補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞模型大鼠海馬組織Cdk5的調(diào)控

劉 芳，王宇紅，邵 樂，夏相宜，佘 顏，蔡光先

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地、中藥粉體關(guān)鍵技術(shù)及裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、3.醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞模型大鼠海馬組織Cdk5的調(diào)控

劉 芳1，王宇紅2，邵 樂2，夏相宜2，佘 顏3，蔡光先2

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院、2. 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地、中藥粉體關(guān)鍵技術(shù)及裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、3.醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯；補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方；大腦中動(dòng)脈阻塞模型；細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5；腦缺血；海馬組織

補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義[1]，基于益氣祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的觀念，以黃芪30 g、川芎9 g、地龍3 g的比例入藥，并采用現(xiàn)代中藥制備工藝提取。課題組前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確立了補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方發(fā)揮抗腦缺血功效的有效劑量[2]，并闡明了其抗腦缺血損傷的部分分子機(jī)制[3-4]。然而，腦缺血對(duì)海馬組織神經(jīng)元損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，僅通過對(duì)幾個(gè)蛋白的研究不足以體現(xiàn)中藥多靶點(diǎn)的協(xié)同作用。周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)作為一種主要在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)的脯氨酸限定的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控神經(jīng)元分化、皮質(zhì)的形成、神經(jīng)元的遷移和神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用，具有潛在的調(diào)控神經(jīng)元功能[5]。早在1999年，Patrick等[6]研究報(bào)道了Cdk5的調(diào)節(jié)亞基p35在鈣激活性蛋白酶水解作用下裂解成p25，繼而導(dǎo)致Cdk5長(zhǎng)期連續(xù)不可調(diào)控性激活，從而加速神經(jīng)元損傷。鑒于Cdk5的異?；罨瘜?duì)神經(jīng)元的損傷性，本研究動(dòng)態(tài)研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠海馬組織Cdk5表達(dá)的影響，并比較原方及精簡(jiǎn)方對(duì)Cdk5的調(diào)控程度，旨在從分子層面為補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方的有效性和合理性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 補(bǔ)陽(yáng)還五湯干浸膏(黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍4.5 g、川芎93 g、紅花3 g、桃仁3 g、地龍3 g)和補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干浸膏(黃芪30 g、川芎9 g、地龍6 g)均由湖南中醫(yī)研究院中藥所張水寒教授提供，干浸膏的制備程序參照前期研究[3]。兔抗大鼠Cdk5多克隆抗體(批號(hào)：Ab28441)購(gòu)自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號(hào)：20121011)購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；超純RNA提取試劑盒(批號(hào)：CW0597)、UltraSYBR Mixture(With high ROX)(批號(hào)：CW2329A)、RNaseⅠ(批號(hào)：CW2090A)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào)：K1622)、蛋白預(yù)染Marker(批號(hào)：SM1811)購(gòu)自Fermentas公司；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(批號(hào)：BYL4082)購(gòu)自上?；鶢栴D生物；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(批號(hào)：5174)購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量250～280 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.3 儀器 BX51光學(xué)顯微鏡、IPP6.0圖像分析系統(tǒng)由日本Olympus公司提供；Finesse 325石蠟切片機(jī)由英國(guó)Shando公司提供；手握式電動(dòng)勻漿機(jī)由德國(guó)FLUKO公司提供；7300 Real-time PCR檢測(cè)儀由美國(guó)ABI公司提供；電泳儀(mini protean 3 cell)由美國(guó)BIO-RAD公司提供。

2 方法

2.1 MCAO動(dòng)物模型的制備及評(píng)價(jià) 依據(jù)文獻(xiàn)[7]，采用大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型。SD大鼠麻醉后，通過手術(shù)將魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度由分叉部計(jì)為(17.5±0.5) mm。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后即縫合。術(shù)后SPF級(jí)飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物于清醒后2 h參照Longa等[8]的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值在1～3分者納入實(shí)驗(yàn)范圍。

2.2 分組及給藥 將SD大鼠分成假手術(shù)組和MCAO手術(shù)組，再將造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干預(yù)組，每組50只，按5個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別于給藥后1、3、7、14、28 d處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。藥物干預(yù)組于術(shù)后2 h給藥，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組按成人等效劑量3.15 g·kg-1·d-1、補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組按前期實(shí)驗(yàn)[2]以2.41 g·kg-1·d-1藥液灌胃，給藥體積均為4.0 mL·kg-1。模型組和假手術(shù)組均給予等體積生理鹽水。

2.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬組織CA1、CA2、CA3及齒狀回區(qū)Cdk5的陽(yáng)性表達(dá) 各組大鼠分別于給藥后各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)挑出5只，心臟灌注法固定大腦后，取海馬石蠟包埋切片于防脫玻片上。將烘干后的切片逐步脫蠟和水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，并用羊血清于37℃溫箱中封閉30 min。取出切片加一抗，空白對(duì)照組加PBS，置于濕盒內(nèi)，于4℃冰箱中孵育過夜，再加入二抗37 ℃溫箱孵育30 min。顯色復(fù)染后脫水，封片，晾干，于顯微鏡下觀察。分別拍攝各組大鼠海馬組織CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回區(qū)，×400倍視野下觀察Cdk5表達(dá)情況，并采用Image pro-plus 6.0軟件對(duì)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(棕色)進(jìn)行平均光密度統(tǒng)計(jì)。

2.4 Western blot檢測(cè)海馬組織中Cdk5蛋白的表達(dá) 將各組大鼠海馬組織裂解后，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取蛋白樣品25 μg變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后與兔抗大鼠Cdk5多克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗大鼠GAPDH抗體(1 ∶1 500)4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，隨后根據(jù)用量，與HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)37℃孵育1 h。將膜進(jìn)行掃描，圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的積分光密度值(IOD)，以GAPDH為內(nèi)參照，以目的條帶IOD值與GAPDH條帶IOD值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 RT-PCR法檢測(cè)海馬組織中Cdk5 mRNA的表達(dá) 各組大鼠麻醉后斷頭取腦，迅速分離出海馬，勻漿后采用RNA提取試劑盒提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后按反應(yīng)程序37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min用特定Cdk5引物(236 bp，GC 59%，F(xiàn)：5′-ATCCCAGTCCGCTGCTACTC-3′；R：5′-GTCATGGCAGGCCACTGTTC-3′)和GAPDH引物(181 bp，GC 51%，F(xiàn)：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；R：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′)進(jìn)行各目的基因的反轉(zhuǎn)錄；將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，10 min(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃, 15 s；60℃,1 min；95℃,15 s；60℃, 15 s。RT-PCR數(shù)據(jù)采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，結(jié)果采用2-ΔΔCt[9]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)MCAO模型大鼠海馬組織不同分區(qū)Cdk5表達(dá)的影響 給藥7 d后，各組大鼠海馬組織中Cdk5的表達(dá)情況見Fig 1。假手術(shù)組中Cdk5的表達(dá)較少，其中CA3區(qū)較其他海馬亞區(qū)稍多，圖中可見少量棕色顆粒；模型組大鼠腦缺血后海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，Cdk5蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞增加，在海馬組織的4個(gè)區(qū)域均有較多表達(dá)(Fig 2結(jié)果表明與假手術(shù)組比較P<0.01)，密集分布，主要集中在胞質(zhì)表達(dá)，胞核僅少量表達(dá)，呈棕紅色染，提示腦缺血能激活Cdk5，上調(diào)其表達(dá)水平；補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方干預(yù)組中，Cdk5 在CA1和CA3區(qū)胞質(zhì)的表達(dá)雖較假手術(shù)組增多，但較模型組卻明顯減少。從腦缺血的時(shí)間進(jìn)程上來看(Fig 2)，Cdk5在MCAO模型大鼠海馬組織中CA1、CA2、CA3和齒狀回4個(gè)區(qū)的表達(dá)在局灶性缺血后3～7 d達(dá)到高峰，隨后則出現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)；采用補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方干預(yù)3 d后，Cdk5的表達(dá)較同時(shí)間模型組比明顯下調(diào)(P<0.05)，且隨著給藥天數(shù)的增多，與假手術(shù)組的差異逐漸縮小，其中，Cdk5在CA2區(qū)和齒狀回區(qū)的表達(dá)在給藥28 d后與假手術(shù)組持平；而CA3區(qū)在給藥14 d后，Cdk5即降至假手術(shù)組水平，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方能有效調(diào)控局灶性腦缺血模型大鼠海馬組織中Cdk5的表達(dá)，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其調(diào)控效果越明顯。

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)MCAO模型大鼠海馬組織Cdk5 mRNA表達(dá)的影響 將Cdk5 mRNA在大鼠海馬組織中的表達(dá)半定量后分析作圖，結(jié)果見Fig 3。Cdk5 mRNA在MCAO模型組大鼠海馬組織中的表達(dá)較假手術(shù)組比明顯增加，隨后則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，在造模7 d后達(dá)到最高水平，兩組mRNA表達(dá)量比較差異具有顯著性(P<0.01)；同時(shí)間點(diǎn)藥物干預(yù)組與模型組比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且藥物干預(yù)至28 d后，Cdk5 mRNA的表達(dá)量基本降至假手術(shù)組水平。結(jié)果提示大腦局灶腦缺血損傷將導(dǎo)致Cdk5的異常表達(dá)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方能一定程度降低Cdk5 mRNA在MCAO模型組大鼠海馬組織中的表達(dá)水平。

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)MCAO模型大鼠海馬組織Cdk5蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果見Fig 4、5。Cdk5蛋白在模型組中的所有時(shí)間點(diǎn)均呈大量表達(dá)，電泳條帶寬且色深，與同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組比差異具有顯著性(P<0.01)，其中7～14 d，Cdk5的表達(dá)量達(dá)到最大值，到28 d，則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方干預(yù)后，Cdk5的表達(dá)量較模型組明顯下降(P<0.05)，在給藥28 d后，Cdk5的表達(dá)水平與假手術(shù)組持平，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方能一定程度降低MCAO模型大鼠海馬組織中Cdk5蛋白的表達(dá)，防止其異?；罨M(jìn)一步驗(yàn)證了補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方可能通過Cdk5信號(hào)通路對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮功效。

Fig 1 Expression Cdk5 in various areas of rat hippocampus after intragastrical administration 7 days(×400)

A～D: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA1; E～H: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA2; I～L: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA3; M～P: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in dentate gyrus area

Fig 2 Expression of Cdk5 in various areas of rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

A: CA1 area; B: CA2 area; C: CA3 area; D: Dentate gyrus area.##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

Fig 3 Expression of Cdk5 mRNA in rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

Fig 4 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points

1～4：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 1)；5～8：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 3)；9～12：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 7)；13～16：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 14)；17～20：Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 28)

4 討論

腦缺血后，谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性使鈣離子流過度積累，從而激活與Cdk5過表達(dá)密切相關(guān)的鈣蛋白酶，并最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元死亡和認(rèn)知障礙，提示Cdk5可能是腦缺血后海馬神經(jīng)細(xì)胞功能性的修復(fù)的關(guān)鍵作用位點(diǎn)。最新研究表明[10-11]，采用Cdk5抑制劑能降低局灶性缺血新生大鼠中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表達(dá)、成年缺血性中風(fēng)大鼠模型中的細(xì)胞凋亡率，證實(shí)了Cdk5可以在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游進(jìn)行調(diào)控。此外，研究[12-13]還表明，隨著腦缺血的加劇，神經(jīng)元死亡的延后導(dǎo)致內(nèi)源性Cdk抑制劑的逐漸缺失，隨之周期素依賴性激酶D1(cyclin D1)上調(diào)，Cdk家族蛋白被激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架分解，進(jìn)一步證實(shí)了Cdk5功能性缺陷是中風(fēng)后神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵因素。本研究從腦缺血時(shí)間進(jìn)程上動(dòng)態(tài)研究大鼠海馬組織Cdk5的表達(dá)情況，結(jié)果表明：隨著腦缺血的進(jìn)程，Cdk5蛋白及mRNA在MCAO模型大鼠海馬組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出先增加再緩慢降低的趨勢(shì)，其表達(dá)量大概在缺血后7～14 d達(dá)到高峰，提示神經(jīng)元可能存在一定的自我修復(fù)能力，但還不足以逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷；模型組Cdk5的表達(dá)量與同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組比差異具有顯著性(P<0.01)，且Cdk5在海馬組織表達(dá)的定位主要集中在齒狀回，CA1、CA2及CA3區(qū)亦有高表達(dá)，提示腦缺血可能激活Cdk5信號(hào)通路，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。結(jié)合前期對(duì)周期蛋白Cdk4/cyclin D1的研究，提示腦缺后細(xì)胞周期蛋白的紊亂可能與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的上游調(diào)控蛋白Cdk5具有一定的相關(guān)性，這將是我們后續(xù)深入研究的方向。 秉承對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥的繼承和創(chuàng)新精神，結(jié)合方劑學(xué)“整體取性原理”和“君藥不可缺少”的理論，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方選取原方中的黃芪入藥，不僅大補(bǔ)元?dú)猓夷苄袣?，利營(yíng)衛(wèi)之氣，通營(yíng)衛(wèi)之阻滯以活血；輔以川芎行氣活血，氣行則血行，血行則瘀去脈通也，使氣血和順；地龍長(zhǎng)于行散走竄，通經(jīng)活絡(luò)，為佐藥。三藥合用即為補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方，意即通過“祛瘀”、“化舊”或“去腐”等方法來祛除體內(nèi)沉積的痰血及其他陳舊性的病理產(chǎn)物。此外，為更好發(fā)揮中藥復(fù)方的整體功效，減少傳統(tǒng)湯劑在煎煮過程中一些有效成分的丟失，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方采用現(xiàn)代中藥制備工藝，將超臨界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工藝相結(jié)合，保證中藥有效成分最大限度的溶出，且課題組前期通過拆方實(shí)驗(yàn)對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方的配伍和劑量進(jìn)行了優(yōu)選[15]，最終確定以黃芪、川芎和地龍按10 ∶3 ∶1的比例組方，一定程度驗(yàn)證補(bǔ)陽(yáng)還五湯類方的科學(xué)合理性。本研究結(jié)果表明，腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方均能一定程度降低Cdk5的異常表達(dá)，采用補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其精簡(jiǎn)方干預(yù)3 d后，Cdk5的表達(dá)較同時(shí)間模型組比明顯下調(diào)(P<0.05)，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，Cdk5的表達(dá)逐漸接近假手術(shù)組，干預(yù)28 d時(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干預(yù)組與假手術(shù)組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其效果與補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方組相當(dāng)，從分子層面進(jìn)一步驗(yàn)證了補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方科學(xué)配伍的合理性和有效性。鑒于補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)調(diào)控Cdk5蛋白表達(dá)水平的有效性，有必要對(duì)其作用機(jī)制和活性成分進(jìn)行更深層次研究，以期在此基礎(chǔ)上將其開發(fā)成Cdk抑制劑。

Fig 5 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points(±s，n=5)

##P<0.01vssham at same time;*P<0.05vsmodel at same time

(致謝：本文所有實(shí)驗(yàn)均完成于湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，實(shí)驗(yàn)過程中得到該實(shí)驗(yàn)室全體老師的指導(dǎo)及同學(xué)的協(xié)助，在此表示感謝！)

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Regulation of thin recipe of Buyang Huanwu decoction on Cdk5 expression of rats after cerebral ischemia

LIU Fang1, WANG Yu-hong2, SHAO Le2, XIA Xiang-yi2, SHE Yan3, CAI Guang-xian2
(1.PharmacySchool, 2.NationalKeyLabCo-builtbyDeptsofHerbalPowderandNewDrugsofHunanProvince,TraditionalChineseMedicinePowderTechnologyandEquipmentofNationalandLocalJointEngineeringLab, 3.MedicalSchool,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Aim To evaluate the regulation of thin recipe of Buyang Huanwu decoction on cyclin-dependent kinase 5(Cdk5) expressions in hippocampus tissue of rats after cerebral ischemia.Methods Male SD rats were divided into sham-operation group, MCAO group, Buyang Huanwu decoction group(ig. 3.15 g·kg-1) and its thin recipe composition group(ig. 2.41 g·kg-1). Each group was then divided into five subgroups based on the time after administration for 1, 3, 7, 14, 28 d respectively. Cdk5 protein and mRNA levels in each group were examined by using immunohistochemistry, Western blot and real-time PCR respectively.Results The up-regulation of Cdk5 was observed in model rat hippocampus after cerebral ischemia 1 day, and kept increasing with the aggravation of ischemia injury, the peaked expression was observed after 7～14 d, while the downtrend was observed after 28 days compared with the corresponding sham-operation groups(P<0.01), suggesting that the Cdk5 signal pathway would be activated by cerebral ischemic injury. The expression of Cdk5 in thin recipe of Buyang Huanwu decoction group was significantly lower than that in model group at each time point(P<0.05)，and there was also more obvious down-regulation with the extend of intervene time. The regulation effects of thin recipe of Buyang Huanwu decoction was up to the best after 28 days of administration, which indicated the thin recipe was positive to the abnormal expression of Cdk5, and there was no difference between Buyang Huanwu decoction and its thin recipe treated groups(P>0.05).Conclusion The thin recipe of Buyang Huanwu decoction could exert the protective effect by regulating Cdk5 after cerebral ischemia.

Buyang Huanwu decoction; thin recipe of Buyang Huanwu decoction; middle cerebral artery occlusion(MCAO); cyclin-dependent kinase 5(Cdk5); cerebral ischemia; hippocampus

2017-04-16,

2017-05-15

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(No 2012CB723503)；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(No 2014135); 湖南省十二五中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助

劉 芳(1980-)，女，博士，講師，研究方向：中醫(yī)藥防治腦缺血，E-mail：fliu0825@126.com； 蔡光先(1951-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥防治消化、心腦疾病，通訊作者，E-mail：366620183@qq.com

時(shí)間：2017-7-7 11:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.026

A

1001-1978(2017)08-1176-06

R-332；R289.5；R322.81；R345.57；R743.310.22；R977.3摘要：目的 評(píng)價(jià)補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型大鼠海馬組織周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)的調(diào)控。方法 將♂ SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)組(灌胃3.15 g·kg-1)及補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干預(yù)組(灌胃2.41 g·kg-1)，每組按給藥后1、3、7、14、28 d再各分5小組。采用免疫組化法、Western blot法和RT-PCR法考察不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬組織中Cdk5的表達(dá)。結(jié)果 MCAO模型大鼠海馬組織中，腦缺血后1 d即出現(xiàn)Cdk5上調(diào)趨勢(shì)，并隨著腦缺血的加劇，Cdk5的表達(dá)繼續(xù)上調(diào)，其中mRNA及蛋白水平在7～14 d達(dá)最大，28 d則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較P<0.01，提示腦缺血損傷將激活Cdk5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干預(yù)后的3、7、14、28 d均能明顯降低Cdk5的表達(dá)，與各時(shí)間點(diǎn)模型組比較P<0.05，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，下調(diào)趨勢(shì)越明顯，干預(yù)28 d后，Cdk5的表達(dá)接近假手術(shù)組，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方可下調(diào)Cdk5的異常表達(dá)，與補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方比，兩方對(duì)Cdk5的調(diào)控差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方可能通過調(diào)控Cdk5的表達(dá)水平對(duì)腦缺血海馬組織發(fā)揮保護(hù)作用。