仰韶陶融型白酒大曲可培養(yǎng)微生物多樣性研究

樊建輝，侯建光，郭福祥，陳蒙恩，楊方玉，陳文強*

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南澠池472400；2.陜西理工大學(xué)生物工程與科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723001）

仰韶陶融型白酒大曲可培養(yǎng)微生物多樣性研究

樊建輝1，侯建光1，郭福祥1，陳蒙恩1，楊方玉1，陳文強2*

（1.河南仰韶酒業(yè)有限公司，河南澠池472400；2.陜西理工大學(xué)生物工程與科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723001）

研究陶融型白酒大曲可培養(yǎng)微生物的多樣性。采用組織培養(yǎng)方法分離陶融型白酒大曲的微生物，提取分離菌株DNA，用酵母通用引物NL1/NL4、細(xì)菌通用引物799F/1492R和真菌通用引物ITS1/ITS4對酵母26S rRNA、細(xì)菌16S rRNA、霉菌28S rRNA序列擴增，提交測序分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。仰韶陶融型白酒大曲酒曲中共分離到酵母213株、細(xì)菌386株、霉菌73株，酵母歸分為72株形態(tài)種，細(xì)菌歸分為77株形態(tài)種，霉菌歸分為7株形態(tài)種，根據(jù)測序結(jié)果不同，陶融型白酒大曲微生物被分為21個分類單元。仰韶陶融型白酒大曲可培養(yǎng)微生物具有多樣性特征，為其發(fā)酵及開發(fā)利用提供理論參考。

陶融型白酒；大曲；微生物多樣性；系統(tǒng)發(fā)育樹

大曲在我國白酒釀造中起著重要的作用，作為白酒的釀造動力源，首先為白酒釀造提供了大量的酶類以及香味生成基礎(chǔ)物質(zhì)[1]，同時也為白酒釀造提供了大量產(chǎn)香微生物，其中含有豐富的兼性可培養(yǎng)微生物，對白酒中脂類、醛類、醇類等有機物的形成有著直接作用[2-3]，并且大曲對白酒的風(fēng)味形成也至關(guān)重要[4-6]。目前有關(guān)大曲的研究已經(jīng)取得很大成果，如YAO S等[7]從山東扳倒井高溫大曲中分離到一株高溫放線菌屬新種H-18T；XIONG X M等[8]對白云邊手工制作大曲和機器制作大曲研究發(fā)現(xiàn)，兩者微生物的優(yōu)勢種屬和Shannon指數(shù)基本相同，機器制作大曲完全可以代替手工制作大曲；SHI J H等[9]對汾酒大曲研究中發(fā)現(xiàn)，放線菌目和乳桿菌目只在大曲表皮部被分離到，芽孢桿菌目主要存在于大曲內(nèi)部，真菌主要分布于大曲表皮部；黃曉寧等[10]對同一酒廠醬香型和濃香型兩種大曲微生物研究發(fā)現(xiàn)，兩者大曲在真菌種屬差異性很大，細(xì)菌差異性較小。仰韶陶融型白酒大曲是由小麥、豌豆以及大麥為原料，經(jīng)過大曲成型、曲房培養(yǎng)、大曲后熟三個階段而成。仰韶陶融型白酒大曲在整個形成過程中屬于開放式接種培養(yǎng)，增加了仰韶陶融型白酒大曲微生物的多樣性。

陶融型白酒是我國第十三種香型白酒[11]，以濃香型、醬香型、清香型、芝麻香型于一體的創(chuàng)新型香型白酒，其酒體香氣優(yōu)雅、細(xì)膩，口感醇厚豐滿、余味凈爽的特點而被廣大消費者喜愛[12]。目前有關(guān)陶融型白酒大曲微生物多樣性研究，國內(nèi)鮮有報道。本次研究以陶融白酒發(fā)酵使用的大曲為材料，研究陶融白酒大曲中微生物的多樣性和菌落分布，以便為陶融型白酒的發(fā)酵提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

仰韶陶融型白酒大曲由河南仰韶酒業(yè)有限公司提供，將樣品放入無菌保藏管中，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；2×TapPCR Master Mix、BioSpin試劑盒：西安熱摩爾公司；T-19載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞：TAKARA公司；酵母DNA基因組快速提取試劑盒、溴酚藍(lán)、DL2000DNAMarker、Tris平衡酚、接觸酶、氧化酶、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、淀粉、明膠、H2S、吲哚、丙二酸鹽、孟加拉紅培養(yǎng)基、納他霉素、氨芐青霉素、引物等：上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）細(xì)菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨5 g/L，牛肉膏5g/L，NaCl5g/L，納他霉素1g/L，瓊脂粉12g/L，pH7.0。

（2）酵母分離培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，豆芽200 g/L，氨芐青霉素1 g/L，瓊脂粉12 g/L，pH 6.0。

（3）霉菌分離培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨0.5g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O3g/L，VB10.1g/L，瓊脂粉12 g/L，氨芐青霉素1 g/L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

GT9611PCR儀：杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；SF-CJ-2凈化工作臺：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；WD-9403A型紫外分光光度儀：北京六一生物科技有限公司：HYG-B全溫?fù)u瓶柜：蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；1-14SIGMA高速臺式離心機：美國SIGMA公司；LPZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；eppendorf移液器：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離和純化

稱取仰韶陶融適量大曲，將其徹底粉碎，溶于無菌水中，分別置于28℃和37℃恒溫?fù)u床中預(yù)培養(yǎng)2 h。采用梯度稀釋法，將預(yù)培養(yǎng)樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，將大曲按照梯度稀釋，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)，吸取10-5梯度樣品1 mL涂布于霉菌分離培養(yǎng)基，吸取10-7梯度樣品1 mL涂布于酵母和細(xì)菌分離培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌分離培養(yǎng)基置于37℃恒溫培3 d，酵母和霉菌分離培養(yǎng)基置于28℃恒溫培5～7 d，挑取平板上形態(tài)特征不同的單菌落，通過劃線純化，并接種于斜面（4℃）保藏和甘油冷凍（-80℃）保藏。

1.3.2 仰韶陶融大曲微生物形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)分離真菌菌落形態(tài)特征，采用插片法對菌株菌絲，孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，進(jìn)行顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，進(jìn)行分類鑒定。將分離到的細(xì)菌依照菌落形態(tài)特征，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對待鑒定細(xì)菌進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測。

1.3.3 DNA的提取和PCR擴增測序

使用酵母DNA基因組快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，改良凍融法[13]提取細(xì)菌基因組DNA，十六烷基三甲基澳化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[14]提取霉菌DNA。用酵母通用引物NL1/NL4[15]擴增26S rRNA基因片段，細(xì)菌通用引物799F/1492R[16]擴增16S rRNA基因片段，霉菌通用引物ITS1/ITS4[13]擴增ITS基因片段。細(xì)菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）反應(yīng)體系和擴增程序參照參考文獻(xiàn)[15]，酵母PCR反應(yīng)體系和擴增程序參照參考文獻(xiàn)[16]，霉菌PCR反應(yīng)體系和擴增程序參照參考文獻(xiàn)[17]。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化PCR產(chǎn)物，連接T-19載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆子送上海杰李生物公司測序。

1.3.4 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索，整理修剪所測序列，提交NCBI，并索取序列登錄號。下載同源性較高的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。用Clusta-X[18]軟件對序列進(jìn)行比對及人工校正，利用Mega5.1[19]軟件構(gòu)建鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹[20]，Bootstrap值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物的分離和純化

將分離到的菌株菌落，通過多次劃線純化挑取，并接種于平板培養(yǎng)基中。從仰韶陶融大曲中總共分離到672株菌，其中真菌286株菌，細(xì)菌386株菌。經(jīng)過菌落形態(tài)特征排重，結(jié)果表明，共分離到156株菌形態(tài)種，包括細(xì)菌77株、酵母菌72株、霉菌7株。

2.2 仰韶陶融大曲微生物的鑒定

2.2.1 大曲微生物形態(tài)學(xué)觀察

（1）真菌

將分離純化到的菌株接種到孟加拉紅平板培養(yǎng)基上，觀察部分菌株的形態(tài)特征（見圖1），依據(jù)真菌分類鑒定手冊[21]，初步確定分離真菌菌株分類地位，結(jié)果見表1。

圖1 部分陶融型大曲可培養(yǎng)真菌形態(tài)特征Fig.1 Part morphological characters of culturable fungi in Pottery-flavorBaijiuDaqu

表1 部分陶融型大曲可培養(yǎng)真菌的形態(tài)特征及分類學(xué)地位Table 1 Part morphological features and taxonomic status of culturable fungi in Pottery-flavorBaijiuDaqu

由表1可知，接合菌亞門分離到2株菌，毛霉屬（Mucor）和根霉屬（Rhizopus）各1株，擔(dān)子菌亞門分離到1株，只有鎖擲酵母屬（Sporobolomyces）1株菌，子囊菌亞門分離到76株菌，其青霉屬（Penicillium）、翹孢霉屬（Emericella）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）及季也蒙酵母屬（Meyerozyma）各分離到1株，伊薩酵母屬（Issatchenkia）和假絲酵母屬（Candida）2株，曲霉屬（Aspergillus）分離到3株，地絲菌屬（Geotrichum）4株，覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）6株，酵母屬（Saccharomyces）8株，畢赤酵母屬（Pichia）18株，異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）29株。

（2）細(xì)菌

壁厚菌門共分離到54株細(xì)菌，其中桿菌屬（Bacillus）51株：菌落大小一致，邊緣多整齊，菌落多為白色。短小桿菌屬（Brevibacillus）3株：菌落大小一致，邊緣多整齊，菌落多為乳白色。變形菌門共分離到23株菌，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）20株，菌落邊緣多為不規(guī)則狀，菌落顏色多為棕色。泛菌屬1株，菌落乳白色，邊緣整齊。腸桿菌屬1株：菌落大小整齊，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色為灰白色?？寺逯Z菌屬1株，菌落大小整齊，表面光滑，邊緣整齊，菌落顏色為白色。

2.2.2 大曲微生物生理生化鑒定

依據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[22]，將分離到的細(xì)菌全部進(jìn)行生理生化特征鑒定，部分代表菌株的鑒定結(jié)果見表2。

由表2可知，菌株YSB03和YSB54革蘭氏反應(yīng)呈陽性，其余為陰性；除菌株YSB09外，其余菌株的接觸酶試驗、葡萄糖產(chǎn)酸試驗、甘露醇試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗結(jié)果均為陽性；除菌株YSB03外，其余菌株的氧化酶反應(yīng)均為陰性；菌株YSB27和YSB44木糖反應(yīng)為陽性，其余為陰性；菌株YSB03、YSB09、YSB54的阿拉伯糖試驗為陰性，其余為陽性；菌株YSB03、YSB27、YSB74的淀粉試驗反應(yīng)呈陰性，其余為陽性；菌株YSB09和YSB44的明膠反應(yīng)呈陰性；所有菌株的H2S反應(yīng)均呈陰性；除菌株YSB44外，其他菌株的丙二酸鹽反應(yīng)呈陰性；菌株YSB27和YSB74的VP試驗呈陽性，其他菌株試驗結(jié)果呈陰性。

表2 部分細(xì)菌的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of part bacteria

圖2 陶融型大曲可培養(yǎng)微生物基因片段的部分PCR擴增電泳圖Fig.2 Part PCR amplification electrophoretogram of gene fragments of culturable microorganism in Pottery-flavorBaijiuDaqu

2.2.3 大曲微生物菌株P(guān)CR擴增結(jié)果通過酵母DNA提取試劑盒獲得酵母DNA，用引物NL1/NL4對酵母26S rRNA序列擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株P(guān)CR產(chǎn)物結(jié)果見圖2。由圖2可知，得到600 bp大小片段（圖2a）；采用CTAB法提取分離純化后霉菌DNA，使用引物ITS1/ITS4對霉菌ITS序列進(jìn)行擴增，得到600 bp大小的片段（圖2b）；采用凍融法提取分離到細(xì)菌DNA，使用引物799F/1492R對細(xì)菌16S rRNA序列擴增，得到750 bp大小的片段（圖2c）。

2.2.4 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

所測菌株的序列在NCBI數(shù)據(jù)中BLAST結(jié)果比對，選取排在比對結(jié)果前面的部分同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 陶融型大曲可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of culturable fungi from Pottery-flavor BaijiuDaqu

由圖3可知，真菌被歸分為3個類群，接合菌亞門（Zygomycotina）包含Mucor、Rhizopus屬2個分類單元，所占類群為9.5%，擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）包含Sporobolomyces屬1個分類單元，所占類群為4.8%，子囊菌亞門（Ascomycotina）包含Aspergillus、Penicillium、Emericella、Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Saccharomyces、Issatchenkia、Torulaspora、Pichia、Meyerozyma、Candida、Geotrichum屬12個分類單元，所占類群為57.1%，為最優(yōu)勢類群。

圖4 陶融型大曲可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of culturable bacteria from Pottery-flavor BaijiuDaqu

由圖4可知，以菌株StreptomycesparvusNBRC3388（T）為外群建樹，細(xì)菌被歸分為2個類群，壁厚菌門（Firmicutes）包含Bacillus、Brevibacillus屬2個分類單元，所占類群為9.5%，變形菌門（Proteobscteria）包含Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Cronobacter屬4個分類單元，所占類群為19.0%。

2.3 大曲微生物多樣性分析

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，仰韶陶融型大曲中共分離到可培養(yǎng)微生物156株，其中桿菌屬（Bacillus）51株，約占32.70%；異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）29株，約占18.60%；假單胞菌屬（Pseudomonas）20株，約占12.82%；畢赤酵母屬（Pichia）18株，約占11.54%；酵母屬（Saccha romyces）8株，約占5.13%；覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）6株，約占3.85%；地絲菌屬（Geotrichum）4株，約占2.56%；短小桿菌屬（Brevibacillus）和曲霉屬（Aspergillus）均占1.92%（3株），伊薩酵母屬（Issatchenkia）和假絲酵母屬（Candida）均占1.28%（2株），泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Escherichia）、克洛諾菌屬（Cronobacter）、青霉屬（Penicillium）、翹孢霉屬（Emericella）、毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、鎖擲酵母屬（Sporobolomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）及季也蒙酵母屬（Meyerozyma）均占0.64%，分離菌株均為1株。

3 結(jié)論

本次通過純培養(yǎng)方法分離仰韶陶融型大曲微生物，分離到77株細(xì)菌，72株酵母菌，7株霉菌。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析細(xì)菌被鑒定為6屬，包括：51株桿菌屬（Bacillus），3株菌短小桿菌屬（Brevibacillus），20株菌假單胞菌屬（Pseudomonas），泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Escherichia）和克洛諾菌屬（Cronobacter）均分離到1株菌；其中桿菌屬（Bacillus）為第一優(yōu)勢菌屬，假單胞菌屬（Pseudomonas）為第二優(yōu)勢菌屬。

真菌被鑒定為15屬，包括：異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）29株，畢赤酵母屬（Pichia）18株，酵母屬（Saccharomyces）8株，覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）6株，地絲菌屬（Geotrichum）4株，曲霉屬（Aspergillus）3株，伊薩酵母屬（Issatchenkia）和假絲酵母屬（Candida）均分離到2株菌，青霉屬（Penicillium）、翹孢霉屬（Emericella）、毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、鎖擲酵母屬（Sporobolomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）及季也蒙酵母屬（Meyerozyma）均分離到1株菌，真菌物種多樣性豐富，真菌第一優(yōu)勢菌屬為異常維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces），其中酵母菌的菌屬為主要菌屬，占真菌種屬的73.3%。

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Microbial diversity of culturable microorganism from Yangshao pottery-flavorBaijiuDaqu

FAN Jianhui1,HOU Jianguang1,GUO Fuxiang1,CHEN Mengen1,YANG Fangyu1,CHEN Wenqiang2*
(1.He′nan Yangshao Liquor Industry Co.,Ltd.,Mianchi 472400,China;2.School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China)

The diversity of culturable microorganism in Pottery-flavorBaijiu(Chinese liquor)Daqu was studied.The Daqu microorganisms in PotteryflavorBaijiuwere isolated by tissue culture method.When microbial DNA was extracted,yeast universal primers NL1/NL4 was used for 26S rRNA sequences amplification,bacteria universal primer 799F/1492R was used for 16S rRNA sequences amplification,mold universal primer ITS1/ITS4 was used for 28S rRNA sequences amplification,the sequences were analyzed and results were submitted,to construct phylogenetic tree.Results showed that there were 213 yeasts,386 bacteria and 73 mould strains isolated from Pottery-flavorBaijiuDaqu,including 72 yeasts species,77 bacteria species,and 7 moulds species.Based on sequencing results,the isolated strains were classified into 21 operational taxonomic units(OUTs).The culturable microorganism in Yangshao Pottery-flavorBaijiuDaqu had microbial diversity,which provided theoretical foundation for fermentation and utilization.

Pottery-flavorBaijiu;Daqu;microbial diversity;phylogenetic tree

TS261

0254-5071（2017）07-0071-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.016

2017-03-03

樊建輝（1976-），男，工程師，大專，主要從事白酒釀造工藝的研究工作。

*通訊作者：陳文強（1956-），男，教授，本科，主要從事微生物資源的保護與利用工作。