸菌的產(chǎn)酸曲線見圖2。

圖2 乳酸菌的產(chǎn)酸曲線

由圖2可以看出，乳酸菌B3和C3在前5 h的酸度變化均不明顯，培養(yǎng)液處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；在5～14 h，pH值明顯下降，乳酸菌大量繁殖，培養(yǎng)液中總酸含量增高；14 h后，2株菌的pH值均變化不大，均保持在一個相對穩(wěn)定的水平；在20 h時，B3和C3的pH值都穩(wěn)定在3.5左右。由此可見，2株菌都具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

2.3.3 乳酸菌的耐熱性

按1.4.3（3）①中描述的方法，將乳酸菌B3和C3接種到MRS肉湯培養(yǎng)基后，放置在17，22，27，32，37，42℃共6個溫度梯度下培養(yǎng)48 h，取出觀察細(xì)菌培養(yǎng)液的渾濁度和試管底部沉淀物，判斷其生長情況。

乳酸菌在不同溫度下的培養(yǎng)情況結(jié)果見表4。

表4 乳酸菌在不同溫度下的培養(yǎng)情況結(jié)果

由表4可以看出，乳酸菌B3和C3的生長能力受溫度的影響比較明顯。在17℃的低溫條件下，乳酸菌B3和C3不生長；從22℃開始，隨著溫度的逐漸上升，細(xì)菌的生長逐漸變得活躍，菌液濃度不斷增大；到42℃時，2株試驗菌表現(xiàn)出了最強(qiáng)的生長能力；但在47℃時，菌體的生長量又降低了。說明乳酸菌B3和C3在一定的溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱性。2.3.4乳酸菌的耐酸性

按1.4.3（3）②中描述的方法，將乳酸菌B3和C3分別按8%的接種量接種到pH值2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌液濃度和試管底部的沉淀物，判斷細(xì)菌的生長情況。

乳酸菌在不同pH值中的培養(yǎng)情況見表5。

表5 乳酸菌在不同pH值中的培養(yǎng)情況

由表5可以看出，乳酸菌B3和C3能在pH值2.5～6.5的環(huán)境中生長，說明試驗所篩選2株乳酸菌的酸度耐受范圍比較廣，對外界酸度環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

3 結(jié)論

（1）從不同種植基地來源的菠蘿果皮中初步分離出10株疑似乳酸菌，經(jīng)觸酶試驗、革蘭氏染色試驗、溶鈣圈試驗、糖發(fā)酵試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、運動性試驗等生理生化試驗鑒定，證實其中的2株菌B3和C3具備乳酸菌的基本特征，判斷為乳酸菌。

（2）乳酸菌B3和C3在MRS肉湯培養(yǎng)基中于37℃條件下能良好生長，其對數(shù)生長期均為6～14 h；2株乳酸菌在22～47℃溫度范圍內(nèi)有良好的耐熱能性；在pH值2.5～6.5的環(huán)境中能良好生長，對外界環(huán)境有良好的適應(yīng)能力。

[1]鄭振峰，施偉梅，曾勤.響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸輔助提取菠蘿皮果膠的工藝研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，36（4）：21-33.

[2]張海生.我國菠蘿資源加工利用技術(shù)及研究現(xiàn)狀分析[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013（12）：111-113.

[3]苑艷輝.菠蘿皮的綜合利用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005（2）：11-13.

[4]譚雯文，秦宇.不同方法提取菠蘿皮抑菌物質(zhì)的比較研究[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2015，44（2）：12-15.

[5]王剛，李明，王金麗，等.熱帶農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用現(xiàn)狀與分析——菠蘿廢棄物綜合利用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（1）：23-26.

[6]歐忠慶，張勁，鄧干然，等.菠蘿葉渣厭氧處理制作沼氣試驗[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2003（4）：11-12.

[7]王水泉，包艷，董喜梅，等.植物乳桿菌的生理功能及應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2010，12（4）：49-55.

[8]任大勇，榮鳳君，宮圣潔，等.發(fā)酵食品乳酸菌分離鑒定及功能特性研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（19）：25-27.

[9]Mohammadzadeh H，Khorvash M，Ghorbani G R，et al．Frosted corn silage with or without bacterial inoculants in dairy cattle ration[J].Livestock Science，2012（14）：153-159.

[10]Driehuis F，Qude Eferink S．The impact of the quality of silage on animal health and food safety：a review[J].Veterinary QuarterLy，2000，22（4）：212-216．

[11]張志明，蘇國成，周常義.水果皮渣中乳酸菌的篩選及其對混合青貯飼料品質(zhì)的影響[J].飼料研究，2015（18）：1-5.

[12]Pang H L，Zhang M，Qin G Y.Identification of lactic acid bacteria isolated from corn stovers[J].Animal Science JournaL，2011，82（5）：642-653.

[13]蔣波，房蕊，劉冬玲，等.食品檢測中乳酸菌鑒定方法的探討[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2016（7）：2 740-2 746.

[14]楊柳，張一，陳宇飛.一株用于微生態(tài)飼料發(fā)酵劑的乳酸菌篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].飼料工業(yè)，2016，37（5）：35-38.

[15]邵建寧，彭章普，張文齊，等.尾菜青貯乳酸菌的分離鑒定及其培養(yǎng)條件研究[J].中國釀造，2016，35（11）：123-127.◇

Study of Isolation，Identification and Growth Characteristics of Lactic Acid Bacteria from Pineapple Peel

XIANG Huanling，HE Yanmei，LIN Feng，RAN Ran，CHEN Zhicong，*WANG Ling
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Ten strains of suspected lactic acid bacteria which are initially isolated from pineapple peel that came from three different pineapple planting base.The experiments include catalase test，gram staining，calcium dissolving test，sugar fermentation test，gelatin liquefaction test，indole test，motile test.It is confirmed that the two strains of bacteria（B3and C3）have the basic characteristics of lactic acid bacteria and is judged as lactic acid bacteria though the identification of biochemistry experiments.The research of grow characterization of this two strains of bacteria showed that the logarithmic period is 6～14 h，having good heat tolerance between temperature range from 22～47℃and growing well within pH 2.5～6.5 range.In short，two strains of lactic acid bacteria which are isolated from this experiment have highly adaptability to environment.

pineapple peel；lactic acid bacteria；isolation and identification；grow characterization

TQ914.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.013

1671-9646（2017）06a-0041-04

2017-05-03

廣東海洋大學(xué)2016年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目資助（CXXL2016008）。

香換玲（1995—），女，本科，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：王玲（1965—），女，碩士，副教授，研究方向為食品加工技術(shù)及食品微生物學(xué)方面的教學(xué)與研究。