• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum產(chǎn)油脂發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

    2017-07-31 16:19:42汪洲肖玲玲龔大春
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2017年11期
    關鍵詞:氮源菌體油脂

    汪洲,肖玲玲,龔大春

    (1.三峽大學生物催化重點實驗室,湖北宜昌443002;2.湖北三峽職業(yè)技術學院,湖北宜昌443002)

    皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum產(chǎn)油脂發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

    汪洲1,肖玲玲2,*龔大春1

    (1.三峽大學生物催化重點實驗室,湖北宜昌443002;2.湖北三峽職業(yè)技術學院,湖北宜昌443002)

    對皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂培養(yǎng)基中的碳氮源種類及添加量、KH2PO4添加量、接種量等影響因素進行優(yōu)化。試驗表明,葡萄糖為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,在葡萄糖40 g/L,蛋白胨1.33 g/L,KH2PO4質量濃度1.0 g/L,最佳接種量15%時,油脂得率可達到細胞干質量的62%,比優(yōu)化前提高了50%。

    皮狀絲孢酵母;油脂;培養(yǎng)基;優(yōu)化

    生物柴油是以生物質資源為原料加工而成的一種液態(tài)燃料[1],是最重要的清潔燃料之一,也是最有發(fā)展前景的柴油替代燃料。生物柴油一般由各種動、植物油脂經(jīng)酯化工藝而得,而微生物油脂的脂肪酸組成與植物油相近,以C16和C18系脂肪酸為主,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂具有原料豐富、價格便宜、生長周期短等優(yōu)點,且不受場地、季節(jié)、氣候的影響,一年四季均可發(fā)酵生產(chǎn)[2-4]。

    研究發(fā)現(xiàn),不同種屬的微生物具有不同含油量、油脂組成及相對脂肪酸的含量,而皮狀絲孢酵母具有較高的產(chǎn)油能力。就同一種微生物菌株而言,如果培養(yǎng)條件不同,那么其產(chǎn)油量、油脂脂肪酸組成成分及各種脂肪酸的相對含量也不一定相同,任何培養(yǎng)條件的變化都會對最終的產(chǎn)脂量造成直接或間接的影響[5-7]。因此,試驗對皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂培養(yǎng)基進行優(yōu)化,為生物油脂的中試放大研究提供一定基礎。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 菌種

    皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum),艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    豆芽汁固體斜面培養(yǎng)基:豆芽100 g/L,白砂糖50 g/L,瓊脂20 g/L,水1 000 mL,pH值自然。于121℃下滅菌20 min,備用。

    種子液培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

    基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,蛋白胨1.33 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KH2PO41 g/L。

    1.1.3 種子液的制備

    選取保存于斜面的酵母細胞,于豆芽汁固體斜面培養(yǎng)基上30℃活化培養(yǎng)72 h,用接種環(huán)挑取2環(huán)活化后的酵母細胞接入到50 mL的種子液培養(yǎng)基中,于30℃,180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

    1.1.4 發(fā)酵產(chǎn)油脂的培養(yǎng)

    以10%接種量接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于22℃,轉速140 r/min,pH值8條件下振蕩培養(yǎng)36 h。每組做5個平行試驗。

    1.2 分析方法

    1.2.1 菌體濃度的測量

    試驗采用池度法對菌體濃度進行間接測量。取一定量的培養(yǎng)液,用新鮮培養(yǎng)基稀釋到合適濃度后在紫外分光光度計于波長600 nm處測量吸光度(OD);以新鮮的培養(yǎng)基做空白對照。每個樣品重復測定3次,取其平均值。

    1.2.2 菌體干質量的測量

    試驗采用稱質量法測定菌體干質量,取出一定體積的發(fā)酵液(通常為5 mL)至已烘干稱質量的10 mL離心管中,以轉速10 000 r/min離心5 min,棄上清液,用去離子水洗滌3次,離心去上清液后置于105℃烘箱烘至恒質量,稱質量。菌體干質量的計算公式如下:

    式中:總質量——樣品烘干后的質量,g;管質量——空管子烘干后的質量,g;

    V液——用來測干質量發(fā)酵液的體積,L。

    1.2.3 油脂含量的測量

    試驗采用酸熱——有機溶劑萃取法,對油脂進行提取。量取一定體積的發(fā)酵液,以轉速10 000 r/min離心5 min去上清液,用去離子水洗滌菌體2遍,離心棄上清液。向盛有菌體的離心管中加入適量4 mol/L的HCl溶液浸泡30 min,沸水浴10 min,置于冰上迅速冷卻15 min,再加入3~4倍體積的甲醇-氯仿溶劑(甲醇∶氯仿=1∶2,V/V),混勻后,以轉速180 r/min振蕩1 h,10 000 r/min離心5 min,使有機相和水相迅速分離,用玻璃針管吸取下層有機相至預先烘干稱質量的50 mL圓口燒瓶中,80℃旋轉蒸發(fā)掉有機溶劑,置于烘箱至恒質量,用分析天平稱量得到油脂質量。

    2 結果分析

    2.1 不同碳源對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分之一,可以作為微生物細胞結構或代謝產(chǎn)物中碳價來源的營養(yǎng)物質。為了能利用秸稈糖化液,試驗采用葡萄糖與木糖以不同的比例添加到培養(yǎng)基后,進行皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究。

    不同碳源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表1。

    表1 不同碳源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

    由表1可知,當葡萄糖與木糖的質量濃度比例越大,菌體干質量越大,油脂得率也越高,說明葡萄糖更適宜菌體的生長和油脂的合成,同時結果也表明木糖也能為皮狀絲孢酵母所利用。因此,試驗選擇更能促進菌體生長和油脂合成增加的葡萄糖作為碳源。

    2.2 不同氮源對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    氮源作為培養(yǎng)基中必不可少的部分,一般只提供合成細胞質和細胞中其他結構的原料,不作為能源。氮源又分有機氮源和無機氮源,其中蛋白胨為有機氮源,硫酸銨為無機氮源,又為速效性氮源。不同氮源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表2。

    表2 不同氮源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

    由表2可知,蛋白胨與硫酸銨以不同比例添加到培養(yǎng)基后,觀察皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況,結果顯示有機氮源明顯更促進菌體密度的增大和油脂含量的增大,這是由于有機氮源中含有豐富的蛋白質和氨基酸類物質,能有效地促進菌體生長和產(chǎn)物合成;而無機氮源雖能供菌體生長,卻不利于代謝產(chǎn)物的合成。其中,以蛋白胨為氮源時,油脂得率和菌體干質量在發(fā)酵結束時最大。因此,試驗選擇更能促進菌體生長和油脂合成增加的蛋白胨作為氮源。

    2.3 不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表3。

    由表3可知,隨著碳氮源添加量的增大,菌體干質量減小,但油脂得率隨之增大,說明在適宜的碳氮添加量范圍內有利于油脂的合成增加;隨著葡萄糖和蛋白胨質量濃度的升高,菌體干質量會隨之增大。葡萄糖質量濃度為20~40 g/L時,油脂得率會隨著升高;但質量濃度繼續(xù)升高,油脂得率會隨著降低。說明碳氮源的質量濃度過高,仍能有利于皮狀絲孢酵母的大量繁殖,但同時會增大發(fā)酵液黏度,從而影響溶解氧體積分數(shù),引起菌體的代謝異常,最后影響油脂的合成。結果表明,葡萄糖40 g/L,蛋白胨1.33 g/L為最佳碳氮源組合,油脂得率最高可達59.77%。

    2.4 不同KH2PO4質量濃度對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    KH2PO4是微生物生長和代謝所需的磷酸鹽和鉀鹽的重要來源,磷是某些蛋白質和核酸的組成成分。腺二磷(ADP)、腺三磷(ATP)是重要的能量傳遞者,參與一系列的代謝反應。磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。微生物對磷的需要量一般為0.005~0.010 mol/L。鉀不參與細胞結構物質的組成,它是許多酶的激活劑。將KH2PO4以不同質量濃度添加到培養(yǎng)基后,研究皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況。

    不同KH2PO4質量濃度對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表4。

    表3 不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

    表4 不同KH2PO4質量濃度對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

    由表4可知,當KH2PO4質量濃度從0增加至1.0 g/L時,菌體干質量和油脂含量會隨著KH2PO4質量濃度的增加而增大,說明適宜的KH2PO4質量濃度會促進皮狀絲孢酵母的生長和產(chǎn)物的合成;但隨著KH2PO4質量濃度繼續(xù)增大,菌體干質量和油脂得率反而降低,說明過量的KH2PO4會抑制菌體的生長和產(chǎn)物的合成,并且浪費資源。因此,確定KH2PO4質量濃度1.0 g/L時為最佳。

    2.5 接種量對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

    接種量決定了生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。通常接種量過小,除了延長發(fā)酵周期外,往往還引起其他不正常情況;接種量過高,會使菌體生長過快,培養(yǎng)液黏度過高,造成供氧不足,影響發(fā)酵水平。

    接種量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表5。

    表5 接種量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

    由表5可知,接種量在5%~15%時,隨著接種量的增加,菌體干質量增大,油脂得率也增大;接種量過大,會增加生產(chǎn)成本,20%的接種量對產(chǎn)油脂貢獻增加不大。因此,確定接種量為15%。

    2.6 優(yōu)化條件下產(chǎn)油脂試驗

    通過以上培養(yǎng)基條件優(yōu)化,在葡萄糖40 g/L,蛋白胨1.33 g/L,KH2PO4質量濃度1.0 g/L,接種量15%時,油脂得率可達到細胞干質量的62%。

    3 結論

    通過對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂條件中的不同碳氮源種類及添加量、KH2PO4質量濃度、接種量進行優(yōu)化,結果表明葡萄糖為最佳碳源,蛋白胨為最佳氮源,且在葡萄糖40 g/L,蛋白胨1.33 g/L,KH2PO4質量濃度1.0 g/L,接種量15%時,油脂得率可達到細胞干質量的62%,比優(yōu)化前提高了50%。

    [1]邱松山,王彥安,林夢紅.發(fā)酵荔枝渣制備微生物油脂[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(8):116-120.

    [2]陳士華,孫強,孫莉云.一株高產(chǎn)油脂微生物菌種的篩選與鑒定[J].河南工業(yè)大學學報(自然科學版),2013,34(6):65-68.

    [3]袁錦云,艾佐佐,張志斌.皮狀絲孢酵母B3利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂[J].生物工程學報,2011,27(3):453-460.

    [4]崔丁維,胡學超,包珊珊,等.酶法破碎微生物細胞的研究進展[J].微生物學通報,2010,37(11):1 672-1 678.

    [5]Gao Z,Ma Y Q,Wang Q H,et al.Effect of crude glycerol impurities on lipid preparation by Rhodosporidium toruloides yeast 32489[J].Bioresource Technology,2016(8):373-379.

    [6]孔凡敏,趙祥穎,田延軍,等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造,2010(5):143-146.

    [7]王敏,李市場,劉紅霞,等.粘紅酵母Rhodotorula glulinis微生物油脂提取工藝研究[J].中國糧油學報,2010,25(6):71-75.◇

    Optimization of Fermentation Medium for Lipid Production from Trichosporon cutaneum

    WANG Zhou1,XIAO Lingling2,*Gong Dachun1
    (1.Key Lab of Biocatalysis,China Three Gorges University,Yichang,Hubei 443002,China;2.Hubei Three Gorges Polytechnic,Yichang,Hubei 443002,China)

    The effective factors of carbon and nitrogen source,carbon and nitrogen amount,KH2PO4amount,different inoculation volume on lipid production from Trichosporon cutaneum are optimized.The results show that the glucose is the best carbon source,peptone is the best nitrogen source.The lipid yield can be up to 62%under the conditions of glucose 40 g/L,peptone 1.33 g/L,KH2PO41.0 g/L,the inoculation volume 15%with increasing 50%than before.

    Trichosporon cutaneum;lipid;medium;optimization

    Q93

    A

    10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2017.06.003

    1671-9646(2017)06a-0009-03

    2017-05-07

    宜昌市科技攻關項目“纖維素糖化制備微生物柴油的工藝研究”(A15-301-B04)。

    汪洲(1989—),男,在讀碩士,研究方向為微生物發(fā)酵。

    *通訊作者:龔大春(1967—),男,博士,教授,碩士生導師,研究方向為微生物育種、發(fā)酵及新型酶制劑。

    猜你喜歡
    氮源菌體油脂
    《中國油脂》征訂啟事
    菌體蛋白精養(yǎng)花鰱高產(chǎn)技術探析
    東北酸菜發(fā)酵過程中菌體的分離與鑒定
    A taste of Peking duck
    中國油脂
    歡迎訂閱2019年《中國油脂》
    菌體蛋白水解液應用于谷氨酸發(fā)酵的研究
    中國調味品(2017年2期)2017-03-20 16:18:21
    黃芩苷對一株產(chǎn)NDM-1大腸埃希菌體內外抗菌作用的研究
    無機氮源對紅曲霉調控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    国产成人啪精品午夜网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 十八禁高潮呻吟视频| 老司机在亚洲福利影院| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品国产一区二区三区四区第35| 自线自在国产av| 日韩一区二区三区影片| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲精品在线美女| 丁香六月天网| 精品国产一区二区三区四区第35| 电影成人av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲成人免费电影在线观看| 宅男免费午夜| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产午夜精品久久久久久| 新久久久久国产一级毛片| 超碰97精品在线观看| 午夜免费成人在线视频| 少妇精品久久久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 另类精品久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 少妇 在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲第一av免费看| 亚洲 欧美一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品.久久久| 国产不卡av网站在线观看| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品自拍成人| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜老司机福利片| 最新在线观看一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 丰满饥渴人妻一区二区三| 999久久久精品免费观看国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 婷婷成人精品国产| 伦理电影免费视频| 成人精品一区二区免费| 我要看黄色一级片免费的| 日韩中文字幕欧美一区二区| 午夜福利一区二区在线看| 夜夜爽天天搞| 成人影院久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日本黄色日本黄色录像| 日本wwww免费看| 午夜福利视频精品| 丁香欧美五月| 国产免费福利视频在线观看| 伦理电影免费视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 大香蕉久久网| 成人国产av品久久久| 少妇精品久久久久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国精品久久久久久国模美| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美激情久久久久久爽电影 | 天堂俺去俺来也www色官网| 怎么达到女性高潮| 一二三四社区在线视频社区8| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲九九香蕉| 国产黄色免费在线视频| 69精品国产乱码久久久| 两人在一起打扑克的视频| 高清在线国产一区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 咕卡用的链子| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区有黄有色的免费视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久久久视频综合| 午夜两性在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人国产av品久久久| 日韩欧美免费精品| 成人18禁在线播放| 悠悠久久av| 国产精品.久久久| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产一卡二卡三卡精品| 久9热在线精品视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 老熟女久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品熟女久久久久浪| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久国产精品影院| 国产精品.久久久| 桃花免费在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 91精品三级在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品影院久久| 国产福利在线免费观看视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲免费av在线视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产欧美日韩一区二区三| 91国产中文字幕| 成人精品一区二区免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产色视频综合| 日日夜夜操网爽| 十八禁高潮呻吟视频| 高清黄色对白视频在线免费看| av一本久久久久| 999久久久精品免费观看国产| 久久久国产精品麻豆| 国产成人欧美在线观看 | 18禁国产床啪视频网站| 两人在一起打扑克的视频| 9热在线视频观看99| 欧美午夜高清在线| aaaaa片日本免费| 老司机亚洲免费影院| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本av免费视频播放| 亚洲成人手机| 丁香欧美五月| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线观看舔阴道视频| 国产真人三级小视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一本综合久久免费| 高清视频免费观看一区二区| 成人国产av品久久久| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲精品一区二区www | 波多野结衣一区麻豆| 热re99久久国产66热| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美日韩视频精品一区| 757午夜福利合集在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产单亲对白刺激| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久国产精品麻豆| 大片电影免费在线观看免费| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲avbb在线观看| 国产精品影院久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久国产欧美日韩av| 黄片大片在线免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 伦理电影免费视频| 国产深夜福利视频在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| av不卡在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 大码成人一级视频| 国产亚洲一区二区精品| 69av精品久久久久久 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 正在播放国产对白刺激| 欧美日韩黄片免| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 老司机午夜福利在线观看视频 | 一本综合久久免费| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久久网色| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一区在线观看完整版| 我的亚洲天堂| 国产高清视频在线播放一区| 黄色视频不卡| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲中文日韩欧美视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩一级在线毛片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| netflix在线观看网站| 波多野结衣av一区二区av| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品一区二区在线观看99| 国产一区二区在线观看av| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av网站在线播放免费| 国产精品1区2区在线观看. | 悠悠久久av| 大香蕉久久网| 久久这里只有精品19| 咕卡用的链子| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男女下面插进去视频免费观看| 人妻久久中文字幕网| 婷婷成人精品国产| 午夜福利在线观看吧| 99九九在线精品视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 曰老女人黄片| av天堂在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 69av精品久久久久久 | 韩国精品一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 国产97色在线日韩免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 最近最新免费中文字幕在线| 一级毛片女人18水好多| 乱人伦中国视频| 久久人妻熟女aⅴ| 久久影院123| 久久精品国产a三级三级三级| 在线看a的网站| www.熟女人妻精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区| 深夜精品福利| 久久亚洲真实| 亚洲精品国产一区二区精华液| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一区福利在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 色视频在线一区二区三区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机午夜福利在线观看视频 | 免费看十八禁软件| 国产在视频线精品| 视频区欧美日本亚洲| 久久ye,这里只有精品| 色在线成人网| 操美女的视频在线观看| 亚洲 国产 在线| 最新的欧美精品一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 老司机靠b影院| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕 | 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品久久久久久精品电影小说| 无遮挡黄片免费观看| 黄频高清免费视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品99久久99久久久不卡| a级片在线免费高清观看视频| 最黄视频免费看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产xxxxx性猛交| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费观看av网站的网址| 日韩免费高清中文字幕av| 美女高潮到喷水免费观看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩三级视频一区二区三区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产区一区二久久| 高清av免费在线| 久久久久久久国产电影| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 2018国产大陆天天弄谢| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 岛国毛片在线播放| 久久久久视频综合| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人妻 亚洲 视频| 免费不卡黄色视频| 久久久精品区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 十八禁人妻一区二区| 怎么达到女性高潮| 老熟女久久久| av网站免费在线观看视频| 国产99久久九九免费精品| 久久久国产欧美日韩av| 69av精品久久久久久 | 丁香欧美五月| 黄色视频,在线免费观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 成年人黄色毛片网站| 一本久久精品| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 99国产综合亚洲精品| 久久 成人 亚洲| 91精品三级在线观看| 91大片在线观看| 久久亚洲精品不卡| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 一区福利在线观看| 国产男女内射视频| 精品一品国产午夜福利视频| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲欧洲日产国产| 另类亚洲欧美激情| 搡老乐熟女国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看一区二区三区激情| 一级片'在线观看视频| 国产成人系列免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 99久久国产精品久久久| 韩国精品一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 少妇精品久久久久久久| 成人国语在线视频| 亚洲第一av免费看| 高清av免费在线| 国产不卡一卡二| 一级片'在线观看视频| 国产真人三级小视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人妻一区二区av| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av美国av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品粉嫩美女一区| 大片免费播放器 马上看| av有码第一页| 咕卡用的链子| 男女免费视频国产| 9热在线视频观看99| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇 在线观看| 中国美女看黄片| 女同久久另类99精品国产91| 欧美精品一区二区免费开放| 成人av一区二区三区在线看| 午夜老司机福利片| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕色久视频| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 1024香蕉在线观看| 久久青草综合色| 国产在线免费精品| 精品久久久精品久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产福利在线免费观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 又大又爽又粗| 悠悠久久av| 国产成人av教育| 日本五十路高清| 在线av久久热| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久影院123| 99精品欧美一区二区三区四区| xxxhd国产人妻xxx| 免费高清在线观看日韩| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美精品一区二区大全| 99国产精品一区二区三区| 国产三级黄色录像| 人人澡人人妻人| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 91精品三级在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费观看av网站的网址| 一二三四在线观看免费中文在| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲av成人一区二区三| 黄频高清免费视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品成人在线| 18禁观看日本| 狂野欧美激情性xxxx| av在线播放免费不卡| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 99热网站在线观看| h视频一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费在线观看完整版高清| 看免费av毛片| 亚洲九九香蕉| 久热爱精品视频在线9| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线观看人妻少妇| 黑人猛操日本美女一级片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲全国av大片| e午夜精品久久久久久久| 久久狼人影院| 亚洲情色 制服丝袜| 在线天堂中文资源库| 在线观看舔阴道视频| 69av精品久久久久久 | 国产一区二区在线观看av| 在线观看一区二区三区激情| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日本五十路高清| av网站在线播放免费| 亚洲第一青青草原| 亚洲午夜理论影院| 一级片免费观看大全| 国产一区二区三区视频了| 亚洲国产av新网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 90打野战视频偷拍视频| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩视频精品一区| 在线观看人妻少妇| 久久av网站| 国精品久久久久久国模美| 日韩欧美免费精品| 亚洲欧美激情在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av在线播放免费不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利免费观看在线| 精品福利观看| 99精品久久久久人妻精品| 波多野结衣av一区二区av| av一本久久久久| 亚洲中文av在线| www日本在线高清视频| 18在线观看网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲av美国av| 国产在视频线精品| 嫁个100分男人电影在线观看| 嫩草影视91久久| 婷婷丁香在线五月| 亚洲久久久国产精品| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 日本a在线网址| 美女国产高潮福利片在线看| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级片免费观看大全| 精品国产国语对白av| 露出奶头的视频| 午夜福利视频精品| 国产精品九九99| 成人精品一区二区免费| 美女高潮到喷水免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲成人手机| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产在视频线精品| 欧美激情高清一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 91精品三级在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久欧美国产精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线永久观看黄色视频| 正在播放国产对白刺激| 午夜福利,免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 97在线人人人人妻| 国产高清国产精品国产三级| 国产在线免费精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 视频区图区小说| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 在线 av 中文字幕| 夜夜爽天天搞| 国产精品亚洲一级av第二区| 一区二区三区精品91| 一级片'在线观看视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品九九99| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利,免费看| 亚洲情色 制服丝袜| 女人久久www免费人成看片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 69av精品久久久久久 | 亚洲九九香蕉| 欧美性长视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av日韩在线播放| 黄色成人免费大全| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 后天国语完整版免费观看| 中文字幕制服av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费日韩欧美在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲视频免费观看视频| 人妻久久中文字幕网| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美在线黄色| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 丁香六月天网| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产精品一区二区在线观看99| 高清欧美精品videossex| 精品国产乱码久久久久久男人| 99国产精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲色图av天堂| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜91福利影院| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久久久成人av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一二三四在线观看免费中文在| 女性生殖器流出的白浆| 搡老熟女国产l中国老女人| 90打野战视频偷拍视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 高清欧美精品videossex| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 超色免费av| 嫩草影视91久久| 成人三级做爰电影| 国产免费av片在线观看野外av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 90打野战视频偷拍视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品1区2区在线观看. | 久久人妻熟女aⅴ| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 一个人免费看片子| 国产片内射在线| 国产午夜精品久久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 蜜桃在线观看..| 757午夜福利合集在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码|