PB試驗優(yōu)化德氏乳桿菌增殖培養(yǎng)基的研究

蔣艾廷，李寶坤*，金丹，趙利利，喬傳麗

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

PB試驗優(yōu)化德氏乳桿菌增殖培養(yǎng)基的研究

蔣艾廷，李寶坤*，金丹，趙利利，喬傳麗

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

試驗對一株來源于傳統(tǒng)酸奶的優(yōu)良德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）ATx生長所需的增殖因子進行了研究。在MRS培養(yǎng)基的基礎上，測定了菌株ATx的生長曲線，并選取谷氨酸鈉、磷酸吡哆醛、抗壞血酸、啤酒、乳糖、胡蘿卜汁、番茄汁、pH為增殖因子。采用單因素試驗確定每個因子的最優(yōu)水平，Plackett-Burman試驗考察各因子對菌株ATx細胞增殖的影響，通過最陡爬坡與中心組合試驗對增殖因子進行優(yōu)化。結果表明，谷氨酸鈉、啤酒以及pH對菌株ATx的增殖具有顯著影響（P＜0.05），當MRS培養(yǎng)基中添加谷氨酸鈉21.5 g/L、啤酒26.8 mL/L、初始pH值為6.4時，德氏乳桿菌ATx的活菌數(shù)最大為（7.56±0.23）×109CFU/mL，為高活性發(fā)酵劑的制備提供了理論參考。

德氏乳桿菌；生長曲線；增殖因子；Plackett-Burman試驗

隨著乳酸菌對人體益生作用的不斷深入研究與揭示，乳酸菌類制品逐漸受到人們的青睞，發(fā)酵乳制品的消費量呈快速增長趨勢，各類乳酸菌制品也層出不窮[1]。研究表明[2]，進入腸道內的乳酸菌必須具備足夠的數(shù)量與充足的活力，才能發(fā)揮其生物功效。GB 7101—2015《食品國家標準飲料》規(guī)定活菌型乳酸菌飲料中的乳酸菌數(shù)應高于106CFU/g（mL）；日本發(fā)酵乳與乳酸菌飲料協(xié)會規(guī)定發(fā)酵乳中的益生菌數(shù)高于107CFU/mL[3]。此外在發(fā)酵乳制品的加工與生產過程中，發(fā)酵菌種保持較高的細胞活力，能夠極大地縮短發(fā)酵時間、降低能耗，但乳酸菌屬于異養(yǎng)型微生物，需要從外界吸收一些氨基酸、維生素等生長因子才能維持正常生長[4]。如何研制出高濃度且活力強的乳酸菌，已經成為限制中國乳品工業(yè)發(fā)展的一個瓶頸因素。

國內外許多研究人員[5-7]對乳酸菌增殖培養(yǎng)基進行了優(yōu)化分析，大多采用均勻設計、正交試驗以及響應面分析等方法，過程相對繁瑣且優(yōu)化效果不明顯[8]。本試驗擬以一株產酸快、凝乳時間短的優(yōu)良德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）為試驗菌株，基于軟件Design-Expert，在Plackett-Burman（PB）試驗基礎上，采用最陡爬坡與中心組合試驗，設計從8種增殖因子中快速篩選幾種主要因子，優(yōu)化培養(yǎng)基的配方，具有周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點，為德式乳桿菌高密度培養(yǎng)提供理論基礎與實踐依據(jù)[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：德氏乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckii）ATx，從新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中分離，由石河子大學食品學院保存。

MRS肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉5 g/L、結晶乙酸鈉5 g/L、酵母粉4 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、K2HPO4·7H2O 2 g/L、吐溫80 1 mL/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·4H2O 0.04 g/L，調節(jié)pH值至6.0～6.6，121℃滅菌20 min。此培養(yǎng)基主要用于活化菌種。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入1.8%的瓊脂，煮沸熔化滅菌而成。

增殖培養(yǎng)基：按照單因素試驗設計，向MRS基礎培養(yǎng)基中添加各增殖因子后用蒸餾水補足至所需體積配成。

乳糖、磷酸吡哆醛（維生素B6）、抗壞血酸（維生素C）、谷氨酸鈉（分析純）：上海瑞永生物科技有限公司。

番茄汁：將經過挑選、洗凈的番茄破碎，然后連續(xù)打漿和紗布過濾分離，濾液8 000 r/min離心后取上清液，4℃保藏備用。胡蘿卜汁：對胡蘿卜進行選料、清洗、切片，放入燒杯加入3倍質量的蒸餾水100℃煮30～40 min，冷卻后進行打漿，紗布過濾后于8 000 r/min離心，完成后取上清液4℃保藏備用。啤酒：本試驗采用的啤酒均為烏蘇啤酒，麥芽汁濃度為9°P。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；XB-3200C型電子天平：上海精科上海天平儀器廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；Neoluge 15R型臺式高速冷凍離心機：香港力康發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線的測定

將保藏的菌株ATx活化2次，待恢復活力后，再按3%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，每3h進行一次菌落計數(shù)，計數(shù)方法采用平板計數(shù)法[14]，平行3次，取平均值。

1.3.2 種子液的制備

活化后的乳酸菌按3%的接種量接入培養(yǎng)基中，根據(jù)乳酸菌的生長曲線，確定合適菌齡的乳酸菌作為種子液。

1.3.3 單因素試驗

乳酸菌的增殖需要多種的生長因子，國內外已有許多研究人員[15-19]通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化增殖培養(yǎng)基的組成，有效的提高了培養(yǎng)基中的活菌數(shù)，根據(jù)文獻記載[20-21]，在MRS基礎培養(yǎng)基中添加一定量的磷酸吡哆醛、抗壞血酸、啤酒、胡蘿卜汁、番茄汁、乳糖以及谷氨酸鈉能夠促進乳酸菌的生長，此外改變培養(yǎng)基初始pH對乳酸菌的增殖也有較大的影響[22]。本試驗在MRS肉湯的基礎上，配制成含有不同質量濃度的上述增殖因子的培養(yǎng)基，谷氨酸鈉的添加量為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L；啤酒、胡蘿卜汁、番茄汁的添加量均分別為10 mL/L、30 mL/L、50 mL/L、70 mL/L；磷酸吡哆醛與抗壞血酸的添加量均分別為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L；乳糖的添加量為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，進行單因素試驗，試驗平行3次，取平均值，通過平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

根據(jù)單因素試驗中各增殖因子的最佳濃度，對谷氨酸鈉（A）、磷酸吡哆醛（B）、抗壞血酸（C）、胡蘿卜汁（D）、番茄汁（E）、啤酒（F）、乳糖（G）、初始pH（H）8個因子進行考察，每個因子分別取低（-1）和高（+1）2個水平，其中低水平為單因素試驗結果的最佳濃度，高水平取低水平的1.5倍，為了確保試驗的準確性，本次試驗設計含有3個虛擬項，因此選取N=12的PB設計，以活菌數(shù)為響應值（Y），篩選對德氏乳桿菌ATx具有影響顯著的增殖因子，試驗平行3次，取平均值。

1.3.5 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB設計的結果，由各因素效應值的大小確定變化的步長。按一定的梯度增加或者減少各因素的水平值，檢測增殖培養(yǎng)基中乳酸菌活菌數(shù)的變化，活菌數(shù)最高組的水平值即為中心組合設計優(yōu)化分析的中心組。

1.3.6 中心組合設計

將PB試驗篩選的3個顯著因素作為試驗因素，最陡爬坡試驗確定的最佳水平作為中心點，采用Design-Expert 8.05中的中心組合設計（central composite design，CCD）對增殖培養(yǎng)基的成分進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 德氏乳桿菌ATx生長曲線的測定

為了解德氏乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中的生長情況，測定了36 h內乳酸菌的生長曲線，結果見圖1。以便于準確地掌握種子液的制備時間，確保乳酸菌的活性最大。

圖1 德氏乳桿菌ATx的生長曲線Fig.1 Growth curve ofL.delbrueckiiATx

由圖1可知，德氏乳桿菌ATx從一開始菌數(shù)急增，由于菌株活化2次后活力較強，短時間的延滯期后立即進入對數(shù)生長期（2～18 h），21 h達到高峰并進入生長穩(wěn)定期，此后菌數(shù)基本不再增加并稍有下降的趨勢，該菌株的生長符合單細胞微生物的典型生長規(guī)律。經驗證，如果用于接種的種子液處于對數(shù)后期或穩(wěn)定前期則子代培養(yǎng)物的適應期就短，因此為了縮短生產周期，通常都選用處于對數(shù)后期的種子接種。本試驗選用培養(yǎng)16～18h的菌體作為種子液。

2.2 單因素試驗結果

以培養(yǎng)16 h的菌體為種子液，接種量均為3%，接入含不同濃度增殖因子的培養(yǎng)基中于37℃靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為16 h。通過菌落計數(shù)確定各增殖因子的最佳濃度見表1。

表1 單因素試驗結果Table 1 Results of single factor experiments

2.3 Plackett-Burman試驗結果

PB試驗設計及結果見表2。

表2 Plackett-Burman試驗結果Table 2 Results of Plackett-Burman experiments

利用Design-Expert 8.05軟件對PB試驗結果進行分析，其因子影響效果與回歸模型方差分析見圖2與表3。

圖2 各增殖因子對菌株ATx生長影響的比較Fig.2 Comparison of effects of proliferation factors on strain ATx growth

由圖2可知，因子A、B、C、D、F、G、H對德氏乳桿菌ATx有負效應，即在一定濃度范圍內，菌體濃度隨著增殖因子濃度降低而增大。因子E則具有正效應，即在一定濃度范圍內，菌體濃度隨著增殖因子濃度增大而增大。這8個因子對德氏乳桿菌ATx生長的影響順序依次為F＞A＞H＞C＞G＞B＞D＞E，其中E對ATx生長的影響最小為0.21%，C、G、B、D的影響較大，為4%～12%，F(xiàn)、A、H對菌株ATx生長的影響最大。

表3 PB試驗回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of PB experiments

由表3可知，所得的回歸方程達到顯著（P＜0.05），決定系數(shù)R2=0.967 8，這表明有96.78%的試驗數(shù)據(jù)可用此回歸模型來解釋。本次試驗的8個因子中，啤酒（P＜0.05）、谷氨酸鈉（P＜0.05）、培養(yǎng)基的初始pH（P＜0.05），對德氏乳桿菌ATx生長的影響最大，其置信度分別為98.34%、98.24%、97.31%，其他因子對菌株ATx增殖在95%的概率水平上差異均不顯著。因此，選擇谷氨酸鈉、啤酒及培養(yǎng)基的初始pH作為ATx生長的增殖因子。

2.4 中心組合試驗結果與分析

由最陡爬坡試驗結果（表4）可知，第3組試驗中乳酸菌的活菌數(shù)最高，故將其水平作為CCD試驗的中心點，以第二組的試驗結果作為高（+1）水平，第三組試驗結果作為低（-1）水平。采用CCD試驗設計確定德氏乳桿菌的最佳培養(yǎng)基配方。試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。對試驗設計結果進行回歸擬合分析，得到二次多元回歸模型：

Y=74.21-2.52A+3.73B-3.62C-3.50AB+2.40AC+0.50BC-3.41A2-9.92B2-7.30C2

由表6可知，該模型（P＜0.001）極其顯著，失擬項（P= 0.793 3＞0.05）不顯著，說明模型的擬合性較好。模型的決定系數(shù)R2=0.983 1，調整決定系數(shù)R2adj=0.967 9，表明響應面的96.79%的變化可以由此模型解釋，預測決定系數(shù)R2pred= 0.9430接近R2adj，表明模型與實際情況擬合得較好。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為3.55%，說明試驗數(shù)據(jù)可靠、分析結果可信，可用此模型對試驗結果進行分析和預測。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

表5 中心組合設計及結果Table 5 Design and results of central composite experiments

表6 中心組合試驗回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation of central composite design

利用Design-Expert8.05軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各因素交互作用的響應面和等高線（見圖3）。用此回歸模型預測啤酒與谷氨酸鈉的添加量分別為26.81 mL/L、21.46g/L，初始pH值為6.37時，德氏乳桿菌的活菌數(shù)最大預測值為7.68×109CFU/mL。為方便實際操作，修改條件為啤酒與谷氨酸鈉的添加量分別為26.8 mL/L、21.5 g/L，初始pH值為6.4，此時德氏乳桿菌ATx的活菌數(shù)為7.56×109CFU/mL，與預測值相近，可見該模型能較好地預測實際培養(yǎng)基中德氏乳桿菌的活菌數(shù)，與基礎培養(yǎng)基相比活菌數(shù)提高了約6.8倍。

圖3 啤酒添加量、谷氨酸鈉添加量、初始pH值交互作用對乳酸菌活菌數(shù)影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of beer addition,sodium glutamate addition and initial pH on viable counts of lactic acid bacteria

3 結論

本試驗通過Plackett-Burman試驗得出，啤酒、谷氨酸鈉與培養(yǎng)基的初始pH值是影響德氏乳桿菌生長的關鍵因子。通過回歸模型確定增殖培養(yǎng)基的配方為在MRS基礎培養(yǎng)基中加入26.8mL/L的啤酒、21.5g/L的谷氨酸鈉，初始pH值為6.4，最終德氏乳桿菌活ATx菌數(shù)為（7.56±0.23）×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高了約6.8倍，為德氏乳桿菌高密度培養(yǎng)確定了適宜的培養(yǎng)基組成，進而為其工業(yè)化生產奠定良好的基礎。針對德氏乳桿菌高密度培養(yǎng)技術，如補料分批培養(yǎng)、細胞循環(huán)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)等還需要后續(xù)深入研究。

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Optimization of proliferation medium forLactobacillus delbrueckiiby PB experiments

JIANG Aiting,LI Baokun*,JIN Dan,ZHAO Lili,QIAO Chuanli
(College of Food Engineering,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

The proliferative factors required for the growth of a high quality strainLactobacillus delbrueckii,named ATx,which isolated from the traditional yogurt was studied.On the basis of MRS medium,the growth curve of strain ATx was determined and sodium glutamate,pyridoxal phosphate,ascorbic acid,beer,lactose,fresh carrot juice,tomato juice and pH were selected as proliferative factors.The optimal level of each factor was determined by single factor experiments,the effects of various factors on the proliferation of strain ATx cells was investigated by Plackett-Burman experiments,and the optimal proliferative factors were optimized by the steepest ascent and central composite tests.The results showed that sodium glutamate,beer and pH had a significant effect on the proliferation of strain ATx(P＜0.05).When the MRS medium components were monosodium glutamate 21.5 g/L,beer 26.8 ml/L,and when the initial pH was 6.4,the maximum viable count of strain ATx was(7.56±0.23)×109CFU/ml,which provided theoretical references for production of starter culture with high viability.

Lactobacillus delbrueckii;growth curve;proliferative factor;Plackett-Burman experiment

Q93-335

0254-5071（2017）07-0032-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.008

2017-04-20

國家自然科學基金（31560444）；石河子大學重點科技攻關（gxjs2014-zdgg07）

蔣艾廷（1993-），男，碩士研究生，研究方向為乳品微生物。

*通訊作者：李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為乳品微生物。