透明質(zhì)酸添加對細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的影響

丁勇，張岢薇，邵明亮，羅倉學*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

透明質(zhì)酸添加對細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的影響

丁勇，張岢薇，邵明亮，羅倉學*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

為改善干態(tài)細菌纖維素（BC）的復水率，研究在發(fā)酵過程中添加透明質(zhì)酸（HA）對BC膜性質(zhì)的影響，并通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X-射線衍射（XRD）、熱重分析（TGA）表征HA-BC復合膜的性質(zhì)。結(jié)果表明，與未添加HA的BC膜相比，發(fā)酵前添加1 g/L的HA能夠有效提高BC膜的復水性，復水率最高為23.58%，發(fā)酵過程中pH、還原糖、可溶性固形物變化趨勢與未添加HA組相似，HA的添加對BC的合成過程影響不大。FTIR結(jié)果表明，HA與BC形成了復合膜；TGA與XRD結(jié)果顯示，HA-BC復合膜的熱穩(wěn)定性提高，結(jié)晶度降低，導致其復水率增加。研究結(jié)果表明，添加HA能夠生產(chǎn)復水率較高、熱穩(wěn)定性較好的HA-BC復合物。

細菌纖維素；復水率；透明質(zhì)酸；傅里葉變換紅外光譜；X-射線衍射；熱重分析

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）又稱納塔（Natta），是一類由微生物發(fā)酵合成的纖維素的總稱[1]。作為一種天然高分子納米結(jié)構(gòu)材料，其具有純度高、機械性能好、可塑性強以及含水率高、生物相容性好、生物可降解等特性，因此在食品、生物醫(yī)藥、造紙工業(yè)、音響器材、化妝品、膜濾器等領(lǐng)域被廣泛應用，具有良好的經(jīng)濟和社會效益。但BC濕膜含水率高，運輸困難，成本成倍增加，對BC膜進行干燥處理是有效的解決辦法。然而，干燥后的BC膜復水性僅占原來的12%～16%[2]，相應的納米級三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)改變，結(jié)晶度增大，楊氏模量增加，硬度提高，很大程度上破壞BC膜的優(yōu)良性能，干態(tài)BC膜的復水與持水力的降低極大地限制了其在食品等行業(yè)的應用。為改善BC膜干燥后性能缺失的現(xiàn)狀，利用BC表面積大且含有大量羥基基團，很容易與其他生物材料產(chǎn)生共價鍵而形成復合物的特點[3]，對BC改性以增強其功能性成為研究熱點之一。趙梓年等[4]利用冷凍-解凍法制備了細菌纖維素/聚乙烯醇雙網(wǎng)絡(luò)復合水凝膠，增強了復合水凝膠的含水率、平衡溶脹比、拉伸強度和壓縮強度?；裘髅鱗5]分別采用浸泡法、生物復合法、交聯(lián)法和凝膠法制備出透明質(zhì)酸-細菌纖維素復合物，發(fā)現(xiàn)不同方法制備的復合材料力學性能提高，結(jié)晶度隨透明質(zhì)酸濃度的升高而降低。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種存在于大多數(shù)哺乳動物組織的氨基葡萄糖，屬于生物活性分子。具備保濕、預防和修復皮膚損傷，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，水電解質(zhì)擴散及運轉(zhuǎn)，潤滑關(guān)節(jié)，促進創(chuàng)傷愈合等功能，可結(jié)合自身400倍以上的水，是自然界中最好的保濕因子[6]。

本研究在BC發(fā)酵過程中添加HA制備HA-BC復合膜及對發(fā)酵過程的影響，以復合膜產(chǎn)量與復水率為評價指標，確定HA的最佳添加時間和添加量，并檢測HA的添加對BC發(fā)酵過程的影響，通過傅里葉變換紅外光譜（Fouriertransforminfraredspectroscopy，F(xiàn)TIR）、X-射線衍射（X-raydiffraction，XRD）、熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）表征原位改性的BC膜，以期改善干態(tài)BC膜的復水性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木醋桿菌（Acetobacter xylinus）DS398：由陜西科技大學食品與生物工程學院發(fā)酵產(chǎn)品實訓中心保藏；蔗糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。透明質(zhì)酸（分析純）：合肥博美生物科技有限責任公司。

培養(yǎng)基[7]：蔗糖40g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，無水硫酸鎂0.5 g/L，檸檬酸2 g/L，pH5.0，無水乙醇10 mL/L。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartorious BSA323電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHS-2C酸度計：上海雷磁儀器科技有限公司；MASTER-M手持糖度儀：日本Atago公司；722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司；VECTOR-22傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）：德國Bruker公司；D/max2200PC型X射線衍射儀：日本理學科技有限公司；TGA Q500熱重分析儀：美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 BC的發(fā)酵生產(chǎn)與純化

采取普通培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)BC，裝液量100 mL/250 mL，接種量5%，29℃條件下靜置培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束后取出BC膜用蒸餾水多次沖洗，去除表面雜質(zhì)后，再浸入0.1 mol/L的NaOH溶液中，煮沸2 h，除去殘存的菌體和培養(yǎng)基，直至膜呈乳白色半透明狀。后用質(zhì)量分數(shù)為1%醋酸和蒸餾水反復沖洗至中性，浸入蒸餾水中冷藏（溫度4℃）保存待用。

1.3.2 HA-BC膜的制備

（1）HA添加時間對BC膜產(chǎn)量和復水性的影響

分別在發(fā)酵時間0、1 d、2 d、3 d、4 d加入0.5 g/L HA。發(fā)酵5 d后取出HA-BC復合膜，進行純化處理，采用真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，并對HA-BC復合膜產(chǎn)量、和復水率進行比較。

（2）HA添加量對BC膜產(chǎn)量和復水率的影響

接種前在無菌環(huán)境中加入不同添加量HA（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L），發(fā)酵5 d結(jié)束取出HA-BC復合膜，進行純化處后，采用真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，并對BC-HA復合膜產(chǎn)量、復水率進行比較。

1.3.3 BC膜產(chǎn)量與復水率測定

a.取出純化處理后的BC膜，用濾紙吸干表面水分，直至無水滴滴下，稱質(zhì)量3次，取平均值即為濕質(zhì)量M濕。

b.取出純化處理后BC膜，將膜放置在聚四氟乙烯托盤上，經(jīng)真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，取出稱質(zhì)量3次，取平均值即為BC膜干質(zhì)量M干。

c.將BC干膜浸泡于蒸餾水中，每隔一段時間取出，用濾紙吸去表面殘余水分，稱質(zhì)量直至質(zhì)量不再增加，稱質(zhì)量3次，取平均值即為復水質(zhì)量M復[8]。BC膜產(chǎn)量及復水率計算公式如下：

式中：M為細菌纖維素產(chǎn)量，g/L；V為培養(yǎng)基體積，L。

1.3.4 發(fā)酵過程中指標的測定

在添加HA發(fā)酵BC的過程中每天取樣進行測定。pH值的測定：采用酸度計；可溶性固形物的測定：手持糖度儀；還原糖的測定：3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid colorimetry，DNS）比色法[9]。

1.3.5 HA-BC復合膜的表征

（1）傅里葉變換紅外光譜

將干燥的HA-BC復合膜樣品剪碎研磨，與溴化鉀（KBr）混合壓片，質(zhì)量比1∶200，采用FTIR測試樣品在波數(shù)450～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1，測定樣品圖譜[10]。

3.加強對選拔任用干部工作情況的監(jiān)督檢查。以解決選拔任用干部中的突出問題、提高選人用人的公信度為切入點，重點監(jiān)督檢查被巡視單位違規(guī)違紀用人、拉票、跑官要官、買官賣官等問題，促進被巡視單位防止和克服選人用人上的不正之風。檢查的情況要如實向黨委和組織部門匯報和通報，對重要情況，要及時請示報告。對“跑官要官”的，要嚴肅批評，記錄在案，并取消其被推薦、考察和作為候選人的資格，情節(jié)嚴重的要進行組織處理；對行賄“買官”的，一律先免去職務，再按有關(guān)規(guī)定處理；對受賄“賣官”的，要依紀依法嚴懲；對在民主推薦和選舉中搞拉幫結(jié)派、拉票賄選的，要堅決查處，已經(jīng)提拔的要從領(lǐng)導崗位上撤下來，堅決糾正用人上的不正之風。

（2）結(jié)晶度

X-射線衍射儀檢測HA-BC復合膜的結(jié)晶度。X衍射測試條件：用銅鎳發(fā)射靶，波長λ=0.154 06 nm，加速電場36 kV，電流20 mA，將干燥樣品固定在旋轉(zhuǎn)靶上，掃描步長0.01°，掃描5～60 s，結(jié)晶度掃描速度0.075°/s。結(jié)晶度[11]計算公式如下：

CrI=（I200－Iam）/I200

式中：CrI為結(jié)晶度，%；I200是主結(jié)晶峰200的最大衍射強度，cps；Iam指無定型區(qū)對應峰的強度，cps；（一般指2θ=18～20之間的最低衍射強度）。

（3）熱重分析

熱重分析儀測試HA-BC復合膜的熱穩(wěn)定性能，氮氣（N2）保護，氮氣流速為20 mL/min，升溫速率為10℃/min，溫度范圍為0～600℃[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA添加時間對BC膜產(chǎn)量和復水性影響

分別在不同發(fā)酵時間（0、1 d、2 d、3 d、4 d）加入0.5 g/L HA，BC膜產(chǎn)量（濕質(zhì)量）與復水率變化結(jié)果見圖1。由圖1可知，發(fā)酵時間在0～4 d范圍內(nèi)，隨著HA的添加時間不同，BC膜產(chǎn)量逐漸增大后降低，復水率呈逐漸下降后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵第3天加入HA形成的復合膜產(chǎn)量最高，達到224.25g/L，原因可能是由于HA的加入增大了培養(yǎng)基黏度，在發(fā)酵3 d后加入使得大分子HA黏附在BC表面增加BC膜產(chǎn)量，后期產(chǎn)量降低可能與黏度過大影響B(tài)C合成有關(guān)。發(fā)酵前期加入HA能夠增加BC膜復水率，后期加入復水率較低，可能是因為在發(fā)酵后期加入的HA是依靠氫鍵作用結(jié)合在BC表面，在后序純化及干燥處理中極可能遭到破壞，HA取代率低；發(fā)酵前期加入HA占據(jù)了纖維合成空間，使合成的BC分子間隙變大，復水時水分子較易進入[13]。由于發(fā)酵前加入的HA會影響B(tài)C膜的合成，可能會改變生成的BC結(jié)構(gòu)，發(fā)酵初始添加HA復水率高，但是產(chǎn)量較低，在發(fā)酵3 d添加HA，獲得的BC膜產(chǎn)量較高，復水率較低。

圖1HA添加時間對BC膜產(chǎn)量與復水率的影響Fig.1 Effect of adding HA time on yield and rehydration rate of BC membrane

2.2 HA添加量對BC膜產(chǎn)量和復水性的影響

在發(fā)酵前加入HA，不同HA添加量對BC膜的產(chǎn)量（濕質(zhì)量）與復水率變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，HA添加量在0～2.0 g/L，HA-BC復合膜產(chǎn)量與復水率均呈先增大后減少的趨勢。當HC添加量為1.0 g/L時，HA-BC復合膜產(chǎn)量最大，為247.47 g/L；當HA添加量＞1.0 g/L時，HA-BC復合膜產(chǎn)量下降，其原因可能是HA添加量過量，導致培養(yǎng)基黏度過大，影響菌種生長代謝，阻礙纖維聚集[14]，產(chǎn)量下降。與BC膜復合，HA特殊的保水作用能夠增大HA-BC復合膜的復水率，并在HA添加量為1.0 g/L，HA-BC復合膜復水率最高為23.58%；但HA添加量＞1.5 g/L時，HA-BC復合膜復水率下降。綜合考慮，確定HA添加量為1.0 g/L。

圖2HA添加量對BC膜產(chǎn)量與復水率的影響Fig.2 Effect of HA addition on yield and rehydration rate of BC membrane

2.3 添加HA發(fā)酵BC過程中培養(yǎng)基成分的測定

2.3.1 發(fā)酵過程中培養(yǎng)基pH值的測定

以不添加HA為對照組，發(fā)酵前添加1 g/L透明質(zhì)酸，檢測發(fā)酵5 d內(nèi)BC培養(yǎng)基pH值的變化，結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵前控制培養(yǎng)基的pH值為5，發(fā)酵3 d pH急劇下降，隨后趨于平緩。原因可能是在BC發(fā)酵過程中木醋桿菌不斷增殖，產(chǎn)生葡萄糖酸與醋酸等導致[15]。發(fā)酵后期，由于培養(yǎng)基酸度過高，阻礙了木醋桿菌的生長，pH不再下降。對照組與添加HA組的BC培養(yǎng)基pH值變化趨勢相同，說明HA的加入不會對木醋桿菌發(fā)酵細菌纖維素產(chǎn)酸造成影響。

圖3 發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.3 Changes of pH during fermentation

2.3.2 發(fā)酵過程中可溶性固形物的測定

以不添加HA為對照組，發(fā)酵前添加1 g/L透明質(zhì)酸，發(fā)酵液中可溶性固形物的變化，結(jié)果見圖4。由圖4可知，兩條曲線均呈逐漸降低后趨于平緩的趨勢。在發(fā)酵的5 d內(nèi)，木醋桿菌不斷生長，利用碳源合成纖維素，培養(yǎng)基中可溶性固形物的含量逐漸降低，在發(fā)酵第3天時，添加HA組的可溶性固形物含量急劇降低，可能與此時為細菌的對數(shù)增長期有關(guān)。由于木醋桿菌可利用包括單糖、二糖和多糖在內(nèi)的多種碳源和能源物質(zhì)來合成纖維素[16]，因此，HA的加入可能會導致培養(yǎng)基固形物含量的增加，促進細菌的生長。

圖4 發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化Fig.4 Changes of soluble solids during fermentation

2.3.3 發(fā)酵過程中還原糖的測定

以不添加HA為對照組，發(fā)酵前添加1g/L透明質(zhì)酸，發(fā)酵液中還原糖含量的變化，結(jié)果見圖5。由圖5可知，還原糖在BC發(fā)酵5 d內(nèi)總體呈現(xiàn)下降的趨勢，前2 d內(nèi)，加入HA后還原糖含量略增加，可能與高分子HA的降解有關(guān)。添加HA組與對照組還原糖變化趨勢相同，說明HA的加入不影響B(tài)C的形成過程。HA組初始還原糖含量較高，發(fā)酵結(jié)束時與對照組接近，推測木醋桿菌可能利用了部分降解為低分子的HA。

圖5 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar contents during fermentation

2.4 HA-BC復合膜的傅里葉變換紅外光譜分析

圖6BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的紅外圖譜Fig.6 Infrared spectrogram of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

紅外光譜常用來確定物質(zhì)中的特殊官能團或化學鍵[17]。BC膜及HA-BC復合膜的紅外光譜圖見圖6。由圖6a可知，在波數(shù)3 234 cm-1和3 257 cm-1之間出現(xiàn)的吸收譜帶是OH鍵與NH鍵的伸縮振動作用；波數(shù)2896cm-1處的吸收峰是C=C伸縮振動；波數(shù)1 411 cm-1、1 616 cm-1處的吸收峰是對稱與不對稱的C=C伸縮振動作用；而波數(shù)1 153 cm-1、1 313 cm-1、1 037 cm-1處的吸收峰分別是氨基酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用。波數(shù)3 600～3 000 cm-1之間的吸收峰是OH鍵的作用。由圖6b可知，波數(shù)3 000～2 800 cm-1之間的吸收峰是CH、CH2鍵的作用，波數(shù)1 200～900 cm-1之間的吸收是由C=O、C=O鍵的伸縮振動引起，其中波數(shù)1160cm-1處的吸收峰是羧酸基C-O-C伸縮振動引起，而在波數(shù)750 cm-1、710 cm-1處的吸收峰是纖維素典型的Iα、Iβ結(jié)晶形態(tài)峰。特別發(fā)現(xiàn)在波數(shù)1 745 cm-1附近加入HA的BC存在特殊吸收峰，如圖6b中虛線框所示，而未添加的樣品則未出現(xiàn)，說明添加HA使產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.5 HA-BC復合膜的XRD分析

BC膜及HA-BC復合膜的XRD測試結(jié)果見圖7。由圖7可知，BC曲線上的三個衍射峰14.8、16.5和22.8分別代表了BC結(jié)構(gòu)的（101）、（10）和（002）三個晶面[18]，添加HA后，復合膜不僅出現(xiàn)了這三個峰，且在衍射峰2θ為14附近峰強增大，表明HA的加入未改變細菌纖維素的晶型。

圖7BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的X衍射圖Fig.7 X-ray diffraction graph of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

通過擬合分峰計算出BC膜的結(jié)晶度為44.57%，發(fā)現(xiàn)添加HA后復合膜的結(jié)晶度有所下降，為40.92%，這可能是因為在纖維素形成之前，培養(yǎng)體系中就已有HA存在，HA的“占位”導致纖維三維網(wǎng)絡(luò)間隙變大，結(jié)晶度變低[19]，而結(jié)晶度的大小對BC膜吸水性有影響，結(jié)晶度減小，復水率增加，這一結(jié)果與BC膜的復水率變化保持了一致性。

2.6 HA-BC復合膜的熱穩(wěn)定性分析

圖8BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的熱重分析曲線Fig.8 TGA curves of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

熱重分析（TGA）是在程序控制溫度下，測量物質(zhì)的質(zhì)量變化與溫度或者時間的關(guān)系技術(shù)[20]。BC膜及HA-BC復合膜的熱重分析曲線，由圖8可知，BC膜在19.41℃開始分解，200.57～449.38℃為主要失重階段，此階段失重約43.99%，最大失重溫度為278.67℃。HA-BC復合膜的起始分解溫度為18.88℃，主要失重溫度在210.69～450.45℃范圍內(nèi)，約失重52.56%，最大失重溫度為297.21℃。HA-BC復合物與BC有類似的分解曲線，其在前100℃范圍內(nèi)失重較慢，100～200℃失重開始加快，發(fā)現(xiàn)加入HA后，最大失重溫度提高，說明HA-BC復合膜的熱穩(wěn)定性較好，但其在主要分解溫度范圍內(nèi)失重較多，可能與HA較易受熱分解有關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗研究了添加透明質(zhì)酸對BC膜的影響。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前添加1 g/L的HA能夠提高BC膜的復水性，較未改性的BC復水率增加了16%。且發(fā)酵過程中pH、還原糖、可溶性固形物變化趨勢與未添加HA組相似，說明HA的加入對BC的合成影響不大。對改性的復合膜進行表征，發(fā)現(xiàn)加入HA后，復合膜熱穩(wěn)定性提高，結(jié)晶度降低，導致其復水率增加，紅外光譜顯示HA-BC復合膜在波數(shù)1 745 cm-1附近出現(xiàn)特殊吸收峰，可能添加HA會改變產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果為改善干態(tài)的BC膜復水性質(zhì)與BC在各行業(yè)的推廣應用提供了理論依據(jù)與技術(shù)參考。

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Effect of hyaluronic acid addition on fermentation process of bacterial cellulose

DING Yong,ZHANG Kewei,SHAO Mingliang,LUO Cangxue*
(School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China)

In order to improve the rehydration rate of dried bacterial cellulose(BC),the effect of hyaluronic acid(HA)addition on BC membrane was researched,and the properties of the HA-BC composite membrane were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR),X-ray diffractions (XRD)and thermogravimetric analysis(TGA).The results showed that compared with the BC membrane without HA,the BC membrane added 1 g/L HA before fermentation could improve effectively the rehydration rate of BC membrane,the maximum rehydration rate was 23.58%,and the variation trends of pH,reducing sugar and soluble solids were similar to that of the unadded HA group during fermentation,and the addition of HA had little effect on the synthesis of BC.FTIR results indicated that HA and BC form a composite membrane;TGA and XRD results indicated that the thermostability of HA-BC composite membrane increased and the degree of crystallinity decreased which resulted in the increase of rehydration rate.As a result,the addition of HA could produce the HA-BC composite membrane with higher rehydration rate and better thermostability.

bacterial cellulose;rehydration rate;hyaluronic acid;FTIR;XRD;TGA

TS201.3

0254-5071（2017）07-0100-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.022

2017-04-08

陜西省教育廳專項科研計劃項目（14JK1089）

丁勇（1974-），男，講師，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：羅倉學（1959-），男，教授，碩士，研究方向為食品加工及資源綜合開發(fā)利用。