前體氨基酸對赤霞珠干紅葡萄酒中生物胺含量的影響

張凱婷，王瑞，翟銀成，趙賓賓，馬雪蕾，張珍珍*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.昌吉市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉831100）

前體氨基酸對赤霞珠干紅葡萄酒中生物胺含量的影響

張凱婷1，王瑞1，翟銀成2，趙賓賓1，馬雪蕾1，張珍珍1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.昌吉市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，新疆昌吉831100）

以新疆地產(chǎn)赤霞珠果實為原料，在葡萄汁中分別加入不同濃度的7種前體氨基酸，進(jìn)行酒精發(fā)酵與蘋果酸-乳酸發(fā)酵。通過高效液相色譜法的分析檢測，了解前體氨基酸對葡萄酒中8種生物胺含量的影響。結(jié)果表明，前體氨基酸對葡萄酒中生物胺的含量產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)加入質(zhì)量濃度為40 mg/L和100 mg/L的組氨酸時，組胺含量由1.04 mg/L減少為0.20 mg/L和0.35 mg/L；而當(dāng)加入色氨酸、精氨酸和鳥氨酸時，會使色胺和腐胺的含量有所降低，當(dāng)加入300 mg/L質(zhì)量濃度的精氨酸時，腐胺含量由1.45 mg/L減少至0.63 mg/L。當(dāng)葡萄酒中加入同一種氨基酸時，對葡萄酒中不同的生物胺含量的影響也不盡相同。

葡萄酒；前體氨基酸；生物胺；含量變化

生物胺是普遍存在于發(fā)酵食品中的一種含氮有機物，低濃度的生物胺在生物體的正常生理活動中起到一定的作用，但人體若攝入過量的生物胺，則會出現(xiàn)頭暈、心悸等癥狀，嚴(yán)重時還會危及生命[1]。發(fā)酵食品中及酒精類食品中常見的生物胺主要有組胺、尸胺、腐胺等單胺，其中組胺和酪胺被認(rèn)為對人體的危害最大[2]，部分國家也對葡萄酒中的組胺含量做了限量范圍：德國≤2 mg/L，比利時5～6 mg/L，瑞士和澳大利亞≤10 mg/L，我國還沒有葡萄酒中組胺含量的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。

葡萄酒發(fā)酵過程中，微生物中的氨基酸脫羧酶使葡萄汁中的游離氨基酸在脫去羧基產(chǎn)生生物胺，葡萄酒的發(fā)酵環(huán)境也有助于氨基酸脫羧酶的活動[4-6]。為了解前體氨基酸與葡萄酒中生物胺含量的關(guān)系，本實驗以新疆地產(chǎn)赤霞珠葡萄為試材釀制葡萄酒，采用高效液相色譜（high performanceliquidchromatography，HPLC）法檢測出酒樣中組胺、色胺、酪胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、尸胺和腐胺等8種生物胺的含量，研究向葡萄汁發(fā)酵過程中添加不同劑量前體氨基酸對葡萄酒中生物胺含量的影響，為降低葡萄酒潛在安全隱患，減少葡萄酒中生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年新疆昌吉地產(chǎn)赤霞珠葡萄（CabernetSauvignon）；組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸（均為分析純）：加拿大TRC公司；丙酮、甲醇（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；亞精胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺、精胺等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國Sigma公司；氯化鈉、乙醚（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；釀酒活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；乳酸菌：山東圣琪生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200 Series高相液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國Agilent公司；PL303電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D2155W離心機：德國Sigma公司；HS120210漩渦儀：美國Heathrow Vortexer公司；DHG-9053A恒溫箱：上海鴻都電子科技有限公司；CT-6020A pH計：深圳市柯迪達(dá)電子有限公司；0.22 μm孔徑有機相濾膜：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：原料經(jīng)除梗破碎后，在葡萄汁中分別添加組氨酸（組胺前體）0、20 mg/L、40 mg/L和100 mg/L；色氨酸（羥色胺前體）0、15 mg/L、30 mg/L和75 mg/L；苯丙氨酸（苯乙胺前體）0、15mg/L、30mg/L和75mg/L；精氨酸（腐胺、亞精胺和精胺的前體）0、300 mg/L、600 mg/L和1 500 mg/L；酪氨酸（酪胺前體）0、15mg/L、30mg/L和75mg/L；鳥氨酸（腐胺、亞精胺和精胺的前體）0、20 mg/L、40 mg/L和100 mg/L；賴氨酸（尸胺前體）0、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L，在發(fā)酵罐中分別添加酵母菌0.2 g/L、乳酸菌0.015 g/L進(jìn)行酒精發(fā)酵和蘋果酸-乳酸發(fā)酵，酒精發(fā)酵的溫度控制在22～25℃，蘋果酸-乳酸發(fā)酵的溫度控制在18～22℃，蘋果酸-乳酸發(fā)酵10d后分別取樣100mL，新鮮的葡萄酒樣置于-40℃冰箱。

1.3.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

分別稱量生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解并定容至10 mL，封口后避光保存至4℃冰箱中。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL于同一容量瓶中，同樣用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至10 mL，即為生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。再量取生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL分別置于不同的容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL，分別使其質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0 mg/L、50.0 mg/L，待衍生。

1.3.3 樣品提取液的配制

量取葡萄酒樣品10 mL，分別向其中加入NaCl至飽和，取飽和后的試樣5 mL于15 mL的離心管中，將該溶液的pH調(diào)節(jié)為12后，加入正丁醇∶氯仿（1∶1，V/V）5 mL進(jìn)行萃取，3 600 r/min離心10 min后，移取上層清液。再重復(fù)2次萃取后，合并萃取液，混勻。吸取3 mL的萃取液，向其中添加1 mol/L的HCl溶液0.3 mL?；靹蚝笤?0℃水浴條件下氮氣吹干，加入0.1 mol/L的鹽酸溶液1 mL溶解，待衍生。

1.3.4 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液的衍生

分別量取生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.5 mL于具塞試管中，加入1.5mL的飽和碳酸氫鈉溶液和1mL丹磺酰氯衍生溶液，混勻后在60℃條件下避光反應(yīng)30 min，再向其加入100 μL谷氨酸鈉溶液后振蕩混勻，60℃條件下反應(yīng)15 min后，分別加入1 mL的超純水，40℃水浴條件下用氮吹儀去除丙酮。最后分別加入3 mL乙醚，并漩渦振蕩2 min，靜置至分層后吸取上層乙醚層，重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液。在40℃的條件下氮氣吹干，加入1 mL的甲醇溶液溶解殘留物，混勻后直接用0.22 μm有機相濾膜過濾，濾液待HPLC檢測。

樣品提取液的衍生與生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生條件及方法相同。

1.3.5 高效液相色譜條件

色譜條件：Agilent XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 nm，5 μm），柱溫30℃，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量為20 μL，流動相A：99.99%甲醇溶液，流動相B：超純水，流速：1.5 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

1.3.6 定性定量分析

定性分析：同一色譜條件下，分別比對8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC出峰時間，對葡萄酒樣品中的各生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過計算HPLC色譜檢測葡萄酒樣品中各生物胺的峰面積，依照8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計算葡萄酒樣品中各生物胺的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度前體酪氨酸對酪胺的影響

酪胺對人類健康有一定影響，其前體氨基酸為酪氨酸[7-9]。由圖1可知，不同質(zhì)量濃度外源酪氨酸的加入對葡萄酒中酪胺含量有一定的影響。在沒有外來酪氨酸的加入時，葡萄酒中酪胺的含量為1.39 mg/L，而加入外源酪氨酸質(zhì)量濃度為15 mg/L時，葡萄酒中酪胺含量顯著高于空白對照組（CK）的葡萄酒（P＜0.05），達(dá)到了1.94 mg/L，而隨著酪氨酸濃度的增加，酪胺的含量先下降后上升。當(dāng)前體酪氨酸的質(zhì)量濃度為75mg/L時，葡萄酒中酪胺含量與空白對照組間差異不顯著（P＞0.05），但與其他兩組葡萄酒中的酪胺含量差異顯著（P＜0.05），說明酪氨酸的加入在一定條件下影響了酪胺的生成和積累。

圖1 不同質(zhì)量濃度酪氨酸對酪胺含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of tyrosine on tyramine contents

2.2 不同質(zhì)量濃度前體賴氨酸對尸胺的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度賴氨酸對尸胺含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of lysine on cadaverine contents

尸胺的氨基酸前體為賴氨酸[10-11]，由圖2可知，當(dāng)加入前體賴氨酸的質(zhì)量濃度為10 mg/L時，葡萄酒中尸胺含量相較于空白對照組（CK）組有顯著差異（P＜0.05），其含量遠(yuǎn)高于CK組中尸胺的含量。但加入賴氨酸的質(zhì)量濃度為20 mg/L和50 mg/L時，葡萄酒中尸胺的含量與CK組間差異不顯著（P＞0.05），說明前體賴氨酸的加入在一定濃度范圍時可以影響葡萄酒中尸胺的含量。

2.3 不同質(zhì)量濃度前體苯丙氨酸對苯乙胺的影響

由圖3可知，在沒有苯丙氨酸加入時，葡萄酒中苯乙胺含量為2.01 mg/L，當(dāng)加入不同濃度外源苯丙氨酸時，苯乙胺含量相對于空白對照組（CK）組均有所增加，且各試驗組相互之間存在顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)外源苯乙氨酸的質(zhì)量濃度為15 mg/L和75 mg/L時，葡萄酒中苯乙胺含量明顯高于CK組，但當(dāng)外源苯乙氨酸的質(zhì)量濃度為30 mg/L時，葡萄酒中苯乙胺含量雖高于CK組，卻明顯低于其他兩組（P＜0.05）。說明外源苯丙氨酸的加入對苯乙胺生成有促進(jìn)作用，但與外源苯丙氨酸的質(zhì)量濃度無關(guān)。

圖3 不同質(zhì)量濃度苯丙氨酸對苯乙胺含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of phenylalanine on phenethylamine contents

2.4 不同質(zhì)量濃度前體組氨酸對組胺的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度組氨酸對組胺含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of histidine on histamine contents

葡萄酒中組胺對人體危害較大，攝入量超過一定范圍時，即會產(chǎn)生中毒癥狀。其氨基酸前體為組氨酸[12-14]。由圖4可知，空白對照組（CK）酒樣中組胺含量為1.04 mg/L，當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/L外源組氨酸的加入時，葡萄酒中組胺含量有所增加，達(dá)到1.14 mg/L。但當(dāng)加入的組氨酸質(zhì)量濃度變?yōu)?0 mg/L和100 mg/L時，葡萄酒中組胺含量顯著減少（P＜0.05），且不高于0.4 mg/L?？梢钥闯觯尤胭|(zhì)量濃度在40～100 mg/L的外源組氨酸時，對葡萄酒中組胺的生成有一定的抑制作用，不利于組胺在葡萄酒中的合成和積累。

2.5 不同濃度前體色氨酸對羥色胺含量的影響

由圖5可知，加入不同質(zhì)量濃度的色氨酸時，各試驗組間差異顯著（P＜0.05）。相較于空白對照組（CK）酒樣，加入外源色氨酸時，葡萄酒中羥色胺的含量顯著下降（P＜0.05）。而隨著葡萄酒中色氨酸質(zhì)量濃度的增加，葡萄酒中羥色胺的含量也有所減少。在CK組酒樣中檢測到的羥色胺的含量為66.19 mg/L，而當(dāng)加入色氨酸質(zhì)量濃度為1 500 mg/L時，羥色胺含量為16.27 mg/L。說明色氨酸的加入與羥色胺的合成有一定的關(guān)聯(lián)。

圖5 不同質(zhì)量濃度色氨酸對羥色胺含量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of tryptophan on hydroxytryptamine contents

2.6 不同質(zhì)量濃度前體精氨酸的加入對生物胺的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度精胺酸對腐胺(a)、亞精胺(b)和精胺(c)含量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of arginine on putrescine (a),spermidine(b)and spermine(c)contents

葡萄酒中精氨酸同時為腐胺、亞精胺和精胺的前體氨基酸[15]，由圖6可知，葡萄酒中加入同種精氨酸時，對葡萄酒中腐胺、亞精胺和精胺均產(chǎn)生不同的影響。其中，相對于空白對照組（CK）組葡萄酒，外來精氨酸的加入使葡萄酒中的腐胺含量減少，使亞精胺和精胺的含量有所增加（P＜0.05）。且隨著精氨酸質(zhì)量濃度的提升，葡萄酒中精胺含量也隨之減少。生物胺的合成是一個復(fù)雜的過程，在一定范圍內(nèi)，精氨酸的加入有利于亞精胺和精胺積累但同時能夠抑制腐胺的生成。

2.7 不同質(zhì)量濃度前體鳥氨酸的加入對生物胺的影響

圖7 不同質(zhì)量濃度鳥氨酸對腐胺(a)、亞精胺(b)和精胺(c)含量的影響Fig.7 Effects of different concentrations of ornithine on putrescine (a),spermidine(b)and spermine(c)contents

鳥氨酸也為腐胺、精胺、亞精胺共同的前體氨基酸[16]，與精氨酸相同的是，鳥氨酸的加入同樣也會使葡萄酒中的腐胺含量有所降低，使葡萄酒中亞精胺和精胺含量上升。但與精氨酸不同的是，加入不同質(zhì)量濃度鳥氨酸時，各組間葡萄酒中腐胺含量差異不顯著（P＞0.05），而精胺和亞精胺則都是在外源鳥氨酸質(zhì)量濃度為20mg/L時含量最高，且在加入的鳥氨酸質(zhì)量濃度為40mg/L時有所下降，但均不低于空白對照組（CK）的酒樣中精胺和亞精胺的含量。且當(dāng)外源鳥氨酸的質(zhì)量濃度為100 mg/L時，這兩種生物胺的含量又有所上升。故不同的氨基酸前體的加入對亞精胺、腐胺和精胺的生成都有一定程度的影響作用，但其濃度對其的影響未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，影響程度和方式也有所區(qū)別。

3 結(jié)論

本實驗通過向葡萄汁中添加不同濃度的7種氨基酸分別發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對葡萄酒中的8種生物胺含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，加入不同濃度的前體氨基酸對葡萄酒中各生物胺含量造成不同程度的影響。其中，加入低質(zhì)量濃度的酪氨酸、賴氨酸、組胺和苯丙氨酸時，其對應(yīng)生物胺含量有所上升，但并未隨著外源氨基酸質(zhì)量濃度的升高而增加。當(dāng)組氨酸質(zhì)量濃度為40 mg/L和100 mg/L時，葡萄酒中組胺含量則會明顯減少，只有0.20 mg/L和0.35 mg/L。而當(dāng)加入羥色胺和腐胺的前體氨基酸時，會使這兩種生物胺的含量有所降低，腐胺尤為明顯，當(dāng)加入質(zhì)量濃度300 mg/L的精氨酸時，其含量由1.45mg/L減少至0.63mg/L，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其含量與外源氨基酸的質(zhì)量濃度無關(guān)。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄酒中加入同一種氨基酸時，對葡萄酒中不同的生物胺含量的影響也不盡相同。生物胺是由相應(yīng)前體物氨基酸在脫縮酶作用下經(jīng)過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來，由此可見葡萄酒中前體氨基酸會影響葡萄酒中各生物胺生成和轉(zhuǎn)化，各生物胺及氨基酸相互間的轉(zhuǎn)化也會影響葡萄酒中生物胺的含量。

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Effects of precursor amino acids on biogenic amines contents in Cabernet Sauvignon dryred wine

ZHANG Kaiting1,WANG Rui1,ZHAI Yincheng2,ZHAO Binbin1,MA Xuelei1,ZHANG Zhenzhen1*
(1.College of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Changji City Agricultural Products Quality and Safety Inspection and Testing Center,Changji 831100,China)

Using the fruits of Xinjiang Cabernet Sauvignon as raw material,with different concentrations of seven precursor amino acids addition in grape juice,the alcohol fermentation and malolactic fermentation were performed.The effects of precursor amino acids on the contents of 8 kinds of biogenic amines in wine were tested by HPLC.The results showed that:the precursor amino acid had some effect on biogenic amines content in wine.When 40 mg/L and 100 mg/L histidine was added to the wine,the histamine contents were significantly reduced,from 1.04 mg/L to 0.20 mg/L and 0.35 mg/L,respectively.When tryptophan,arginine and ornithine were added,the content of tryptamine and putrescine in wine decreased.When 300 mg/L arginine was added to wine,the putrescine content reduced from 1.45 mg/L to 0.63 mg/L.When the same amino acid was added to the wine,the effects on each biogenic amine in the wine were different.

wine;precursor amino acid;biogenic amine;content change

N34

0254-5071（2017）07-0148-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.032

2017-04-14

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項目（2015211A024）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201610758082，201610758170）

張凱婷（1996-），女，本科生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

*通訊作者：張珍珍（1984-），女，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。