人脫落乳牙牙髓干細胞與牙髓干細胞生物學功能差異研究

龐真貞 王 良 高 磊 劉欽贊 李 曄

人脫落乳牙牙髓干細胞與牙髓干細胞生物學功能差異研究

龐真貞 王 良 高 磊 劉欽贊 李 曄

目的：從不同角度對人乳牙牙髓干細胞(SHED)與恒牙牙髓干細胞(DPSCs)的生物學功能進行對比研究，探討對骨改建的影響。方法：有限稀釋法分離培養(yǎng)SHED和DPSCs，成脂誘導14d進行油紅O染色、成骨誘導21d進行茜素紅染色；ELISA法檢測IL-6、TNF-α分泌水平；兩種干細胞常規(guī)培養(yǎng)及成骨誘導7d后進行ALP染色、實時定量PCR檢測Runx2、RANKL、OPG基因表達。結(jié)果：分離獲得的SHED和DPSCs具有成骨、成脂分化能力，符合干細胞特點。SHED的炎性細胞因子IL-6、TNF-α的表達均高于DPSCs(P<0.01)；成骨誘導7d后SHED的ALP活性強于DPSCs(P<0.05)；且經(jīng)成骨誘導后兩種干細胞均表達Runx2、OPG和RANKL，但SHED的表達水平明顯高于DPSCs(P<0.05)。結(jié)論：SHED與DPSCs相比不僅具有較強的成骨分化能力，而且還兼具較強的破骨能力，提示SHED可能參與骨改建調(diào)控機制。

人脫落乳牙牙髓干細胞；牙髓干細胞；TL-6；Runx2

干細胞是指有克隆形成能力的未分化細胞，具有自我更新和多向分化的特點。目前，用于組織修復和再生的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells， MSC)多采用成體多能干細胞[1]。近年來，牙源性干細胞逐漸成為學者關(guān)注的熱點，Gronthos[2]等于2000年成功分離了人恒牙牙髓干細胞(Dental Pulp Stem Cells，DPSCs)，隨后，M iura[3]等從正常脫落的兒童乳牙中分離得到一種間充質(zhì)干細胞[4]，并命名為人脫落乳牙牙髓干細胞(stem cells from human ex foliated deciduous teeth，SHED)。二者皆具有成體干細胞的特性，細胞表面表達多種間充質(zhì)干細胞特異性標記物且具有較強的增殖能力和多向分化潛能[5]。乳牙與恒牙在來源和成牙特性上相近，然而，在結(jié)構(gòu)和組織學上有一定差異，近期有研究證實與DPSCs相比SHED增殖能力強，倍增時間短，且具有較高克隆形成能力及成骨分化能力[6]，但具體作用機制不清。本研究通過對比SHED和DPSCs的功能差異關(guān)鍵因子的分泌表達，為探討SHED可能參與骨改建調(diào)控機制提供實驗依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素、鏈霉素(Gibco，美國)、0.25%胰蛋白酶；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；TRIzol Reagent(Life Technologies，NY)；超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)；實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司)；IL-6、TNF-αElisa試劑盒(上海通蔚生)；ALP試劑盒(上海碧云天)。

1.2 樣本收集 收集2014年12月至2015年2月保定市第一中心醫(yī)院口腔科5-7歲兒童正常乳恒牙替換期自然脫落乳牙樣本。脫落乳牙無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周炎，牙根吸收達牙根1/2-2/3，且所有納入個體無系統(tǒng)疾病。同期于口腔外科收集18-25歲青年因正畸治療拔除的前磨牙或因埋伏阻生而拔除的第三磨牙樣本。所取得恒牙均無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周病變，且所有納入個體無系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準，取得患者知情同意。

1.3 SHED和DPSCs的分離、培養(yǎng) 充分消毒乳、恒牙牙體周圍組織后拔牙，立即放入預冷含高倍雙抗α-MEM培養(yǎng)基中，2小時內(nèi)原代取材。參照Gronthos[2]等的方法，在超凈臺中，PBS液反復沖洗，乳牙直接用拔髓針拔取牙髓組織；而恒牙則通過牙鉆從牙冠打開牙髓腔，再用拔髓針拔取牙髓，用含有青、鏈霉素雙抗的0.1m L/L PBS反復沖洗，剪碎，約1mm×1mm×1mm的組織塊。4%Ⅰ型膠原酶消化45m in，加入含150m L/L胎牛血清和青、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1000r/m in離心5m in，棄上清，加入含20% FBS的α-MEM培養(yǎng)液接種于35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2d半量換液，之后每2-3d半量換液，細胞達到80%-90%匯合時，用胰酶消化傳代，按1∶3比例傳代。采用有限稀釋法對SHED進行克隆分離：將第一代處于對數(shù)期的SHED計數(shù)，有限稀釋至密度為約10個/m L，以100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，挑出單個細胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3d半量換液(α-MEM，15%FBS)；待單克隆面積至孔底60%以上時，消化法移至24孔板、6孔板中擴大培養(yǎng)，逐步擴增至107數(shù)量級，以P3代用于細胞實驗。

1.4 成脂成骨分化 取第3代的SHED和DPSCs，細胞計數(shù)后，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，隨機分為實驗組和對照組，每組3孔。待細胞密度生長至60%-70%將細胞進行成脂、成骨誘導。成脂誘導：用含有地塞米松1μmol/L，吲哚美辛200μmol/L、IBMX 0.5μmol/L，胰島素10mg/L、胎牛血清100mg/L的DMEM誘導液誘導培養(yǎng)14d后，鏡下觀察胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形空泡后，棄成脂誘導液，PBS漂洗3遍后將細胞用40g/L的多聚甲醛室溫固定30 m in。PBS漂洗3遍，置油紅O工作液中浸15-20 m in，蒸餾水沖洗5遍，顯微鏡下觀察。成骨分化：用含有地塞米松10μmol/L，vitC 50μmol/L，β磷酸甘油鈉10mmol/L、胎牛血清100 m L/L的DMEM誘導液誘導培養(yǎng)，每周換液3次，21d后，40g/L的多聚甲醛固定1.5h，PBS漂洗3遍，加入茜素紅37℃染色30-45m in，PBS沖洗后鏡下觀察。

1.5 細胞因子檢測 將P3代SHED及DPSCs按1×105個/m l的密度接種到24孔板中，設置4個副孔。待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，將SHED及DPSCs加入常規(guī)培養(yǎng)液(含15% FBS、100μmol/L抗壞血酸、0.292m g/m l谷氨酰胺、100U/m l青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)，24h后收集各個培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)。 按 照 IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明建立標準曲線后每孔加入待測樣品100μl，洗板，每孔加入一抗工作液50μl，反應板充分混勻后置于37℃60m in，洗板后加入底物液100μl，置于37℃，避光保存10m in，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。本實驗進行3次重復。

1.6 堿性磷酸酶染色 第3代SHED和DPSCs以1×104個/孔的密度接種于12孔板中并隨機分為實驗組和對照組，每組3孔。正常及成骨誘導，每3d換液培養(yǎng)至7d，棄原培養(yǎng)液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書配制染液，將細胞用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，固定30m in。PBS洗3次，加ALP染液37℃孵育45m in。蒸餾水輕輕沖洗，洗去染液，照相。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，藍色為陽性。

1.7 實時定量PCR 將P3代SHED和DPSCs低密度接種T25培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)條件及成骨誘導條件下培養(yǎng)7d，后用Trizol裂解并提取成骨總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green試劑盒進行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應管中進行擴增，反應體系20μl。反應條件：95℃變性 20m in，95℃ 30s，60℃1m in，40個循環(huán)。采用實時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標準曲線，軟件自動計算后得出。試驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)處理，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨立樣本t檢驗。設P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1 SHED和DPSCs均具有成脂、成骨分化能力 經(jīng)過低密度接種培養(yǎng)獲取的SHED和DPSCs具有干細胞的基本形態(tài)，細胞均成長梭形、胞漿均勻、核圓、核仁清晰，呈旋渦狀生長。SHED及DPSCs向成骨方向誘導過程中，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，突觸消失，胞體增大，形態(tài)近方形或多邊形，成骨誘導培養(yǎng)21d后茜素紅染色陽性，可見礦化結(jié)節(jié)。SHED及DPSCs成脂誘導14d后，胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形空泡，并逐漸融合，油紅O染色可見呈紅色的脂滴顆粒(圖1)。這說明我們所分離培養(yǎng)的細胞符合SHED及DPSCs特性，為下步實驗打下了基礎。

圖1 SHED和DPSCs成脂、成骨誘導分化(200倍)

2.2 SHED和DPSCs TNF-α、IL-6分泌量及基因表達水平檢測 TNF-α、IL-6在干細胞參與的骨改建過程中發(fā)揮一定作用，本研究首先采用Elisa方法檢測SHED及DPSCs TNF-α、IL-6分泌量，結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)條件下SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs(P<0.01，圖2A)。實時定量PCR對TNF-α、IL-6在兩組細胞中表達的檢測結(jié)果與Elisa結(jié)果一致，SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs，其中SHED TNFα的表達水平是DPSCs的3.11倍(P<0.01，圖2B)。

圖2 A：ELISA檢測細胞因子分泌水平；B：SHED和DPSCs常規(guī)培養(yǎng)3天后提取RNA檢測炎癥相關(guān)基因表達

2.3 SHED和DPSCs成骨誘導7天后ALP染色 將SHED和DPSCs成骨誘導7天后進行ALP染色，大體觀察見SHED和DPSCs成骨誘導后ALP染色較常規(guī)對照組增強。倒置顯微鏡下觀察，多數(shù)細胞質(zhì)有藍紫色顆粒沉淀，且SHED染色較DPSCs深，可見SHED比DPSCs ALP陽性表達率高(圖3)。

圖3 SHED和DPSCs成骨誘導7d后ALP染色(100倍)

2.4 SHED和DPSCs成骨誘導7d后關(guān)鍵基因表達檢測 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，SHED和DPSCs均表達成骨早期關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子基因Runx2。常規(guī)培養(yǎng)條件下SHED Runx2表達水平顯著高于DPSCs，成骨誘導7d后兩組細胞Runx2表達水平均顯著升高(P＜0.05)，SHED成骨誘導組表達值最高(圖4A)。常規(guī)條件下SHED和DPSCs OPG表達無顯著差異，成骨誘導后均顯著上調(diào)，成骨誘導后SHED OPG表達水平顯著高于DPSCs成骨誘導組(P＜0.05，圖4B)。在RANKL表達上，成骨誘導7d后DPSCs較對SHED組降低，SHED增高4.37倍(P<0.05，圖4C)。

圖4 SHED和DPSCs成骨、破骨相關(guān)基因表達

3.討論

乳牙生理性根吸收是兒童乳恒牙替換期的一種自然生理現(xiàn)象，關(guān)于機制乳牙生理性根吸收，有學者指出可能與炎癥環(huán)境、繼承恒牙萌出時的壓力或咬合創(chuàng)傷有關(guān)，但都尚處于探索階段。目前對根吸收的研究多傾向于乳牙自身相關(guān)組織，因此乳牙牙髓干細胞是當前的研究熱點。

有研究表明乳牙生理性根吸收的過程與骨重塑的過程相似。本實驗選用Runx2和OPG兩種成骨向分化相關(guān)特異性基因視作向成骨細胞分化的檢測指標[7]，結(jié)果顯示，成骨誘導后，SHED和DPSCs的成骨相關(guān)基因Runx2和OPG表達量均較正常培養(yǎng)組有所提高，且SHED的Runx2和OPG表達增加水平均明顯高于DPSCs，該結(jié)果也再次驗證SHED較DPSCs具有更強成骨分化能力[8-9]。

TNF-α為TNF家族重要成員之一，是目前公認的最重要的一個內(nèi)源性誘生型促炎細胞因子，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示炎性因子能夠影響成骨細胞特異性基因的表達、細胞外基質(zhì)的分泌以及成骨細胞的凋亡，且對破骨細胞的形成和活性具有重要的調(diào)節(jié)作用[10、11]。有實驗表明，TNF也可以刺激基質(zhì)成骨樣細胞合成IL-6、PTH rp以及RANKL表達促進破骨細胞發(fā)育。本實驗的研究結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)的DPSCs炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌量明顯小于SHED,且在炎癥相關(guān)基因的表達倍數(shù)上更是小于 SHED。在骨的重塑過程中涉及經(jīng)典的RANK/RANKL/OPG(核因子κB受體活化劑/ RANK配體/骨保護素)受體配體系統(tǒng)，在骨質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，且OPG和RANKL分別是破骨發(fā)生的抑制因子和促進因子，RANKL與OPG者的比值在破骨細胞分化成熟中有重要作用[12]。RANK作為RANKL的受體，當RANKL與RANK結(jié)合后，啟動傳遞破骨細胞分化信號，使破骨細胞前體細胞開始增殖、分化以及細胞融合，形成破骨細胞，從而促進骨質(zhì)的吸收；而當RANKL的另一種受體OPG與RANKL結(jié)合后，會抑制破骨細胞的功能，也會抑制破骨細胞前體細胞的進一步發(fā)育，從而抑制骨質(zhì)的吸收。在本實驗中，SHED和DPSCs均表達RANKL和OPG，但SHED在破骨相關(guān)基因RANKL的表達呈上調(diào)趨勢，明顯高于DPSCs。結(jié)果提示SHED相對于DPSCs具有更強的破骨能力。因此，本實驗結(jié)果表明，與DPSCs相比，SHED不僅具有更強的成骨分化能力，還兼有一定的破骨能力。但其具體的調(diào)節(jié)機制尚不清楚，還需進一步研究。

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Comparative study on the biological function of dental pulp stem cells and dental pulp stem cells

PANG Zhen-zhen,WangLiang,GAO Lei,LIU Qin-zan,LI Ye
(Department of Stomatology,Baoding First Central Hospital,Hebei 071000,China)

Objective:Comparative study on the biological function of human dental pulp stem cells(SHED)and permanent teeth pulp stem cells(DPSCs)from different angles,and to explore the effect of bone reconstruction.Methods:SHED and DPSCs were isolated and cultured by lim iting dilution.Oil-red O staining was induced for 14 days,and alizarin red staining was carried out for 21 days.The levels of IL-6 and TNF-α were detected by ELISA.Two kinds of stem cells were cultured in vitro and induced by ALP after 7d staining.The expression of Runx2,RANKL and OPG were detected by real-time quantitative PCR.Results:The isolated SHED and DPSCs have osteogenic and adipogenic differentiation ability,which is consistent w ith the characteristics of stem cells.SHED expression of IL-6 and TNF-α were higher than that of DPSCs (P＜0.05);Both kinds of stem cells express Runx2 OPG and RANKL after osteoinductive differentiation,but the expression of SHED obviously higher than that of DPSCs(P＜0.05).Conclusion:Compared w ith DPSCs,SHED has not only the ability of osteogenic differentiation but also an osteoclast capacity,rem ind that SHED may participate in the bone reconstruction.

human exfoliated deciduous dental pulp stem cells;dental pulp stem cells;TL-6;Runx2

R78

A

1672-2973(2017)03-0000-00

2017- - )

龐真貞 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 主治醫(yī)師 河北071000

王 良 保定市第一中心醫(yī)院手術(shù)室 護師河北 071000

高 磊 保定市第一中心醫(yī)院彩超室 副主任醫(yī)師 河北071000

劉欽贊 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 醫(yī)師 河北 071000

李 曄 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 主任醫(yī)師 河北071000