鵝呼腸孤病毒GRV-LA16株的分離鑒定

吳巧梅，李傳峰，丁明洋，朱 杰，譚永貴，李 琦，劉光清，陳宗艷

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

鵝呼腸孤病毒GRV-LA16株的分離鑒定

吳巧梅，李傳峰，丁明洋，朱 杰，譚永貴，李 琦，劉光清，陳宗艷

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為探明安徽省某養(yǎng)鵝場(chǎng)60日齡鵝出現(xiàn)的軟腳，排白色糞便，嚴(yán)重者導(dǎo)致鵝死亡的原因，對(duì)病死鵝進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其以肝臟腫大，脾臟腫大和壞死以及肺臟充血、出血為主要特征。對(duì)分離毒株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)、序列分析及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，結(jié)果表明，該分離毒株為鵝呼腸孤病毒（Goose reovirus，GRV），命名為GRV-LA16株，其ELD50為10-5.7/0.2 mL。病理組織切片結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肺泡壁脹破融合，毛細(xì)血管擴(kuò)張出血，且肺泡腔有紅色絲網(wǎng)狀纖維素滲出物。σC基因測(cè)序結(jié)果分析表明，其與鴨呼腸孤病毒σC基因同源性為87%。GRV-LA16與鴨呼腸孤病毒親緣關(guān)系較近，為同一拓?fù)淙?，而與經(jīng)典的禽呼吸腸孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）、GRV、番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）處于不同拓?fù)淙骸?/p>

鵝呼腸孤病毒；分離鑒定; σC基因

禽呼腸孤病毒（Avian orthoreoviruses，ARV）為呼腸孤病毒科（Reoviridae）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）的成員之一，可感染多種禽類[1]，包括雞、火雞、鴕鳥(niǎo)、水禽、野鴨等禽類，能引起雞的吸收障礙綜合征、腱鞘炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、矮小綜合征、免疫抑制等疾病[2,3]，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一。就水禽而言，有引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）[4]，引起番鴨發(fā)病的呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,6]，近年也有引起鵝發(fā)病的呼腸孤病毒（Goose reovirus，GRV）報(bào)道[7]。

禽類呼腸孤病毒基因組由分節(jié)段的10個(gè)基因片段組成。其中，S1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白為σC蛋白。σC蛋白是由326個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)蛋白，分子量大小約為35 kDa，具有高度變異性的特征，因此σC基因序列特征可以為分析不同呼腸孤病毒毒株來(lái)源提供參考依據(jù)[1,8]。

目前，在我國(guó)安徽省某鵝場(chǎng)的鵝出現(xiàn)部分死亡，其臨床表現(xiàn)為發(fā)病鵝排白色稀糞、軟腳，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟出血、呈土黃色、部分發(fā)病鵝肝臟上可見(jiàn)黃白色壞死灶，脾臟腫大、出血、呈暗紅色，腎臟腫大、出血。本研究通過(guò)對(duì)采集的病料進(jìn)行病原分離與鑒定、序列分析及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，證實(shí)病原體為鵝呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采集于安徽省某養(yǎng)鵝場(chǎng)；BHK-21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑 Tissue DNA/RNA Kit 、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion)、DNA Marker DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自GBICO公司。

1.3 病毒分離 將病料剪碎，按1:3體積加含有雙抗的PBS溶液，勻漿器勻漿后反復(fù)凍融3次，4℃、10 000×g離心20 min，吸取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。取上述濾液接種 BHK 細(xì)胞，出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞液。過(guò)濾除菌的濾液同時(shí)經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡雞胚10枚，接種量為0.2 mL/枚。接種后，置生化培養(yǎng)箱37℃恒溫孵化，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚。每間隔12 h觀察1次，收獲死亡的胚體及尿囊液并記錄結(jié)果。

1.4 病毒半數(shù)雞胚致死量（embryo median lethal dose，ELD50）的測(cè)定 將分離株病毒懸液作10倍系列稀釋，取103、104、105、106、107、108稀釋度接種雞胚，0.2 mL/個(gè)，每一稀釋度接種5個(gè)雞胚，觀察記錄雞胚的死亡數(shù)，計(jì)算各稀釋度的百分率。按Reed和Muench法計(jì)算病毒半數(shù)致死量（ELD50）[5]。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 按照Tissue DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)從細(xì)胞裂解液中提取病毒總RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄后做為模板擴(kuò)增全基因。根據(jù)新型鴨呼腸孤病毒TH11株的σC基因的部分序列設(shè)計(jì)特異引物，P1：5'-ATGGATCGCAACGAGGTGATA-3'，P2：5'-CTAGCCCGTGGCGACGGTGAA-3'，其擴(kuò)增長(zhǎng)度為954 bp，引物由上海華津生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系：2×PCR TaqMix 25 μL、上游引物（50 μmol/mL）1μL、下游引物（50 μmol/ mL）1μL、cDNA 模板5μL、無(wú)菌雙蒸水18 μL，總體積為50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用AXYGEN Gel Extreaction Kit回收純化后，將擴(kuò)增的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑菌落PCR 鑒定，得到含目的片段的重組陽(yáng)性菌株，用于測(cè)序分析。

1.6 序列測(cè)定及分析 將陽(yáng)性克隆送上海華津生物科技有限公司測(cè)序，使用DNAStar軟件對(duì)測(cè)定的病毒核苷酸序列與GenBank中收錄的禽源呼腸孤病毒的序列進(jìn)行同源性比對(duì)和分析。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取1日齡健康鵝10只，隨機(jī)分為攻毒組和對(duì)照組兩組，其中攻毒組7只，對(duì)照組3只。攻毒組頸部皮下注射ELD50=10-5.7/0.2 mL的病毒液0.2 mL，對(duì)照組不做處理。觀察14 d，記錄攻毒組發(fā)病情況，剖檢觀察病死鵝的大體病變，分別取攻毒組和對(duì)照組鵝的肺臟、肝臟、脾臟用4%多聚甲醛固定，按常規(guī)方法進(jìn)行病理切片制作，顯微鏡下觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 將病料濾液感染BHK-21細(xì)胞，連續(xù)觀察72 h。結(jié)果顯示，盲傳3代之后BHK-21細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。分離病毒接種BHK-21細(xì)胞24 h后出現(xiàn)細(xì)胞堆聚、細(xì)胞核濃縮、胞間界限模糊；接種36 h后，細(xì)胞堆聚，部分細(xì)胞脫落，有合胞體形成（圖1）；接種72 h后，大部分細(xì)胞脫落。分離得到的毒株命名為GRVLA16株。病料濾液接種9日齡雞胚，雞胚在36 h開(kāi)始死亡，48~60 h死亡數(shù)量最多，表現(xiàn)為雞胚發(fā)育不全，胚體蜷縮，體表充血、出血嚴(yán)重，全身彌漫針尖大小的出血點(diǎn)，并且胚體與正常雞胚相比偏?。▓D2）。

圖1 分離的病毒GRV-LA16株引起 BHK-21細(xì)胞病變Fig.1 Cytopathic effect on BHK-21 induced by GRVLA16 isolateA: 接毒36 h后的BHK-21細(xì)胞; B: 正常對(duì)照細(xì)胞A: BHK-21 cells at 36 h postinfection; B: Normal BHK-21 cells

圖2 GRV-LA16株接種雞胚后產(chǎn)生的病變Fig.2 Lesions of chick embryos experimentally infected with GRV-LA16 strainA: 正常胚; B: 死亡雞胚全身出血, 并且胚體偏小A: Normal chicken embryo; B: Systemic hemorrhage in the dead embryo, which was smaller than normal one

2.2 病毒半數(shù)雞胚致死量（ELD50） 取103、104、105、106、107、108不同稀釋度的病毒懸液接種雞胚，每個(gè)稀釋度雞胚死亡情況見(jiàn)表1。由此，測(cè)定的分離病毒GRV-LA16株ELD50為10-5.7/0.2 mL。

2.3 病毒分離株的RT-PCR 鑒定 利用針對(duì)σC 基因的特異性引物，以及本實(shí)驗(yàn)室保存的鴨病毒性肝炎、禽副粘病毒、對(duì)分離病毒GRV-LA16株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，特異性擴(kuò)增出σC基因，其大小約為1000 bp，與預(yù)期大小相符（圖3）。

表1 GRV-LA16分離株接種雞胚死亡率Table 1 Mortality rate of chick embryo experimentally infected with GRV-LA16 strain

圖3 分離株GRV-LA16的RT-PCR 鑒定Fig.3 Identif cation of GRV-LA16 strain isolated by RTPCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: 鴨呼腸孤病毒; 2: 鴨病毒性肝炎; 3: 禽副粘病毒; 4: 禽流感病毒; 5: 陰性對(duì)照M: DNA Marker; 1: Duck reovirus; 2: Duck viral hepatitis; 3: Avian paramyxovirus; 4: Avian inf uenza; 5: Negative control

2.4 基因同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析 將獲得的目的片段克隆至pMD-19T載體后進(jìn)行測(cè)序，獲得的核苷酸序列經(jīng)BLAST發(fā)現(xiàn)，GRV-LA16株與其他呼腸孤病毒σC序列同源性很低，最高值僅為87%，選取NCBI中收錄的參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GRV-LA16株與鴨呼腸孤病毒處于同一拓?fù)淙?，而與雞源呼腸孤病毒、番鴨源呼腸孤病毒以及鵝源呼腸孤病毒處于不同拓?fù)淙海▓D4）。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 攻毒組的鵝在接毒后d 3發(fā)病，接毒后6 d內(nèi)死亡，其發(fā)病率和死亡率均為100%。發(fā)病鵝精神萎靡，軟腳，排白色稀糞，對(duì)照組鵝無(wú)臨床癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫大，有小的壞死灶；脾臟腫大，呈暗紅色；腎臟表面出血。病理切片結(jié)果顯示攻毒組鵝部分肝小葉固有結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞壞死或崩解消失，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大部分肝細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一的空泡；肺泡壁脹破融合，毛細(xì)血管擴(kuò)張出血，不可見(jiàn)壁，且肺泡腔有紅色絲網(wǎng)狀纖維素滲出物（圖5）。

圖4 GRV-LA16株與其他參考毒株σC 核酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree based on σC gene sequences of GRV-LA16 strain and other strains

3 討論

禽呼腸孤病毒感染水禽的報(bào)道最初僅見(jiàn)于番鴨，稱為番鴨呼腸孤病毒病，其致病因子稱為番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）[5,9]，研究表明 MDRV對(duì)我國(guó)的北京鴨以及其他地方品種鴨不具有感染性[10]。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，呼腸孤病毒病感染多品種鴨也見(jiàn)報(bào)道，但是由于流行區(qū)域、發(fā)病種群和發(fā)病時(shí)間的不同，呼腸孤病毒感染鴨表現(xiàn)出不同程度的差異。程安春等[9]報(bào)道了1998年四川省、云南省等地的“鴨病毒性腫頭出血癥”疫情，是由鴨呼腸孤病毒所致。2009年，陳少鶯等[10]報(bào)道了福建省爆發(fā)的呼腸孤病毒為新型鴨呼腸孤病毒，與以往報(bào)道的呼腸孤病毒有較大差異。隨后，陳宗艷等[4,11]于2011年分離得到的TH11株也證實(shí)為新型鴨呼腸孤病毒，其發(fā)病率逐年升高、病毒致病性更強(qiáng)、宿主范圍更廣、流行的區(qū)域逐年擴(kuò)大。Yun等[12]發(fā)現(xiàn)浙江省某地區(qū)出現(xiàn)的番鴨呼腸孤病毒致病性已經(jīng)發(fā)生一定程度變異。2004年，王永坤[13]報(bào)道雛鵝出現(xiàn)一種以出血性壞死性肝炎為主要特征的疫情，后證實(shí)為雛鵝呼腸孤病毒引起。2011年，高巍等[14]報(bào)道分離的GRV-JS10株與以往出血性壞死性肝炎不同，并未造成嚴(yán)重的大片肝細(xì)胞壞死崩解，雛鵝以腱鞘炎和腸道后段黏膜腫塊狀炎癥為病理特征。2013年，陳紅梅等[15]也分離鑒定了11株雛鵝呼腸孤病毒FJ-06株。禽呼腸孤病毒現(xiàn)已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病原之一，這應(yīng)該引起我們的高度關(guān)注。

圖5 感染GRV-LA16株鵝的肺臟、肝臟病理變化Fig.5 Pathological changes of lung, liver infected with GRV-LA16A1, B1: 正常鵝的肺臟和肝臟; A2, B2: 感染GRV-LA16株鵝的肺臟和肝臟A1, B1: Control groups; A2, B2: The lung, liver of geese infected with GRV-LA16

呼腸孤病毒為雙鏈RNA病毒，其致病性差異主要由S1基因節(jié)段變異引起[8,14]。S1基因節(jié)段編碼的σC蛋白位于病毒衣殼表面，屬于黏附蛋白，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且此蛋白具有高度變異特性，能夠增強(qiáng)病毒感染細(xì)胞能力，是引起病毒抗原發(fā)生變異的主要原因[16,17]。σC蛋白可以特異性結(jié)合到細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生具有高度特異性中和抗體，激發(fā)機(jī)體粘膜和全身性免疫反應(yīng)發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生合胞體，而σC特異性缺失18個(gè)氨基酸即可導(dǎo)致病毒致病性發(fā)生變化[8]。由于σC蛋白擁有高度變異特性[8,18]，因此可以用σC蛋白來(lái)分離鑒定不同的呼腸孤病毒毒株，比較不同毒株之間的序列差異，分析其序列差異與毒株致病力、免疫原性的關(guān)系，研究不同毒株之間的交叉保護(hù)性。

本研究病料來(lái)自安徽省某養(yǎng)殖場(chǎng)，與之前報(bào)道引起雛鵝發(fā)病不同，此株病毒能引起成年鵝軟腳，導(dǎo)致成年鵝的死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)其引起鵝肝臟、脾臟部分壞死，腎臟腫大、出血。GRV-LA16株除具有DRV引起肝脾腫大、壞死的病變特征外，出現(xiàn)肺臟也充血、出血的特征性病變。σC基因序列的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，GRV-LA16與DRV親緣關(guān)系較近，位于同一拓?fù)淙?；而與經(jīng)典的ARV及MDRV、GRV處于不同分支。BLAST結(jié)果也表明，此株病毒的σC基因與DRVσC基因同源性相對(duì)較高，最高值為87%。郭東春等[19]報(bào)道的GRV1毒株基于σC基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其與MDRV同屬于一個(gè)亞群，核苷酸同源率93%，而與ARV S1133株同源率僅為21%；GRV-JS10株與ARV經(jīng)典株S1133同源性為99.6%[14]；而FJ-06株部分σC基因分析表明，其與ARV同源性低，與DRV處于同一拓?fù)鋪喨篬15]。本分離毒株的流行來(lái)源、流行病學(xué)意義、病毒變異與易感宿主范圍擴(kuò)展之間的關(guān)系以及本分離株與ARV、DRV、MDRV及GRV之間的進(jìn)化關(guān)系需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

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ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A NEW GOOSE REOVIRUS

WU Qiao-mei, LI Chuan-feng, DING Ming-yang, ZHU Jie, TAN Yong-gui, LI Qi, LIU Guang-qing, CHEN Zong-yan

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The aim of this study was to isolate and characterize a new Goose reovirus in Anhui province. The diseased geese were weak in legs and diarrhea. Postmortem f ndings included swollen livers and gray necrotic spots in spleens, hyperaemia and hemorrhage in lungs. By sequencing the specif c PCR product of the virus was characterized as a goose reovirus designated as GRV-LA16 strain. ELD50was titrated to be 10-5.7/0.2 mL. Histopathological examination also found that alveolar walls showed burst fusion. Moreover, the capillaries were dilated and congested, and red f brinous exudate was in the alveolar spaces. Sequencing of σC gene showed that the GRV-LA16 and novel duck reovirus had a close genetic relationship with 87% homology. Phylogenetic analysis of σC gene revealed that GRV-LA16 was not close to Avian orthoreoviruses, GRV and Muscovy duck reovirus.

Goose reovirus; isolation and identif cation; σC gene

S852.659.4

A

1674-6422（2017）03-0001-06

2017-02-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502068）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500800）；上海市科委科技創(chuàng)新（13391901602）

吳巧梅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

陳宗艷，E-mail: zychen@shvri.ac.cn