醬香型白酒酒糟中生香酵母的篩選及鑒定

蔡雪梅，吳聯(lián)海，陳夢圓，陳劍，王坤玲，楊柳，羅愛民*

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610064；2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺618200）

醬香型白酒酒糟中生香酵母的篩選及鑒定

蔡雪梅1，吳聯(lián)海2，陳夢圓1，陳劍1，王坤玲1，楊柳2，羅愛民1*

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610064；2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺618200）

從醬香型白酒酒糟中通過液態(tài)發(fā)酵初篩獲得7株高產乙酸乙酯的菌株，將其進行固態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵產物經氣相色譜（GC）檢測共得到64種揮發(fā)性化合物，通過主成分分析表明，菌株Y3、Y19和Y22的發(fā)酵產物相似。其中，菌株Y3和Y19的乙酸乙酯產量顯著高于其他菌株（P＜0.05），其次是菌株Y22，但與對照組相比，菌株Y19的吡嗪產量顯著減少（P＜0.05），菌株Y22的高級醇產量顯著增加（P＜0.05），均不利于醬香型白酒的生香呈味。故最終選用菌株Y3為生香酵母，通過菌種鑒定，確定該菌株為畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

醬香型白酒；酒糟；生香酵母；篩選；乙酸乙酯

醬香型白酒是我國傳統(tǒng)白酒三大基本香型之一，在其釀造過程中，酵母的種類和數(shù)量對醬酒的風味和品質有重要的影響[1-2]，根據(jù)酵母的功能，可分為釀酒酵母和生香酵母[3]。釀酒酵母具有較強的發(fā)酵產酒精能力[4]，而生香酵母則對酸、醇有不同程度的酯化能力，生產代謝以酯香為主的多種風味化合物，是酯的主要來源，這些香味物質是產生酒體芳香及促進酒體豐滿的關鍵化合物[5]。生香酵母所產的酯類中以乙酸乙酯為主，乙酸乙酯主要表現(xiàn)為水果香和甜香，對醬香型白酒香氣貢獻較大[6-7]，通過向酒糟中添加篩選得到生香酵母可提高白酒中乙酸乙酯的含量，提升醬香型白酒的品質。

醬香型白酒“四高兩長”的獨特釀造工藝造就了大曲和酒糟中特殊的微生物體系[8]，高溫大曲是細菌的主要的來源，而酵母主要來源于酒糟攤涼的地面和空氣[9]，酒糟經過堆積之后，微生物得到大量富集。因此本研究從堆積后的酒糟中進行生香酵母的篩選。以乙酸乙酯為主要評介指標，利用液態(tài)單菌發(fā)酵進行初篩，再模擬工廠加入高溫大曲進行固態(tài)發(fā)酵，目的是篩選得到適宜應用于醬酒生產的生香酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒糟：采集于四川二郎鎮(zhèn)某名優(yōu)酒廠醬香型白酒車間第四輪正常堆積后的酒糟；大曲：取自同一酒廠的高溫成品大曲；糠殼：取自同一酒廠；高粱：市售；乙酸、甘油、無水氯化鈣（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏4.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖50.0 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，硫酸錳0.0025g/L，瓊脂20.0g/L，溴甲酚綠0.022g/L，調pH值至6.5。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L。121℃高壓滅菌20 min，備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中添加葡萄糖10%、乙酸0.5%、體積分數(shù)95%的乙醇5%，調整pH為4.0。

上述培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌20 min，備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：整粒高粱/粉碎高粱=7∶3，潤洗浸泡2 h，高溫蒸4 h，無菌環(huán)境中攤涼后加入27%去雜稻殼。1.2儀器與設備

IKAVORTEX1振蕩儀：萊貝（上海）科學儀器有限公司；JA1203分析天平：上海楚定分析儀器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；MJPS-250型生化培養(yǎng)箱：上海歐史拓爾實業(yè)（集團）有限公司；GC-2010氣相色譜儀：美國安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生香酵母的分離與純化

稱取25 g混勻的酒糟于225 mL無菌生理鹽水中，120 r/min常溫振蕩30 min，吸取上清液稀釋至10-4倍，取0.1 mL均勻涂布于添加80 mg/L氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基表面，30℃培養(yǎng)48 h，挑取長勢良好的單菌落劃線轉接到WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)72 h，長出的單菌落再次劃線至完全純化。

1.3.2 菌種保存

將分離純化得到的酵母菌編號，并轉接于YPD固體斜面培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆?。同時，再接種單菌落到YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24h，添加等體積的50%無菌甘油，混勻后分裝入2.0mL無菌EP管中，-20℃長期保存。

1.3.3 菌懸液的制備

酵母菌在YPD液體培養(yǎng)基中活化后，用無菌水稀釋，采用紫外分光光度法，調節(jié)光密度OD560nm值為0.5左右，使其菌含量相等，備用。

1.3.4 揮發(fā)性化合物的提取

稱取25.00 g樣品于150 mL磨口三角瓶中，加入1%的無水CaCl2、50 mL的體積分數(shù)為57%乙醇溶液，浸泡搖勻，在25℃條件下經超聲波浸提60 min后，10 000 r/min離心10 min提取上清液，做3個平行樣，將得到的上清液合并，用0.22 μm濾膜過濾，得到待測樣品。

1.3.5 氣相色譜條件

采用毛細管氣相色譜（gas chromatograph，GC）法，氫火焰離子化檢測器檢測樣品，以標準品保留時間定性，叔戊醇、乙酸正戊醇和2-乙基丁酸作內標定量。其色譜條件：CPWAX彈性石英毛細管柱（50.0 m×0.25 mm×0.25 μm）分離；載氣為高純氮氣（N2），流速為0.9mL/min；氫火焰離子化檢測器（flame ionization ditector，F(xiàn)ID）溫度230℃；升溫程序：起始溫度40℃，5min平衡時間，以3℃/min升溫至100℃，維持2 min，再以10℃/min升溫至210℃，維持30 min；不分流。每檢測15個樣品后用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液洗脫毛細管柱。

1.3.6 生香酵母的篩選

初篩（液態(tài)發(fā)酵）：將制備好的菌懸液以2%接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、120r/min條件下培養(yǎng)5d。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液于4000r/min條件下離心15 min，取上清液用0.22 μm細菌濾膜過濾，待氣相色譜檢測。

復篩（固態(tài)發(fā)酵）：將固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的水分控制在50%左右，添加3%乙酸，11%大曲，2%酵母菌懸液，拌勻后每300 g分裝入1 000 mL無菌錐形瓶中，八層紗布封口，置于恒溫恒濕（相對濕度10%）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，第0～4天培養(yǎng)溫度分別為：30℃、35℃、40℃、45℃。發(fā)酵結束后，參照1.3.3的方法提取揮發(fā)性化合物，待氣相色譜法檢測。

1.3.7 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)學鑒定

細胞形態(tài)觀察：接種酵母菌到YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將活化后的酵母菌制片在40倍下觀察細胞形態(tài)。

菌落形態(tài)觀察：將酵母菌劃線轉接于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)72 h后觀察其在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上顏色、大小、質地、凸起程度、邊緣是否整齊、表面是否光滑等菌落形態(tài)特征。

（2）菌株18S rDNA鑒定

真菌基因組DNA提取使用成都福際生物技術有限公司土壤DNA試劑盒。用以下引物對菌株DNA進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：ITS1：5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′；PCR擴增體系（50 μL）：25 μL MIX（0.1 UTaq聚合酶/μL，500 μmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），20 mmol/L Tris-HCl/pH 8.3，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2），19 μL ddH2O，2 μL ITS1，2 μL ITS4，2 μL DNA；PCR擴增反應條件：94℃預變性10 min：94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃終延伸8 min，4℃保存。將PCR擴增產物送擎科生物（成都）進行序列測定，再將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，通過DNAMAN構建同源樹。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對酵母發(fā)酵產物風味化合物的檢測結果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和方差分析。

2 結果與分析

2.1 生香酵母的初篩

通過對酒糟的分離純化，結果見表1。由表1可知，共得到26株菌落形態(tài)和細胞形態(tài)不同的酵母菌株，將其分別進行液態(tài)發(fā)酵初篩，發(fā)酵液揮發(fā)性化合物進行GC檢測，根據(jù)乙酸乙酯含量，選出7株乙酸乙酯產量較高的菌株，其編號分別為Y22、Y19、Y15、Y20、Y11、Y12、Y3。

表1 不同菌株發(fā)酵液中乙酸乙酯含量Table 1 Results of ethyl acetate contents in fermentation broth of different strains mg/100 mL

2.2 生香酵母的復篩

將液態(tài)發(fā)酵初篩得到的7株產乙酸乙酯能力較好的酵母菌株進行固態(tài)發(fā)酵，結果見表2。由表2可知，復篩模擬酒廠車間酒糟堆積發(fā)酵，對照樣只添加高溫大曲，發(fā)酵結束后提取香氣成分，進行GC檢測，共檢測到64種揮發(fā)性化合物，其中醇類18種，酯類22種，酸類11種，醛類6種，酮類4種，吡嗪類2種，酚類1種。

表2 不同菌株固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性物質氣相色譜檢測結果Table 2 Results of volatile compounds in solid-state fermentation of different strains analysis by GC mg/100 mL

化合物對照組Y3Y11Y12Y15Y19Y20Y22己酸乙酯0.73±0.370.46±0.170.27±0.070.51±0.210.52±0.300.30±0.060.83±0.420.30±0.24甲酸乙酯1.52±0.710.79±0.221.29±0.990.76±0.181.23±0.130.58±0.001.87±0.111.54±0.46壬酸乙酯0.57±0.300.13±0.070.33±0.240.33±0.110.32±0.0300.37±0.080.33±0.26乳酸乙酯0.31±0.081.93±0.061.39±0.311.76±0.012.13±1.991.6±1.191.63±1.071.71±2.41十二酸乙酯0.26±0.000.09±0.020.26±0.160.22±0.160.20±0.080.26±0.130.31±0.080.43±0.18戊酸乙酯00.11±0.020.19±0.070.19±0.060.17±0.120.28±0.180.46±0.030.40±0.02辛酸乙酯0.58±0.050.25±0.050.42±0.390.50±0.050.08±0.060.40±0.020.85±0.380.53±0.18乙酸丁酯0.58±0.450.27±0.370.16±0.040.07±0.0100.25±0.571.11±0.300.61±0.14乙酸己酯0.55±0.180.40±0.280.19±0.010.58±0.140.39±0.300.32±0.350.90±0.230.36±0.51乙酸乙酯3.07±0.9327.03±8.4610.88±4.428.48±0.8814.76±2.6527.25±4.2511.08±0.8019.42±4.82乙酸異戊酯00.43±0.100.25±0.020.27±0.140.25±0.030.52±0.300.65±0.170.40±0.56異丁酸乙酯00.16±0.000.25±0.020.29±0.080.12±0.090.16±0.0000.60±0.00異戊酸乙酯0.25±0.010.08±0.040.35±0.15000.0.95±0.170.67±0.04油酸乙酯0.21±0.030.06±0.020.41±0.350.21±0.080.32±0.020.24±0.041.12±0.710.51±0.09棕櫚酸乙酯0.15±0.060.12±0.080.31±0.020.05±0.010.11±0.040.23±0.110.33±0.190.18±0.25丙酸3.79±1.731.07±0.112.00±1.023.22±0.712.83±0.401.66±0.114.25±1.151.66±1.24丁酸1.17±1.001.70±0.042.57±0.952.21±0.771.62±1.241.37±0.650.99±0.520.80±0.18庚酸00.13±0.070.16±0.020.21±0.010.06±0.030.37±0.150.40±0.020.19±0.09癸酸0.53±0.190.52±0.061.76±1.122.24±0.151.15±0.090.53±0.071.02±0.491.22±1.01己酸0.15±0.040.26±0.060.05±0.010.73±0.570.55±0.490.45±0.120.60±00.36±0.02十二酸0.37±0.040.10±0.010.26±0.030.30±0.060.25±0.040.32±0.030.12±0.010.62±0.04戊酸0.60±0.250.23±0.180.31±0.240.70±0.230.39±0.070.20±0.020.84±0.440.71±0.16辛酸0.16±0.030.05±0.0300.30±0.080.10±0.0600.13±0.010異丁酸0.60±0.400.85±0.140.91±0.080.60±0.021.05±0.401.43±0.650.50±0.022.28±0.47異戊酸0.19±0.030.61±0.190.73±0.640.42±0.320.54±0.290.65±0.390.43±0.030.64±0.20油酸1.00±0.780.64±0.541.39±0.130.95±0.391.61±0.201.15±0.261.71±0.551.89±0.74 4-乙基苯酚2.92±1.201.24±0.221.46±0.931.00±0.071.76±0.480.84±0.212.84±0.711.01±0.03 2,3-丁二酮3.08±0.980.92±0.410.55±0.381.45±1.021.26±0.300.30±0.101.97±0.381.40±0.48 2-戊酮0.08±0.0200.06±0.02000.10±0.010.25±0.100.13±0.04 3-羥基丁酮1.37±0.395.51±1.720.41±0.201.57±0.285.27±0.381.97±0.390.87±0.371.04±0.28丙酮0.25±0.010.29±0.210.60±0.340.13±0.080.19±0.070.34±0.230.28±0.060.61±0.33三甲基吡嗪3.35±0.361.37±0.371.52±0.031.43±0.101.04±0.380.23±0.052.34±1.030.95±0.58四甲基吡嗪0.47±0.270.17±0.050.42±0.200.11±0.010.31±0.050.08±0.020.26±0.200.43±0.34乙縮醛1.53±0.792.23±0.191.79±0.161.15±0.291.99±0.392.46±1.051.79±0.291.31±0.93異丁醛0.20±0.030.07±0.040.25±0.310.16±0.100.19±0.010.07±0.040.31±0.020.23±0.11異戊醛0.64±0.030.39±0.060.15±0.020.41±0.200.36±0.300.35±0.060.58±0.030.59±0.26 2-甲基丁醛0.19±0.090.14±0.0600.27±0.2600.98±0.3800.71±0.20苯甲醛3.34±1.031.42±0.934.93±0.941.86±1.022.53±0.284.02±0.374.37±1.035.01±0.78糠醛9.03±2.984.26±1.738.15±1.078.64±3.036.94±2.017.01±3.127.07±1.496.04±1.02

2.2.1 主成分分析

通過SPSS19.0軟件對7株菌株復篩產物的64種化合物進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)前兩個主成分方差累計貢獻率達94.895%（PC1=48.06%，PC2=46.85%），其主成分分析結果見圖1。由圖1可知，主成分1包括酵母Y11、Y12、Y15和Y20，主成分2包括酵母Y3、Y19、Y22，說明菌株Y11、Y12、Y15和Y20的發(fā)酵產物具有一定的相似性，菌株Y3、Y19和Y22的發(fā)酵產物具有一定的相似性。

圖17 株菌株主成分分析圖Fig.1 Principal components analysis of 7 strains

2.2.2 不同生香酵母產生揮發(fā)性物質比較

不同生香酵母揮發(fā)性物質含量的比較結果見圖2。由表2及圖2可知，與對照組相比，7株酵母均能將乙酸乙酯含量顯著提高（P＜0.05），其中菌株Y3和Y19乙酸乙酯產量較高，分別為27.25 mg/100 mL、27.03 mg/100 mL，且兩者之間不存在顯著差異（P＞0.05），其次是菌株Y22，其乙酸乙酯產量為19.42 mg/100 mL，與菌株Y3和Y19均存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，菌株Y3、Y19、和Y22的總酯含量三者之間均存在顯著差異（P＜0.05），其含量分別為40.28 mg/100 mL、34.99 mg/100 mL、31.37 mg/100 mL。

圖2 不同菌株揮發(fā)性物質含量的比較Fig.2 Comparison of volatile compounds contents from different strains

另外，與對照組相比，添加酵母后吡嗪含量均減少，其中菌株Y19的吡嗪含量最低，僅0.31 mg/100 mL，而只添加大曲發(fā)酵的對照組吡嗪含量為3.82 mg/100 mL。吡嗪主要來源于大曲及堆積過程中芽孢桿菌的代謝[10]，添加的菌株可能對產吡嗪的芽孢桿菌生長代謝有所抑制。

此外，添加酵母后總酚含量減少，菌株Y20與對照組總酚含量不存在顯著性差異（P＞0.05），而其他菌株與對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）。另外，菌株Y3的總醛產量比對照組顯著減少（P＜0.05）。添加酵母后高級醇（包括異戊醇、正丙醇、正丁醇、正己醇、正戊醇、正辛醇、仲丁醇、仲戊醇）含量均比對照組提高，其中菌株Y22高級醇含量比對照組顯著提高（P＜0.05），其含量達20.10 mg/100 mL，比已有研究報道中的含量均高[11-12]。這可能是因為菌株Y22不僅自身具有一定的產高級醇能力，還能夠與其他微生物相互作用促進了高級醇的產生。

2.2.3 復篩結果

菌株Y3、Y19、和Y22產酯能力均較強，但菌株Y19會降低吡嗪產量，吡嗪尤其是四甲基吡嗪是白酒中的主要功能性成分之一，已經引起行業(yè)的廣泛關注[10]。菌株Y22使高級醇產量增加，適量的高級醇能使酒體豐富，但是過量的高級醇不僅會給酒的風味帶來邪雜味還對人體有害[13-14]。故為降低對其他風味物質的影響，最終選取菌株Y3作為后期工廠酒糟堆積發(fā)酵實驗的生香酵母。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)學觀察

對菌株Y3進行細胞形態(tài)觀察，并劃線于WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，結果見圖3。由圖3可知，菌株Y3細胞呈橢圓形，在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈淡綠帶黃色，邊緣褶皺，中央凸起，面粉狀，可以初步鑒定菌株Y3為畢赤酵母屬（Pichia）[15-17]。

圖3 菌株Y3的細胞形態(tài)(a)和菌落形態(tài)(b)Fig.3 Cell morpholopy(a)and colony morphology(b)of strain Y3

2.3.2 菌株的分子鑒定

對菌株Y3的18SrDNA的PCR擴增產物進行序列測序，將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，獲得與測序菌株序列相近種、屬的18S rDNA序列，通過DNAMAN構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株Y3與畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）相似性達99%，鑒定菌株Y3為畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

圖4 菌株Y3 18S rDNA序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 18S rDNA squences of strain Y3

3 結論

通過單菌液態(tài)發(fā)酵從醬香型白酒堆積后的酒糟中篩選出7株高產乙酸乙酯的酵母菌株，將其模擬工廠固態(tài)發(fā)酵進行復篩，發(fā)酵產物經GC檢測共得到64種揮發(fā)性化合物，經PCA分析，得到兩個主成分，其中主成分1包括酵母Y11、Y12、Y15和Y20，主成分2包括酵母Y3、Y19、Y22。菌株Y3和Y19的乙酸乙酯產量較高，且不存在顯著差異（P＞0.05），其次是Y22。但菌株Y19的吡嗪產量顯著減少（P＜0.05），Y22的高級醇產量顯著增加（P＜0.05），均不利于醬香型白酒的生香呈味。故菌株Y3更適合應用于生產實踐，提高白酒中乙酸乙酯的含量，提升醬香型白酒的品質。經過形態(tài)學觀察和分子鑒定，確定Y3菌株為Pichia kudriavzevii。關于生產實踐，則還需要進行工廠酒糟堆積發(fā)酵實驗，作進一步的研究探討。

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Screening and identification of aroma-producing yeast in distiller's grains of Moutai-flavorBaijiu

CAI Xuemei1,WU Lianhai2,CHEN Mengyuan1,CHEN Jian1,WANG Kunling1,YANG Liu2,LUO Aimin1*
(1.College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610064,China; 2.Sichuan Langjiu Group Co.,Ltd.,Gulin 618200,China)

Seven aroma-producing yeasts with high yield ethyl acetate were isolated from Moutai-flavorBaijiuthrough primary screening by liquidstate fermentation.Total 64 flavor compounds were detected by GC from products of solid-state fermentation.Then according to principal component analysis(PCA),results showed that strain Y3,Y19 and Y22 produced similar flavor compounds.The ethyl acetate yield of strain Y3 and Y19 was significantly higher than others,then followed by strain Y22(P＜0.05).But compared to the control,the pyrazine yield of strain Y19 reduced significantly(P＜0.05)and the higher alcohols yield of strain Y22 increased significantly(P＜0.05),which went against the flavoring of Moutai-flavor Baijiu.So strain Y3 was screened as aroma-producing strain and identified asPichia kudriavzevii.

Moutai-flavorBaijiu;distillers'grains;aroma-producing yeast;screening;ethyl acetate

TS261.1

0254-5071（2017）07-0042-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.010

2017-04-19

四川省科技支撐計劃項目（2016GZ0366）

蔡雪梅（1994-），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：羅愛民（1971-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。