直流微電場對鈦種植體骨結(jié)合影響的初步研究

韓 巍 高羽萱 王瀟宇 劉 娜 李鴻波

直流微電場對鈦種植體骨結(jié)合影響的初步研究

韓 巍 高羽萱 王瀟宇 劉 娜 李鴻波

目的：初步探究直流微電場對鈦種植體骨結(jié)合的影響。方法：建立大鼠脛骨種植體模型，加載直流微電場，4周或8周后分別進(jìn)行種植體周圍骨密度的測量，扭矩值的測定，硬組織磨片的分析。結(jié)果：實驗組種植體接觸率明顯高于對照組，實驗組骨小梁間隔明顯低于對照組(P＜0.05)。第4周及第8周實驗組大鼠種植體的平均旋出扭矩值均明顯高于對照組(P＜0.05)。第4周實驗組大鼠種植體骨結(jié)合率明顯高于對照組，種植體周骨小梁面積百分?jǐn)?shù)升高明顯(P＜0.05)。組織學(xué)結(jié)果顯示：加載電場后，骨組織向種植體表面延伸生長，高倍鏡下可見其形態(tài)類似于“偽足”。直流微電場組其標(biāo)本鈣化及未完全鈣化骨組織密集，與種植體的附著密度大，骨質(zhì)致密，且骨質(zhì)成熟度高，而對照組種植體周圍骨組織稀疏，新生骨小梁間隔明顯偏大，小梁間的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)明顯不如實驗組密集，骨成熟度及與種植體的粘附程度均稍差。結(jié)論：直流微電場可增強SD大鼠脛骨種植體周骨密度，促進(jìn)骨結(jié)合。

動物實驗；種植體；骨結(jié)合；直流微電場

種植體修復(fù)術(shù)日益成為修復(fù)牙缺失、牙列缺損的主流治療方式之一[1]。種植體-骨整合過程與骨折的愈合類似，良好的骨整合是種植治療成功的先決條件[2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是形成種植體-骨界面骨整合的種子細(xì)胞[3]。提高BMSCs在骨整合過程中的遷移速率和成骨能力是研究的熱點，目前常用的方法主要有改變種植體表面形態(tài)、物理因素及化學(xué)因素的刺激等[4，5]。骨是天然的良導(dǎo)體，外源性電場可以促進(jìn)骨折的愈合[6]。目前有研究表明電容螯合電場可促進(jìn)犬牙槽骨骨折愈合及兔脛骨種植體植入后的骨愈合[7]。我課題組先前細(xì)胞實驗結(jié)果顯示：直流微電場可促進(jìn)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、增殖及分化成骨，并篩選出最適電場強度及最佳作用時間(4小時，200mv/mm)[8]。直流微電場對活體動物植入物與骨結(jié)合的影響，目前尚未見報道。因此本研究擬利用大鼠種植體模型探究直流微電場對脛骨植入物-骨結(jié)合的影響

1.材料及方法

1.1 實驗對象及材料 SPF級雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物公司)，重量150-180g。所有的動物護(hù)理程序及動物使用方式均通過中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會審查。主要實驗材料見表1。

表1 實驗材料

1.2 構(gòu)建大鼠脛骨種植體模型 將80只6周齡的SD大鼠隨機分為兩組，全身麻醉，于膝關(guān)節(jié)下1cm處沿肢體長軸內(nèi)側(cè)切開，分離肌肉、筋膜及骨膜，充分暴露骨面。術(shù)野為一平緩的三角形骨面，保證各只大鼠均在同一位置植入，用TR12金剛砂車針備洞，洞深2mm。旋入種植體，配合剪切扭力計測量扭矩，使種植體旋入扭矩均維持15N，沖洗手術(shù)部位，縫合肌層及皮膚，種植體頂帽部分暴露。手術(shù)后第二天加載直流微電場，將陽極特制銅片卡固定于種植體頂帽，在平行于頂帽的對側(cè)放置由高分子塑料特制的陰極卡托(內(nèi)嵌銅片)，固定，測量陰陽極銅片間的距離，連接可調(diào)電容器。實驗組每天加載4小時，場強維持在200m v/mm，加載14天，對照組做空白對照手術(shù)后無其它處理。

1.3 種植體周骨密度測定 分別于種植術(shù)后的第4周及第8周，各取實驗組及對照組大鼠5只，頸椎脫臼法處死，取含有種植體的完整脛骨，固定。利用M icro CT儀測量種植體周圍骨組織的密度。隨后將各組標(biāo)本分別固定于鉗夾工作臺上，種植體頂帽連接剪切扭力計，在扭力計的施力端逐漸加力，直至種植體松動，讀取數(shù)值，該數(shù)值為種植體骨界面間的剪切強度。

1.4 種植體周圍形態(tài)計量學(xué)、組織形態(tài)學(xué)觀察于種植術(shù)后的第4周，各取實驗組及對照組大鼠5只，頸椎脫臼法處死，取材，甲醛固定30分鐘，在濃度梯度分別為70%、90%、100%的乙醇和氯仿溶液中分別依次進(jìn)行浸泡脫水。后將標(biāo)本依次置于處理液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中浸泡，4℃，2天，隨后在37℃下二步法包埋(古莎7200樹脂包埋液)，將包埋后的標(biāo)本粘附于蓋玻片上，利用磨片機修整標(biāo)本，暴露種植體-骨界面，拋光打磨，將另一蓋玻片粘附于組織面上，切片機切割出100-200μm厚的切片。磨片機依次以800目、1200目砂紙將組織片研磨至30μm厚，最后用4000目砂紙拋光，亞甲基藍(lán)-酸性品紅法染色。光學(xué)顯微鏡下觀察。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織計量學(xué)分析。

相關(guān)計量公式：種植體骨結(jié)合率=種植體與髓腔內(nèi)鈣化骨基質(zhì)接觸的總長度/髓腔內(nèi)種植體外形輪廓的總長度×100%；種植體周圍骨小梁面積百分?jǐn)?shù)=種植體周圍0.2mm內(nèi)骨小梁總面積/種植體周圍0.2mm內(nèi)的區(qū)域總面積×100%。

2.結(jié)果

2.1 構(gòu)建SD大鼠脛骨種植體模型 種植手術(shù)嚴(yán)格遵循無菌操作的原則，所有標(biāo)本均建模成功，植入后的大鼠生長良好，無死亡。術(shù)后第二天X線片示種植位置準(zhǔn)確，無較大偏移，見圖1。

圖1 大鼠脛骨種植體模型

2.2 脛骨種植體周骨密度測定 對M icro-CT測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。種植體植入后4周，實驗組種植體-骨體積分?jǐn)?shù)(骨體積/總體積)及骨小梁的厚度均明顯高于對照組(P＜0.05)，且相比于對照組骨小梁間隔降低明顯，骨小梁數(shù)目升高(P＜0.05)，骨小梁間隔小表示骨密度較高。結(jié)果見表2，圖2。

表2 Micro-CT脛骨種植區(qū)域兩個不同組第4周的參數(shù)比較(Mean±SD)

圖2 第4周M icro CT三維重建圖

2.3 旋出種植體扭矩值測定 分別對第4周及第8周標(biāo)本進(jìn)行種植體旋出扭矩值測定，結(jié)果顯示加載直流微電場的實驗組平均旋出扭矩明顯高于未加載直流微電場的對照組組(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 大鼠脛骨種植體旋出扭矩值(N·cm)(Mean±SD)

2.4 種植體形態(tài)計量學(xué)分析 由Image-Pro Plus 6.0數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)分別測量兩組實驗標(biāo)本的種植體與髓腔內(nèi)鈣化骨基質(zhì)接觸的總長度，髓腔內(nèi)種植體外形輪廓的總長度，種植體周圍0.2mm內(nèi)骨小梁總面積及種植體周圍0.2mm內(nèi)的區(qū)域總面積的相對數(shù)值。結(jié)果顯示：第4周實驗組標(biāo)本種植體骨結(jié)合率明顯高于對照組標(biāo)本(P<0.05)；且實驗組標(biāo)本的種植體周圍骨小梁面積百分?jǐn)?shù)明顯增高(P<0.01)，結(jié)果見表4。

表4 第4周大鼠脛骨種植體骨結(jié)合率和大鼠脛骨種植體周骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(Mean±SD)

2.5 種植體組織形態(tài)學(xué)觀察 對所獲兩組樣本切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示：直流微電場組種植體周圍骨組織向種植體表面延伸生長，高倍鏡下可見其形態(tài)類似于“偽足”。直流微電場組其標(biāo)本鈣化及未完全鈣化骨組織密集，與種植體的附著密度大，骨質(zhì)致密，且骨質(zhì)成熟度高，而對照組種植體周圍骨組織稀疏，新生骨小梁間隔明顯偏大，小梁間的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)明顯不如實驗組密集，骨成熟度及與種植體的粘附程度均稍差(見圖3)。

圖3 大鼠脛骨術(shù)后第4周種植體周組織形態(tài)

3.討論

本實驗發(fā)現(xiàn)加載直流微電場后種植體周圍骨小梁厚度及種植體周圍骨密度均明顯增加，直流微電場的加載可促進(jìn)類骨基質(zhì)的合成及分泌，使礦物質(zhì)的沉積及鈣化速率明顯加快，種植體-骨界面骨質(zhì)生成速度及成熟度明顯高于未加載直流微電場組。從而證實直流微電場可以促進(jìn)種植體-骨界面的骨整合，可以縮短種植體植入后的愈合時間。種植體-骨界面的結(jié)合過程類似于骨折的一般愈合過程[9，10]。有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，以大鼠為動物模型的骨折愈合在受到外源性電場刺激后其骨折的愈合速度明顯加快，血痂改建期明顯縮短，證明外源性電場可有效促進(jìn)骨愈合[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，電容鰲合電場可以有效促進(jìn)鈦植入物與狗脛骨骨整合的速度[12]。但是目前對于直流微電場促進(jìn)種植體骨結(jié)合的動物實驗卻鮮有報道，本實驗在前期細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)上通過動物實驗進(jìn)一步證實了直流微電場對種植體骨結(jié)合的促進(jìn)作用。

本實驗采用第4周及第8周種植體旋出扭矩值評價種植體-骨整合的效果。有研究證實糖尿病大鼠脛骨鈦植入物第4周旋出扭矩明顯低于正常大鼠脛骨鈦植入物旋出扭矩值[13]。另有實驗證實，兔脛骨種植體在第4周至第8周平均旋出扭矩值明顯發(fā)生改變[14]。雖然上述實驗和本實驗研究方向及種植體類型均有差異，但利用第4周及第8周旋出扭矩值得測定作為評價指標(biāo)是可行的、可靠的。本實驗中直流微電場加載組該項指標(biāo)明顯高于未加載直流電場的對照組，說明直流微電場作為一種物理刺激因素促進(jìn)種植體-骨界面的骨整合是行之有效的。

綜上所述，直流微電場可以增強大鼠脛骨種植體周骨密度，促進(jìn)骨與植入物結(jié)合強度，因此，我們證實了直流微電場可以提高種植體骨結(jié)合的能力。

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A prelim inary study on the effect of DCEF on osseointegration of titanium imp lants

HAN Wei,GAO Yu-xuan,WANG Xiao-yu,LIU Na,LI Hong-bo
(Department of Stomatology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective:To investigate the effect of direct current electric field(DCEF)on the osteointegration of titanium implants.M ethods:Put the implants into the rat tibias.After 4 or 8 weeks of DCEF loading,the bone m ineral density, implants rotation torque values and hard tissue grinding analysis of the experimental groups and the control groups were measured.Results:The bone-implant contact rates of the experimental groups were significantly higher than those of the control groups,and the trabecular spaces in the experimental groups were significantly lower than those in the control groups(P＜0.05).The average rotational torque values of the experimental groups were significantly higher than those of the control groups in the 4th and 8th week(P＜0.05).In the 4th week,the osseointegration rate of the implants in the experimental group was significantly higher than that in the control group,and the percentage of trabecular bone area of the implants increased significantly(P＜0.05).The histological results showed that:A fter loaded DCEF,the bone around the implants extended to the implants surface and formed a pseudopod-like structure.The experimental groups were more closely adherent to the implants surface than the control groups.There were a large number of new trabecularbone and bone-like matrix on the surface of the implants.The trabecular bone was connected w ith each other into a net-like structure. The implant-bone interface in the experimental groups had uniform new bone.In the control groups,new bone tissues were loose,bone tissues maturity and the degree of tightness of the implant-bone were less.Conclusion:DCEF can enhance the implant-bone density of SD rat tibia,promote osteointegration.

animal experiment;implant;osseointegration;direct current electric field

R783

A

1672-2973(2017)03-0166-04

2017-01-30)

軍隊十二五課題(項目編號：CWS12J134)解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)項目(項目編號：2016TM-022)

韓 巍 解放軍總醫(yī)院口腔修復(fù)科 碩士生 北京 100853

王瀟宇 解放軍306醫(yī)院口腔科 醫(yī)師 北京 100853

高羽萱 解放軍總醫(yī)院口腔科 醫(yī)師 北京 100853

劉 娜 解放軍總醫(yī)院口腔科 主治醫(yī)師 北京 100853

李鴻波 通訊作者 解放軍總醫(yī)院口腔修復(fù)科 主任醫(yī)師 教授 北京 1000853