大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的SSR標(biāo)記定位

雷夢(mèng)林，連世超

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006）

大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的SSR標(biāo)記定位

雷夢(mèng)林1，連世超2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006）

利用組合不育系SXJLCMS1A×恢復(fù)系Z-119-99構(gòu)建F2育性分離群體，進(jìn)行育性的遺傳模式分析和恢復(fù)基因定位。結(jié)果表明，F(xiàn)1群體全為可育株，F(xiàn)2群體的可育株與半不育株經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)符合1∶1的分離比例，說(shuō)明該大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育符合單基因配子體不育的遺傳模式；利用F2分離群體，采用445對(duì)大豆SSR引物對(duì)其恢復(fù)基因進(jìn)行分子標(biāo)記和定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該恢復(fù)基因與J連鎖群的2個(gè)標(biāo)記Satt674和Satt249連鎖，距2個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為8.7，9.6 cM。

大豆；基因定位；細(xì)胞質(zhì)雄性不育

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)[1]。有關(guān)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究是DAVIS[2]首次在美國(guó)的專(zhuān)利中報(bào)道。孫寰等[3]育成了我國(guó)第1個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，并實(shí)現(xiàn)栽培大豆三系配套。目前，我國(guó)已育成適應(yīng)于不同生態(tài)區(qū)種植、農(nóng)藝性狀良好、不育度高、育性穩(wěn)定的優(yōu)良不育系10多個(gè)[4-10]，并審定了多個(gè)大豆雜交品種[11-14]。雖然我國(guó)在大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的應(yīng)用方面已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但對(duì)其機(jī)制研究仍然相對(duì)滯后。因此，研究大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的形成原因及育性恢復(fù)的機(jī)制，對(duì)了解大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的機(jī)制具有重要的理論價(jià)值與實(shí)際意義[15]。

利用SSR（Simple Sequence Repeats，SSR）標(biāo)記定位基因是研究大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)機(jī)制的主要手段之一。趙麗梅等[16]、許占友等[17]、WANG等[18]、董建生等[19]、湯復(fù)躍等[20]、李曙光等[21]、連世超等[22]、楊守萍等[23]、DONG等[24]以及YANG等[25]都利用分子標(biāo)記手段對(duì)大豆不同細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因進(jìn)行了研究，已將不同的大豆恢復(fù)基因定位在不同的連鎖群上，可見(jiàn)，大豆細(xì)胞質(zhì)遺傳基礎(chǔ)是比較復(fù)雜的。

本研究利用大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SXJLCMS1A和恢復(fù)系Z-119-99構(gòu)建分離群體，對(duì)恢復(fù)基因進(jìn)行遺傳定位分析，以期獲得與恢復(fù)基因連鎖的SSR標(biāo)記，為進(jìn)一步精細(xì)定位并克隆該恢復(fù)基因打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的遺傳分析

大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SXJLCMS1A和恢復(fù)系Z-119-99試驗(yàn)材料由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所衛(wèi)保國(guó)研究員提供。以SXJLCMS1A為母本、Z-119-99為父本構(gòu)建F1群體和F2群體。參試材料于2012—2014年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所榆次東陽(yáng)大豆試驗(yàn)基地網(wǎng)室內(nèi)種植。

大豆盛花期，采摘每株植株中上部當(dāng)天即將開(kāi)放的花蕾3朵，用1%I2-KI染色法觀察父母本及F1，F(xiàn)2的花粉育性，隨機(jī)選取3個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)不育和可育花粉粒的數(shù)目，計(jì)算花粉敗育率。

成熟期，大豆植株育性鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：不育株表現(xiàn)為整株呈濃綠色，葉片肥厚不脫落，莖稈粗壯，結(jié)有大量未受精的幼嫩肉莢；可育植株表現(xiàn)正常，植株葉片呈黃色并脫落，有大量結(jié)實(shí)莢。

通過(guò)盛花期和成熟期的育性表現(xiàn)，F(xiàn)2群體的植株分為可育和半不育2類(lèi)，并采用檢測(cè)方法對(duì)育性分離結(jié)果進(jìn)行遺傳分析。

1.2 SSR標(biāo)記分析

在大豆三節(jié)期，從母本、父本、F1和F2群體植株上分單株摘取葉片，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。通過(guò)CTAB[26]法提取葉片DNA。

利用混合分析法[27]（bulked segregate analysis，BSA），在不育系群體中隨機(jī)選取10株不育系單株的等量DNA混合構(gòu)成不育基因池。在F2群體中隨機(jī)選取10株可育單株的等量DNA混合構(gòu)成可育基因池；隨機(jī)選取10株半不育單株的等量DNA混合構(gòu)成半不育基因池。

從SoyBase網(wǎng)站（http://soybase.org/）上均勻挑選分布在大豆20個(gè)連鎖群上的SSR引物445對(duì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成所有引物。PCR反應(yīng)體系（10 μL）：0.5 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μLPrimer（10 μmol/L），5 μL模板DNA（10 ng/μL），1μL10×PCRbuffer，0.1μLReal Taq DNAPolymerase（5 U/μL），1.4 μL dd H2O。PCR反應(yīng)在BIO-RAD C1000 Thermal Cycler擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火溫度下退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，用數(shù)碼相機(jī)記錄試驗(yàn)結(jié)果。

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳顯示的帶型，與可育基因池帶型一致記錄為“A”，與半不育帶型一致記錄為“B”，與不育系帶型一致記為“C”，將統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Join Map 4.0作圖軟件分析標(biāo)記與恢復(fù)基因之間的連鎖關(guān)系，構(gòu)建分子遺傳圖譜，并計(jì)算遺傳距離[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞質(zhì)雄性不育SXJLCMS1A的遺傳模式分析

通過(guò)對(duì)不育系SXJLCMS1A全部植株花粉進(jìn)行鏡檢，結(jié)果表現(xiàn)為花粉全不育（圖1-A），而恢復(fù)系Z-119-99表現(xiàn)為全可育（圖1-C）。SXCMS1A和Z-119-99的F1群體在花期進(jìn)行鏡檢，結(jié)果顯示全為半不育（圖1-B），統(tǒng)計(jì)計(jì)算F1花粉敗育率為55.52%，接近50%，成熟期全部表現(xiàn)為可育株。SXCMS1A和Z-119-99的F2群體共317株，花粉鏡檢表現(xiàn)為可育和半不育2種類(lèi)型?；ǚ塾詤⒖紝O寰等[29]提出的大豆花粉育性判定標(biāo)準(zhǔn)，可育株、半不育株的數(shù)量分別為151，166，經(jīng)卡方檢測(cè)符合1∶1（χ2＝0.33，P＝0.56＞0.05）的分離比例（表1），F(xiàn)2群體成熟期的育性表現(xiàn)支持該分離結(jié)果。因此，推測(cè)該大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育符合單基因配子體不育遺傳特點(diǎn)。

表1 F2群體植株育性分離的適合性測(cè)驗(yàn)

2.2 大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因定位

通過(guò)遺傳分析研究，已經(jīng)確認(rèn)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育屬于單基因配子體不育。利用445對(duì)SSR引物對(duì)構(gòu)建的可育基因池、不育基因池、半不育基因池和父母本進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于J連鎖群上的標(biāo)記Satt674，Satt249擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)出特異的多態(tài)性。利用標(biāo)記Satt674，Satt249對(duì)F2群體進(jìn)行擴(kuò)增（圖2-A，B），統(tǒng)計(jì)群體的多態(tài)性結(jié)果，并結(jié)合表型鑒定結(jié)果，用Join Map 4.0遺傳作圖軟件進(jìn)行作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與恢復(fù)基因連鎖的SSR引物Satt674，Satt249的遺傳距離分別為8.7，9.6 cM（圖3）。

3 討論

花粉育性劃分標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育及其恢復(fù)性遺傳研究的前提條件，本研究參考孫寰等[29]提出的大豆敗育率劃分標(biāo)準(zhǔn)，將試驗(yàn)中的大豆花粉分為不育、半不育和可育3類(lèi)，其中，不育花粉的敗育率為90.1%～100%、半不育花粉的敗育率為10.1%～90%、可育花粉的敗育率為0～10%。通過(guò)界定，將F2群體的花粉育性區(qū)分開(kāi)來(lái)，以期獲得更可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，試驗(yàn)鑒定花粉育性還運(yùn)用目測(cè)法觀察花藥的散粉情況，不育株上的花藥瘦小、干癟，花藥不開(kāi)裂或開(kāi)裂不散粉；而可育株上的花藥開(kāi)裂，有大量的花粉且形態(tài)飽滿(mǎn)，花粉為淡黃色。在大豆成熟期，通過(guò)對(duì)植株的形態(tài)特征再一次鑒定植株的育性，大大降低了只用一種方法的局限性和誤差。因此，在育性鑒定方法上的研究是可行的。

采用分子標(biāo)記定位基因是作物研究雜種優(yōu)勢(shì)利用的前提。試驗(yàn)采用445對(duì)SSR引物對(duì)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因進(jìn)行分子標(biāo)記定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與恢復(fù)基因連鎖的標(biāo)記Satt674和Satt249，但遺傳距離為8.7 cM還是很大的距離，這不利于后續(xù)的精細(xì)定位和克隆基因等。出現(xiàn)以上不足可能的原因是：一群體數(shù)量不夠大；二標(biāo)記類(lèi)型單一；三標(biāo)記數(shù)量不多。這需要在后續(xù)試驗(yàn)加以改進(jìn)，為獲得更緊密的分子標(biāo)記，并為克隆相關(guān)恢復(fù)基因和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

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M apping for Fertility Restoring Genes of Cytop lasm ic M ale Sterility in Soybean by SSR Marker

LEI Menglin1，LIANShichao2
（1.Institute ofCrop Germplasm Resources，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Key Laboratory ofCrop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry ofAgriculture，Shanxi Key Laboratory ofGenetic Resources and Genetic Improvement ofMinor Crops，Taiyuan 030031，China；2.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Utilization of the cytoplasmic male sterile（CMS）line SXJLCMS1A×Z-119-99 constructed F2segregation population, cytoplasmic male sterility restorer gene was located using SSR markers in soybean.The results showed that the F1pollen were fertile.The separation ratio of fertile plants and semi-sterility plants of F2was 1∶1,which was under χ2test.The results of this study showed that cytoplasmic male sterile lines was controlled by single gene gametophyte sterility.The mapping results on F2showed that out of 445 random ly selected SSR markers Satt674 and Satt249 on linkage group J were linked to the male fertility gene Rf with their genetic distances of8.7,9.6 cM.

soybean;gene mapping;cytoplasmic male sterility

S565.1

：A

：1002-2481（2017）07-1053-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.01

2017-04-13

山西省青年科技研究基金項(xiàng)目（2014021029-1）

雷夢(mèng)林（1984-），女，四川巴中人，助理研究員，主要從事大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用研究工作。