培養(yǎng)條件對(duì)黑曲霉脂肪酶選擇性合成1,3甘油二酯的影響

張富豪，李蘭香，何臘平，2*，高冰，李翠芹，陳翠翠

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

培養(yǎng)條件對(duì)黑曲霉脂肪酶選擇性合成1,3甘油二酯的影響

張富豪1，李蘭香1，何臘平1，2*，高冰3，李翠芹4，陳翠翠1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

從前期篩菌工作中得到的一株能高選擇性合成1,3-甘油二酯（1,3-DAG）的產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的黑曲霉GZUF36菌株出發(fā)，分別研究了培養(yǎng)時(shí)間、溫度、接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速對(duì)該菌搖瓶發(fā)酵的影響，得出合適的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間72 h，接種量3%，裝液量40 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，在此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%和82.96%。同時(shí)也比較了搖瓶發(fā)酵和5 L發(fā)酵罐發(fā)酵的異同，相比于搖瓶發(fā)酵，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵的1,3-DAG的得率有所提高，但是發(fā)酵罐發(fā)酵的時(shí)間有所延長(zhǎng)。

1,3-甘油二酯；脂肪酶；發(fā)酵條件；搖瓶；發(fā)酵罐

肥胖已經(jīng)成為全球性的、嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球有3億人患有嚴(yán)重肥胖癥。肥胖可以引發(fā)多種疾病，如高血壓、冠心病、腦血管疾病等。引起肥胖的一個(gè)主要原因是攝入油脂過(guò)多，但是油脂也是不可或缺的重要營(yíng)養(yǎng)素之一。甘油三酯（triglyceride，TAG）和甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是食用油脂中的天然成分，其中甘油二酯存在三種同分異構(gòu)體：1,2-DAG、2,3-DAG和1,3-DAG[1]。TAG、1,2-DAG、2,3-DAG在人體中不能徹底轉(zhuǎn)換為能量并在體內(nèi)重新合成油脂而積累，從而引起肥胖。而1,3-DAG能在體內(nèi)分解成不能重新合成脂肪的1-單?；视王?，通過(guò)β氧化以能量的形式釋放，不會(huì)在體內(nèi)積累[2]，并且1,3-DAG和傳統(tǒng)的油脂在口感、色澤、風(fēng)味都沒(méi)有差異，同時(shí)動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)，富含1,3-DAG食用油能減少肥胖的發(fā)生[3-4]，所以1,3-DAG被公認(rèn)為新一代的健康油脂。

天然油脂中1,3-DAG的含量很低，目前主要采用化學(xué)法和生物酶法來(lái)合成。由于化學(xué)法對(duì)環(huán)境破壞較大，所以生物酶法備受關(guān)注。脂肪酶是1,3-DAG酶法制備中常用的一種催化劑，1,3-DAG的脂肪酶法制備包括酯合成、甘油解、轉(zhuǎn)酯化法、甘油三酯水解四種[5]，其中甘油解法相比于其他方法，具有反應(yīng)中無(wú)凈水產(chǎn)生、成本低、反應(yīng)條件易控制的優(yōu)點(diǎn)，但是需要有1,3-選擇性的脂肪酶催化[6]。脂肪酶對(duì)于三酰甘油特定位置的脂肪酸優(yōu)先水解，主要是1位和3位，因此被稱(chēng)為Sn-1,3位專(zhuān)一性脂肪酶，而具有1,3-選擇性的脂肪酶不多，產(chǎn)該脂肪酶的菌株更為稀少。本課題組在前期篩菌過(guò)程中得到了一株通過(guò)甘油解反應(yīng)高選擇性合成1,3-DAG的產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的菌株黑曲霉GZUF36[7]，其產(chǎn)的胞內(nèi)脂肪酶被用作全細(xì)胞脂肪酶，可以節(jié)省純化工藝降低成本。由于培養(yǎng)環(huán)境條件會(huì)對(duì)產(chǎn)酶具有重要影響[8-10]，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)環(huán)境條件進(jìn)行了探索，以確定合適的條件來(lái)提高該菌株全細(xì)胞脂肪酶高選擇性合成1,3-DAG的能力，同時(shí)將搖瓶發(fā)酵擴(kuò)大到5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，以此來(lái)獲得大量脂肪酶供后續(xù)研究做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源

本課題組在富含油脂的土壤中篩選得到的一株黑曲霉（Aspergillus niger）GZUF36菌株，該菌株能通過(guò)甘油解反應(yīng)高選擇性合成1,3-DAG，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心鑒定并保藏，保藏編號(hào)為CCTCC No.M2012538。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0.96%，豆餅粉1.93%，氯化鉀0.048%，硫酸鋅0.044%，氯化鈣0.044%，磷酸氫二鈉0.044%，磷酸氫二鉀0.044%，水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

橄欖油（生物試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三油酸甘油酯（分析純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；叔丁醇、異丙醇、乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；GBJS-5LS發(fā)酵罐：上海百倫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全細(xì)胞脂肪酶制備

挑取保藏于試管斜面中的黑曲霉兩環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，吸取3%種子培養(yǎng)基液體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)72 h。用干凈的紗布過(guò)濾得到菌體，用無(wú)菌水沖洗菌體3遍以除去菌體表面上的發(fā)酵液，之后在冷凍干燥機(jī)中凍干并在液氮的保護(hù)下碾磨成酶粉，即為全細(xì)胞脂肪酶酶粉，并于4℃保藏備用。

1.3.2 反應(yīng)體系條件

甘油解反應(yīng)體系為有機(jī)溶劑體系，有機(jī)溶劑由正己烷和叔丁醇組成，兩者的體積比為49∶1；反應(yīng)底物為甘油和甘油三酯，兩者的摩爾比為1∶2，其中，甘油三酯的濃度為0.01mol/L；酶粉添加量為0.2g；于50mL錐形瓶中反應(yīng)，反應(yīng)條件為30℃，180 r/min條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后取1 mL反應(yīng)液經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾進(jìn)入高效液相色譜檢測(cè)1,3-DAG的含量。

1.3.3 高效液相色譜檢測(cè)條件

采用Agilent 1206高效液相色譜儀，流動(dòng)相為乙腈和異丙醇，WatersC18反相色譜柱（4μm，3.9mm×150mm）。檢測(cè)條件為：0min時(shí)，乙腈：異丙醇=80∶20（V/V）；27min時(shí)，乙腈∶異丙醇=40∶60（V/V）；進(jìn)樣量為10 μL；流速為0.6 mL/min；柱溫為30℃[7]。

1.3.4 培養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)黑曲霉GZUF36產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的影響

（1）培養(yǎng)時(shí)間

固定發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量3%、裝液量50 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，研究不同的培養(yǎng)時(shí)間（24 h、48 h、72 h、96 h和120 h）對(duì)黑曲霉發(fā)酵所產(chǎn)的脂肪酶參與甘油反應(yīng)中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（2）接種量

在上述合適的培養(yǎng)時(shí)間條件下，固定裝液量50 mL/ 250 mL，培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，研究不同的接種量（1%、2%、3%、4%、5%和6%）對(duì)黑曲霉發(fā)酵所產(chǎn)的脂肪酶參與甘油反應(yīng)中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（3）裝液量

在上述合適的培養(yǎng)時(shí)間和接種量條件下，固定培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180r/min，研究不同的裝液量（30mL/250mL、40mL/250mL、50mL/250mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80 mL/250 mL和90 mL/250 mL）對(duì)黑曲霉發(fā)酵所產(chǎn)的脂肪酶參與甘油反應(yīng)中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（4）培養(yǎng)溫度

在上述合適的培養(yǎng)時(shí)間、接種量和裝液量條件下，固定搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，考察不同的培養(yǎng)溫度（26℃、28℃、30℃、32℃和34℃）對(duì)黑曲霉發(fā)酵所產(chǎn)的脂肪酶參與甘油反應(yīng)中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

（5）搖瓶轉(zhuǎn)速

在上述合適的培養(yǎng)時(shí)間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度條件下，變化培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，其他條件一致，研究不同的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min）對(duì)黑曲霉發(fā)酵所產(chǎn)的脂肪酶參與甘油反應(yīng)中1,3-DAG的得率和選擇性的影響。

1.3.5 5L發(fā)酵罐擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)

根據(jù)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件的探索，黑曲霉GZUF36在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件為接種量為3%，裝液量為3.5 L/5.0 L，溶氧量為1.7%，攪拌轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)溫度為28℃，用氨水和醋酸來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中的pH。每12h取一次樣，取樣量為50 mL，取樣后注入相同體積的滅菌的新鮮培養(yǎng)基。樣品經(jīng)過(guò)紗布過(guò)濾得到菌體，冷凍干燥、液氮碾磨制成酶粉，加入甘油解反應(yīng)體系中參與反應(yīng)，用高效液相色譜檢測(cè)1,3-DAG的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)計(jì)算

1,3-DAG選擇性為甘油二酯產(chǎn)物中1,3-DAG所占的比例，也是脂肪酶1,3-位選擇性強(qiáng)弱的直觀表現(xiàn)。1,3-DAG的得率和選擇性計(jì)算公式如下。

式中：1,2-DAG和1,3-DAG分別為1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯；TAG為三油酸甘油酯。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行，所有實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)均由3個(gè)平行數(shù)據(jù)的平均值求得，用SPSS 19.0版分析數(shù)據(jù)差異顯著性，P＜0.05時(shí)差異顯著，用Origin 8.6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.1 Effects of culture time on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，1,3-DAG的得率和選擇性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間低于72 h時(shí)，1,3-DAG的得率和選擇性都沒(méi)達(dá)到峰值，這是由于此時(shí)微生物還處于大量繁殖階段，該階段微生物主要以分泌初級(jí)代謝產(chǎn)物為主；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，微生物已經(jīng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，細(xì)胞代謝產(chǎn)物如脂肪酶大量生產(chǎn)[11]，從而甘油解反應(yīng)得到更多的1,3-DAG；但超過(guò)72 h后，1,3-DAG的得率和選擇性都呈下降趨勢(shì)，這是由于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，微生物進(jìn)入衰亡期從而產(chǎn)酶能力下降。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72和96 h時(shí)，兩者的1,3-DAG的選擇性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但是1,3-DAG的得率卻差異顯著（P＜0.05），且培養(yǎng)72 h的更高。所以較為合適的培養(yǎng)時(shí)間為72 h，在此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為20.45%和77.13%。

2.2 接種量對(duì)1,3-DAG的得率和選擇性的影響

由圖2可知，1,3-DAG的得率和選擇性均隨著接種量的增大呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在接種量為3%時(shí)達(dá)到最大值（P＜0.05），此時(shí)1,3-DAG的得率和選擇性分別為20.88%和76.63%。當(dāng)接種量為1%～3%時(shí)，兩個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，這是由于當(dāng)接種量過(guò)低時(shí)，微生物的對(duì)數(shù)期過(guò)長(zhǎng)，生物量增長(zhǎng)緩慢，達(dá)到穩(wěn)定產(chǎn)酶期的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)從而產(chǎn)酶量較低[11]。當(dāng)接種量為3%時(shí)，此時(shí)菌體生物量和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物的配比較合理，能更快達(dá)到穩(wěn)定產(chǎn)酶期，產(chǎn)酶效率增加[12]。當(dāng)接種量＞3%時(shí)，由于過(guò)大的接種量會(huì)極大的縮短微生物的發(fā)酵周期，菌體更容易衰亡，同時(shí)過(guò)多的接種量會(huì)帶入過(guò)多的種子培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)從而導(dǎo)致微生物衰亡更快，產(chǎn)酶效率也越低[13]，所以選擇接種量為3%較為合適。

圖2 接種量對(duì)1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.2 Effects of inoculum on the yield and selectivity of 1,3-DAG

2.3 裝液量對(duì)1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖3 裝液量對(duì)1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.3 Effects of liquid volume on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖3可知，隨著裝液量的增加1,3-DAG的得率和選擇性先增加后下降。當(dāng)裝液量低于40 mL/250 mL時(shí)，由于裝液量過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致一次發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶的量過(guò)低，即總酶活力會(huì)低，所以甘油解反應(yīng)產(chǎn)物1,3-DAG的含量也偏低。當(dāng)裝液量高于40 mL/250 mL時(shí)，由于培養(yǎng)基量增大會(huì)導(dǎo)致溶氧量的下降，微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵得不到足夠的氧，進(jìn)而影響代謝途徑，降低了產(chǎn)酶能力[8]。當(dāng)裝液量為30 mL/250 mL和40 mL/250 mL時(shí)，兩者的1,3-DAG的選擇性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但是1,3-DAG的得率卻差異顯著（P＜0.05），且后者效果更好。所以選擇裝液量為40 mL/250 mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件，此條件下1,3-DAG的得率和選擇性分別為21.72%和78.37%。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.4 Effects of culture temperature on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖4可知，隨著溫度的上升，1,3-DAG的得率和選擇性先增加后快速下降。這是由于溫度過(guò)低時(shí)，微生物生長(zhǎng)緩慢，遲滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)酶效率低，所以培養(yǎng)溫度為26℃條件下1,3-DAG的得率和選擇性較低[14]。但是當(dāng)溫度高于28℃時(shí)，由于溫度過(guò)高，微生物生長(zhǎng)迅速容易老化，降低了酶產(chǎn)率。并且溫度還會(huì)對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)酶的代謝機(jī)制產(chǎn)生影響，過(guò)低或者過(guò)高的溫度都會(huì)降低脂肪酶的產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)不能誘導(dǎo)產(chǎn)酶的情況發(fā)生[15]。所以選擇培養(yǎng)溫度為28℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件（P＜0.05），在該條件下1,3-DAG的得率和選擇性均較優(yōu)，分別為22.81%和82.83%。2.5培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)1,3-DAG的得率和選擇性的影響

圖5 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)1,3-DAG得率和選擇性的影響Fig.5 Effects of rotation speed on the yield and selectivity of 1,3-DAG

由圖5可知，1,3-DAG的得率和選擇性均呈現(xiàn)同步先增后減。當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速低于180r/min時(shí)，培養(yǎng)基中傳氧受到了限制，微生物生長(zhǎng)較慢，同時(shí)在發(fā)酵液表面也容易形成菌絲體膜阻礙微生物與氧的接觸，從而導(dǎo)致脂肪酶產(chǎn)量偏低[16]；但培養(yǎng)轉(zhuǎn)速高于180 r/min時(shí)，過(guò)高的轉(zhuǎn)速又會(huì)使微生物因?yàn)槿苎踉龆喽罅糠敝齿^早形成菌絲球或菌絲團(tuán)，由于菌絲球或菌絲團(tuán)內(nèi)部傳質(zhì)和傳氧受到了一定的限制，從而阻礙了微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)一步影響產(chǎn)酶[17]。因此當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)效果較好（P＜0.05），此時(shí)的1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%和82.96%。

2.6 5 L發(fā)酵罐的擴(kuò)大試驗(yàn)

發(fā)酵罐試驗(yàn)有助于為后續(xù)的潛在工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵摸索合適的培養(yǎng)條件，同時(shí)也可以探討搖瓶（小試）和5 L發(fā)酵罐（中試）的兩種培養(yǎng)方式對(duì)GZUF36選擇性的影響，為后續(xù)研究提供借鑒，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)Fig.6 Enlarge cultivation of the fermentation tank

如圖6所示，黑曲霉GZUF36在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)了96h時(shí)才呈現(xiàn)最大的脂肪酶活力，1,3-DAG的得率和選擇性分別為25.30%，82.02%，而搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間則為72 h，1,3-DAG的得率和選擇性分別為23.87%，82.96%。相比于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的最佳1,3-DAG的得率要高。這可能是因?yàn)閾u瓶培養(yǎng)是一次投料，一次發(fā)酵的分批發(fā)酵方式，而發(fā)酵罐發(fā)酵采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式，這可以延長(zhǎng)發(fā)酵周期，添加的新鮮培養(yǎng)基有利于微生物的產(chǎn)酶和生長(zhǎng)[18]。同時(shí)由于機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐的攪拌會(huì)改變絲狀真菌發(fā)酵液的流動(dòng)特性，影響菌體的聚集形態(tài)[19]，因此相比于搖瓶發(fā)酵，其產(chǎn)酶能力也有所改變。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)研究了培養(yǎng)時(shí)間、接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉GZUF36菌株產(chǎn)的全細(xì)胞脂肪酶高選擇性合成1,3-DAG能力的影響。得出合適的搖瓶培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間72 h，接種量3%，裝液量40 mL/250 mL，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min，在此條件下得到的1,3-DAG的得率和選擇性，分別為23.87%和82.96%。

該研究還比較了搖瓶發(fā)酵和5 L發(fā)酵罐發(fā)酵對(duì)培養(yǎng)效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)黑曲霉GZUF36在5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，1,3-DAG的得率和選擇性達(dá)到最大，分別為25.30%、82.02%。相比于搖瓶發(fā)酵，5 L發(fā)酵罐發(fā)酵的結(jié)果有所提高，但是發(fā)酵罐發(fā)酵的時(shí)間有所延長(zhǎng)，這可能是因?yàn)閾u瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式不同導(dǎo)致的，但是發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件在后續(xù)研究中需進(jìn)一步探索，為后續(xù)的潛在工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)一步摸索合適條件。

[1]MORITA O,SONI M G.Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil:a review of the published literature[J].Food Chem Toxicol, 2009,47(1):9-21.

[2]王衛(wèi)飛.酶法甘油解合成甘油二酯工藝的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[3]TAEKIL E,KONG CS,HEEGUK B,et al.Lipase catalytic synthesis of diacylglycerol from tuna oil and its anti-obesity effect in C57BL/6J mice. [J].Process Biochem,2010,45(5):738-743.

[4]董攀.脂肪酶水解法制備1,3-甘油二酯及脂肪酶的固定化研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2013.

[5]何臘平，李蘭香，周換景，等.1,3-甘油二酯的制備研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2013，34（15）：113-116.

[6]FREGOLENTE P B L,FREGOLENTE L V,PINTO G M F,et al.Monoglycerides and diglycerides synthesis in a solvent-free system by lipasecatalyzed glycerolysis[J].Appl Biochem Biotechnol,2008,146(1):165-172.

[7]ZHOU H J,HE L P,WANG H,et al.Screening intracellular lipase-producing microbial with selective synthesis of 1,3-diolein[J].J Pure Appl Microbiol,2014,8(3):1853-1856.

[8]LIU WH,BEPPU T,ARIMA K.Cultural conditions and some properties of the lipase of S-38[J].Agr Biol Chem,2014,36(11):1919-1924.

[9]劉金輝，李曉路，姜巖，等.施氏假單胞菌PS59產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件及脂肪酶洗滌性能優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（7）：186-193.

[10]趙興秀，趙長(zhǎng)青，何義國(guó)，等.高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].食品與機(jī)械，2016，32（3）：16-19.

[11]惲麗紅.Burkholderia manaSYBC LI-1產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.

[12]REN X,PAN D,ZENG X,et al.Optimization of culture conditions and fermentation conditions for cell wall proteinase(CEP)production by Lactobacillus acidophilus[J].J Chinese Inst Food Sci Technol,2014, 14(2):146-153.

[13]胡珺，杜新凱，王常高，等.產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中國(guó)釀造，2016，35（11）：39-43.

[14]王棟.華根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶學(xué)特性的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.

[15]李燕.根霉ZM-10脂肪酶發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[16]顏興和.提高華根霉（Rhizopus chinensis）脂肪酶酶促催化酯合成能力的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2004.

[17]HE D,LUO W,WANG Z,et al.Combined use of GAP,and AOX1, promoters and optimization of culture conditions to enhance expression ofRhizomucor miehei,lipase[J].J Ind Microbiol Biot,2015,42(8): 1175-1182.

[18]PAPAGIANNI M.Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial processes[J].Biotechnol Adv,2004,22(3):189-259.

[19]ZNIDARSIC P,KOMEL R,PAVKO A.Studies of a pelleted growth form ofRhizopus nigricans,as a biocatalyst for progesterone 11 α-hydroxylation[J].J Biotechnol,1998,60(3):207-216.

Effect of culture conditions on the synthesis of 1,3-DAG by the lipase fromAspergillus niger

ZHANG Fuhao1,LI Lanxiang1,HE Laping1,2*,GAO Bing3,LI Cuiqin4,CHEN Cuicui1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Aspergillus nigerGZUF36 with extracellular lipase-producing ability which can highly synthesize 1,3-diglyceride was screened from early screening work.The effects of incubation time,temperature,inoculum,liquid volume,and rotation speed on the shake-flask fermentation were studied.The suitable cultivate conditions were found as followed:incubation time 72 h,inoculum 3%,liquid volume 40 ml/250 ml,temperature 28℃, rotation speed 180 r/min.In this condition,the yield and selectivity rate of 1,3-DAG was 23.87%and 82.96%,respectively.The similarities and differences of shake-flask fermentation and 5 L fermentor fermentation were compared,and results showed that the yield of 1,3-DAG was improved by 5 L fermentor fermentation,but the fermentation time extended.

1,3-diglyceride;lipase;fermentation condition;shake-flask;fermentor

Q935

0254-5071（2017）07-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.019

2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（21062004、31660010）；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（研理工2016059）

張富豪（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化。