大方臭豆腐中高產(chǎn)納豆激酶菌株的分離鑒定

高澤鑫，何臘平，2*，劉亞兵，高冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025）

大方臭豆腐中高產(chǎn)納豆激酶菌株的分離鑒定

高澤鑫1，何臘平1，2*，劉亞兵1，高冰3，李翠芹4，劉涵玉1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽550025）

該實驗對從大方臭豆腐中分離純化得到的8株產(chǎn)納豆激酶菌株進(jìn)行了研究，通過纖維蛋白平板法對其產(chǎn)納豆激酶能力的測試，篩選出一株酶活力達(dá)到5 435.39 IU/g的高產(chǎn)納豆激酶菌株GUYR02。對該菌株的菌株形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

大方豆腐；納豆激酶；篩選；鑒定；解淀粉芽孢桿菌

納豆起源于中國的秦漢時期，是傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，唐朝時期傳入日本，食用歷史已有1 000年以上[1]。納豆類似中國的發(fā)酵豆和豆豉，主要經(jīng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵而來，日本將納豆作為調(diào)味品和營養(yǎng)食品，國人把豆豉用鍋蒸后或炒后作為調(diào)味料[2]。日本學(xué)者SUMI H等[3]于1987年首次對納豆及其提取物首次作了系統(tǒng)研究，最初將酶的提取物添加到纖維蛋白平板上，發(fā)現(xiàn)有明顯的溶栓作用，并確定其屬于具有纖溶活性的激酶。

人類的健康常年受到血栓疾病的威脅，全球每年因患血栓類疾病死亡的人數(shù)多達(dá)1 200萬，其中中國約占總數(shù)的1/5[4]，因此溶栓藥物的開發(fā)成為了研究的熱點。由于納豆激酶具有高效溶栓作用，因此受到了廣泛的關(guān)注[5]。納豆激酶的來源有很多，如日本納豆食品[6]、一些海洋生物[7]、韓國醬油[8]、臺灣的土壤[9]、中國的豆豉[10]和亞洲發(fā)酵蝦醬等[11]。據(jù)報道納豆激酶可以降低纖維蛋白原、促進(jìn)催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶、增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成的作用[12]。目前，許多研究人員的重點在對高產(chǎn)納豆激酶菌株的分離篩選、納豆激酶的純化和鑒定新發(fā)現(xiàn)的纖溶酶[13-15]。本研究從我國傳統(tǒng)食品臭豆腐中篩選出一株高產(chǎn)納豆激酶菌株，并采用菌株形態(tài)特征、生理生化實驗和16SrDNA測序?qū)赀M(jìn)行鑒定，為納豆激酶的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

臭豆腐：貴州省大方縣市售；黃豆：市售有機(jī)黃豆（非轉(zhuǎn)基因）。

1.1.2 試劑

牛凝血酶、牛纖維蛋白原：沈陽拜英生物技術(shù)有限公司；尿激酶（1 240 IU/瓶）：中國藥品生物制品檢定所；溶菌酶：北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基（酪蛋白平板）：5 g/L干酪素，1 g/L葡萄糖，1 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.1 g/L MgSO4，20 g/L瓊脂，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，20g/L瓊脂，pH7.0～7.5，121℃滅菌20min。

液體種子培養(yǎng)基：10 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆清洗干凈，加入3倍體積的去離子水浸泡，常溫浸泡14～18 h，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-10超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；101-1ASB電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pHS-3CpH計：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；HYG-A全溫?fù)u瓶柜：太倉市實驗設(shè)備廠；S1000TM聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Thermal Cycler公司；Gel Doc XR凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Electron公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)納豆激酶菌株的分離與初篩

將臭豆腐切碎制成樣品懸液用8.5%的生理鹽水10倍梯度稀釋，取10-7、10-8、10-9三個稀釋度涂布于酪蛋白平板上。納豆激酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，可水解酪蛋白平板形成透明圈，根據(jù)這一特性在37℃條件下倒置培養(yǎng)24 h后挑取出8株形態(tài)不同且有明顯透明圈的菌落，在新的酪蛋白平板上進(jìn)行劃線，純化3代后，接種到斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用接種環(huán)挑選2～3環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌苔接種到液體種子培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min的條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后于4℃、10 000×g離心10 min，即得粗酶液。用直徑為2 mm的無菌膠頭吸管在酪蛋白培養(yǎng)基上均勻打孔，每平板均勻打3孔，取10μL離心后粗酶液注入平板孔（三孔為一組平行），平板放于37℃恒溫培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)結(jié)束后測量平板孔水解透明圈面積（mm2），選取水解透明圈面積最大的3株菌種進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 原料預(yù)處理與固態(tài)發(fā)酵粗酶液的制備

挑選顆粒飽滿、無蟲咬、無霉?fàn)€、無畸形、色澤淡黃的市售有機(jī)黃豆，去離子水沖洗，直至無雜物，豆水質(zhì)量比1∶3浸泡14～18 h后，分裝入三角瓶各25 g放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮20min，隨即取出放入無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行冷卻。挑取初篩得到的3株菌種2～3環(huán)菌苔接種到液體種子培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)18 h，然后按4%的接種量接種到滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)上，在37℃條件下培養(yǎng)36 h，每12 h攪拌一次。稱取2 g發(fā)酵完成的納豆溶于4 mL無菌的生理鹽水中，4℃條件下浸提24 h，用玻璃棒搗碎經(jīng)12 000×g離心10 min，再向離心管加入2 mL生理鹽水搗碎離心，上清液即為固態(tài)發(fā)酵粗酶液。

1.3.3 高產(chǎn)納豆激酶菌株的復(fù)篩

（1）纖維蛋白原平板的制作

納豆激酶活性的測定采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法[16]。首先將1%的瓊脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH 7.8）緩沖溶液中，加熱至完全溶解后，取出18 mL置于大試管中，待其冷卻至55℃左右，迅速倒入2 mL的牛血纖維蛋白原溶液（1.5 mg/100 mL），不斷振蕩使其完全混合均勻，注入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，再迅速加入1 mL牛凝血酶溶液（1 000 U溶于100mL生理鹽水），不斷晃動平皿使三者混合均勻，靜置1h后，用直徑為2mm的無菌膠頭吸管在平板上均勻打4孔。

（2）尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照楊明等[17]對瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定納豆激酶活力方法進(jìn)行的改進(jìn)。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品分別配制為248 IU/mL、496 IU/mL、744 IU/mL、992 IU/mL和1 240 IU/mL，各取10 μL點樣于新配制的纖維蛋白原平板孔中（四孔為一組平行），放置10 min，37℃培養(yǎng)16 h后取出，測定溶解圈的直徑，計算各溶解圈面積。以溶解圈的面積（x，mm2）為橫坐標(biāo)，以尿激酶酶活（y，IU/mL）為縱坐標(biāo)，繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）納豆激酶酶活力測定

取納豆激酶固態(tài)發(fā)酵粗酶液10 μL點樣于纖維蛋白平板上（四孔為一組平行），放置10 min，移入37℃培養(yǎng)箱，保溫16 h后取出，用游標(biāo)卡尺測定溶解圈的直徑并計算各溶解圈面積，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品納豆激酶酶活。

1.3.4 高產(chǎn)納豆激酶菌株的鑒定

（1）菌種形態(tài)鑒定

將復(fù)篩得到的納豆激酶酶活最高的一株菌，在酪蛋白平板上畫線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察單菌落形態(tài)，對該菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

（2）生理生化鑒定

根據(jù)第八版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[18]對菌株進(jìn)行生理生化鑒定。將菌株接入細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，37℃條件下培養(yǎng)12 h，考察對色氨酸、丙酮酸鹽、Kohn明膠、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖的利用情況。

（3）樣品中DNA提取

將復(fù)篩得到的納豆激酶酶活最高菌株接種于液體種子培養(yǎng)基，于37℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)液置于2 mL離心管，10 000×g離心6 min，重復(fù)兩次收集沉淀，取上述沉淀加入300 μL溶菌酶（質(zhì)量濃度50 mg/mL），置于37℃水浴1h，后使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

（4）16S rDNA序列鑒定

擴(kuò)增使用的上游引物為27F（AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT），下游引物為1492R（TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC）。25 μL聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為模板DNA 2 μL；27F 2.5 μL；1492R 2.5 μL；GoTaqGreen Master Mix（2×）12.5 μL；去離子水5.5 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，退火溫度從65℃降至55℃，每個循環(huán)降低0.5℃，退火時間為3 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；恒定退火溫度下進(jìn)行94℃變性1min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min。將PCR產(chǎn)物送上海生工公司測序，登錄美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）將所得序列結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比對，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)納豆激酶菌株的分離與初篩結(jié)果

通過在酪蛋白平板上稀釋涂布分離出8株菌落形態(tài)不同且具有明顯水解酪蛋白能力的菌株，分別編號為GUYR01、GUYR02、GUYR03、GUYR04、GUYR05、GUYR06、GUYR07、GUYR08。

在已經(jīng)完成菌株分離純化的基礎(chǔ)上，將菌種進(jìn)行初篩實驗，測量透明圈直徑計算水解透明圈面積，初篩結(jié)果見表1。

表1 產(chǎn)納豆激酶菌株初篩結(jié)果Table 1 Results of preliminary screening of nattokinase-producing strains

由表1可知，8株菌種溶解蛋白能力從高到低依次是：菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04、GUYR01、GUYR07、GUYR06、GUYR03、GUYR08。其中菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04的水解透明圈面積分別為（198±14.7）mm2、（190±12.6）mm2、（176±17.3）mm2明顯高于其他5株菌，所以選取水解透明圈面積最大的這3株菌種進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 高產(chǎn)納豆激酶菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

以溶解圈的面積（x，mm2）為橫坐標(biāo)，以尿激酶酶活（y，IU/mL）為縱坐標(biāo)作尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

由圖1可知，尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.201 6x－10.874，相關(guān)系數(shù)為R2為0.999 4。結(jié)果表明，二者線性關(guān)系良好。

2.2.2 產(chǎn)納豆激酶活力結(jié)果

將酪蛋白平板初篩得到的菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04進(jìn)行納豆固態(tài)發(fā)酵，離心取上清液10 μL點樣于纖維蛋白平板上，37℃條件下培養(yǎng)16 h后用游標(biāo)卡尺測量溶解圈直徑，得出溶解圈面積并放入尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行計算，結(jié)果如表2所示。

表2 復(fù)篩菌株納豆激酶活力Table 2 Nattokinase activities of secondary screening strains

由表2可知，通過瓊脂糖-纖維蛋白原平板法得到的3株納豆芽孢桿菌的納豆激酶活力分別為5 435.39 IU/g、4 813.55 IU/g和4 578.26 IU/g。國內(nèi)外有關(guān)篩選產(chǎn)納豆激酶菌株酶活力的報道多數(shù)為100～3 000 IU/g，還有部分較高納豆激酶酶活力的報道為3000～5000IU/mL[19-23]。另外，夏麗等[24]經(jīng)過紫外誘變篩選的高產(chǎn)菌株U-5納豆激酶活力均穩(wěn)定在5 440.37 IU/mL以上。董艷山等[25]以豆粕粉為氮源優(yōu)化搖瓶發(fā)酵再通過7 L發(fā)酵罐使納豆激酶活性達(dá)到6 717 IU/mL。與國內(nèi)文獻(xiàn)報道的酶活比較，本試驗所分離篩選菌株GUYR02的納豆激酶活力高達(dá)5 435.39 IU/g，屬于高產(chǎn)納豆激酶菌株。

2.2.3 高產(chǎn)納豆激酶菌株GUYR02的鑒定

（1）形態(tài)鑒定

菌株GYYR02在酪蛋白平板的單菌落形態(tài)和革蘭氏染色菌體形態(tài)見圖2。由圖2A可知，菌株GUYR02菌落在酪蛋白平板上形成圓形、扁平、有黏性的小菌落，其顏色為乳白色，邊緣規(guī)則，較濕潤，稍隆起，不透明。由圖2B可知，該菌株革蘭氏染色菌體紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀。

圖2 菌株GUYR02的菌落形態(tài)(A)及細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.2 Colonial morphology(A)and cell morphology(B)of strain GUYR02

（2）生理生化鑒定

對篩選出菌株GUYR02進(jìn)行了部分生理生化特征試驗，結(jié)果見表3。

表3 菌株GUYR02生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain GUYR02

由表3可知，菌株GUYR02能發(fā)酵丙酮酸鹽、Kohn明膠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖，不能發(fā)酵色氨酸、肌醇、鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖。

（3）16S rDNA序列分析及基因系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株GUYR02PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖見圖3，通過MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖4。

由圖3可知，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段送上海生工基因公司測序，測序結(jié)果顯示菌株GUYR0216SrDNA全長1476bp。

由圖4可知，BLAST分析結(jié)果顯示該基因同解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA基因相似度達(dá)到99%。該系統(tǒng)樹以萊西式菌（Laceyella tengchongensis）（FJ426598）作為一個單獨的外群種，其中GUYR02菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株在同一分支，結(jié)合前面的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，最后鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification products identified by agarose gel electrophoresis

圖4 菌株GUYR02的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain GUYR02

3 結(jié)論

本研究從貴州大方縣臭豆腐中分離篩選出一株高產(chǎn)納豆激酶菌株GUYR02，其在37℃、pH 7.0、培養(yǎng)36 h的固態(tài)發(fā)酵條件下，其納豆激酶產(chǎn)量可高達(dá)5 435.39 IU/g。通過對該菌株的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育分析，可以鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）。由于菌株GUYR02為野生菌未做培養(yǎng)優(yōu)化，相對其他工程菌有更大的上升空間。若對其發(fā)酵原料和工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高其產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵性能，這將能明顯改善現(xiàn)在國內(nèi)工程菌生產(chǎn)納豆激酶的產(chǎn)量不足和產(chǎn)納豆激酶菌株種類過于單一的研究現(xiàn)狀。有利于可持續(xù)發(fā)展和溶栓藥物產(chǎn)業(yè)體系的構(gòu)建，對擴(kuò)大納豆激酶產(chǎn)能和解淀粉芽孢桿菌的綜合利用范圍具有積極意義。

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Screening and identification of strains with high yield nattokinase form Dafang stinky tofu

GAO Zexin1,HE Laping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LI Cuiqin4,LIU Hanyu1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Eight nattokinase-producing strains separated from Dafang stinky tofu were investigated in the study.The ability to produce natto kinase of the strains was determined by fibrinogen plate method,and a high yield nattokinase strain GUYR02 with enzyme activity of 5 435.39 IU/g was screened.By morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis,the strain GUYR02 was identified asBacillus amyloliquefaciens.

Dafang stinky tofu;nattokinase;screening;identification;Bacillus amyloliquefaciens

Q939.97

0254-5071（2017）07-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.013

2017-05-01

貴州省重大專項（黔科合重大專項字[2015]6004-5號）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合支撐[2016]2580號）

高澤鑫（1993-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化。