綿羊miR-376e-3p的靶基因預測與GO功能分析

馬元，胡子喬,2，張瑩姣，張雁，申彩云，張富權(quán)，劉文忠*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801； 2.深圳市千年盛世基因科技有限公司，廣東 深圳 518005；3.左云縣畜牧獸醫(yī)服務中心，山西 左云 037100)

綿羊miR-376e-3p的靶基因預測與GO功能分析

馬元1，胡子喬1,2，張瑩姣1，張雁3，申彩云3，張富權(quán)3，劉文忠1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801； 2.深圳市千年盛世基因科技有限公司，廣東 深圳 518005；3.左云縣畜牧獸醫(yī)服務中心，山西 左云 037100)

[目的]研究miRNA對脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用，在一定程度上揭示脂肪代謝的分子機制。[方法]本研究選取實驗室前期高通量測序結(jié)果中的miR-376e-3p進行研究，其在不同脂尾型綿羊尾部脂肪組織中差異表達顯著，是脂肪代謝的關(guān)鍵miRNA。用3種軟件對miR-376e-3p進行靶基因預測，并對預測結(jié)果進行GO通路富集分析。[結(jié)果]MiR-376e-3p有25個潛在的靶基因，其中21個基因富集到3種分子功能，23個基因富集到14個生物學過程中，其中Vldlr具有脂蛋白粒子受體活性。[結(jié)論]推測miR-376e-3p可能通過調(diào)節(jié)其潛在靶基因Vldlr參與脂肪代謝。為進一步研究miR-376e-3p和Vldlr在綿羊脂肪代謝中的作用奠定了基礎(chǔ)。

綿羊； miR-376e-3p； 靶基因預測； GO分析

MicroRNA是一類具有調(diào)節(jié)作用的小分子RNA，其自身并不編碼蛋白質(zhì)，長度約為18～24 nt，主要通過與其靶基因mRNA序列3′ UTR[1]或者5′ UTR[2]的堿基互補配對，也有部分通過與CDS區(qū)域結(jié)合，導致mRNA降解或抑制其表達，從而實現(xiàn)對基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前，已發(fā)現(xiàn)很多miRNA參與不同的生物學過程，并對它們的靶基因及調(diào)節(jié)功能進行了研究[3～5]。

脂肪是動物的的重要能量貯存組織。肉用家畜脂肪含量的多少是衡量肉質(zhì)品質(zhì)的一個重要的指標。研究表明，miRNA在人類和小鼠脂肪生成過程中可以調(diào)節(jié)很多功能基因，從而對脂肪細胞的增殖、分化、凋亡等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用[6]。例如，miR-205可以抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖過程[7]，有些miRNAs可以調(diào)節(jié)前脂肪細胞的分化和其他生物過程[8,9]。從調(diào)節(jié)方式來說，miRNA既可上調(diào)[10]也可下調(diào)[11]脂肪的生成。

綿羊是一種重要的肉用家畜，研究人員不斷地探究其脂肪代謝機制，以求更好的改良肉品質(zhì)。本實驗室前期已經(jīng)通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在不同脂尾型綿羊尾部脂肪中差異表達的大量miRNAs[12]，并通過熒光定量PCR技術(shù)進一步證實包括miR-376e-3p在內(nèi)的多個miRNAs在尾脂中差異表達顯著，表明miR-376e-3p可能參與脂肪代謝。但miR-376e-3p及其靶基因在脂肪代謝中的作用機制尚不清楚。

本研究旨在利用生物信息學軟件預測miR-376e-3p的靶基因，通過GO(gene ontology)基因本體[11]通路分析預測結(jié)果中的靶基因作用機制，注釋其靶基因的生物學功能。本研究為miR-376e-3p及其靶基因在脂肪代謝調(diào)控方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用靶基因在線軟件預測miR-376e-3p的靶基因，并利用Venn diagrams在線軟件取交集靶基因，GO Tool對交集靶基因進行通路生物功能的富集。各軟件的功能及網(wǎng)址見表1。

表1 生物信息學軟件

1.2 試驗方法

分別登錄3個在線靶基因預測軟件：miRGator、miRDB和MicroCosm Targets，搜索miR-376e-3p并進行靶基因預測，3個軟件的預測結(jié)果都可以下載為Excel格式的文件。將這3個軟件得到的預測結(jié)果用韋恩圖取交集，得到相對可靠的miR-376e-3p潛在靶基因。MiRBase中綿羊的miR-376e-3p序列為：3′ AACAUAGAGGAAAA-UCCACAUU 5′，由于這3個預測軟件的序列數(shù)據(jù)庫中都沒有綿羊的miRNA序列，而miRNA的種子序列在物種間的保守性很高[17]，所以我們統(tǒng)一選擇模式生物“小鼠”的miR-376e-3p序列進行靶基因的分析預測。

登陸GO分析網(wǎng)站，將3個在線靶基因預測軟件預測得到的交集基因進行GO分析，軟件通過計算這些基因同GO中某一類或幾類特定功能分支的分布關(guān)系，對每一個基因在通路中進行富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-376e-3p靶基因的預測

圖1顯示了MicroCosm Targets、miRGato和miRDB 3個軟件預測出的靶基因韋恩圖，靶基因數(shù)分別為744、465和319個，共得到25個交集靶基因。

圖1 miRGator、miRDB和MicroCosm Targets預測結(jié)果的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of predicted results of miRGator, miRDB and MicroCosm Targets

2.2 miRNAs靶基因生物學功能的分析

對預測出的miR-376e-3p的25個靶基因進行Function Ontology分析，結(jié)果如表2所示。共富集到3種分子功能，具有結(jié)合功能的靶基因有21個，其中有7個基因既有DNA結(jié)合功能又有蛋白質(zhì)結(jié)合功能(Neurod6,Bcl11a,E2f5,Aire,Rabgef1,Myf6,Smarca1)，3個基因只具有DNA結(jié)合功能(Zfp451,Hoxb6,Spo11)，11個基因只具有蛋白質(zhì)結(jié)合功能(Fgb,Psmd3,Ctsh,Lims1,Hat1,Vldlr,Cxcl16,Ube2d,Sncb,Anln,Pdgfd)，其中Vldlr(Very low density lipoprotein receptor)和Cxcl16(chemokines 16)還具有脂蛋白粒子受體活性。

對預測出的miR-376e-3p的25個靶基因進行Process Ontology分析，結(jié)果如表3所示。共富集到包括4個代謝調(diào)控過程、5個代謝過程和5個生物發(fā)育過程在內(nèi)的14個生物學過程。Neurod6,Hoxb6,Ctsh,Bcl11a,Lims1,E2f5,Aire,Myf6,Smarca1,Pdgfd共10個靶基因在14個生物學過程中均有參與。Fgb,Hat1,Vldlr,Ube2d1,Rabgef1,Zfp451共6個基因參與4個代謝調(diào)控過程；Spo11,Fgb,Psmd3,Vkorc1,Hat1,Vldlr,Ube2d1,Rabgef1,Zfp451共9個基因在5個代謝過程均有出現(xiàn)；Spo11,Vkorc1,Anln共3個基因為5個生物發(fā)育過程所共有。

表2 富集到Function Ontology的基因

3 討論

MiRNA與其靶基因的研究通常分為生物信息學預測和試驗驗證兩部分?，F(xiàn)有的靶基因預測軟件通?；诜N子區(qū)的互補配對、序列的保守性、自由能的大小以及結(jié)合位點的開放性來分析[18]，其中一部分軟件如MiRDB還具有機械學習的特點(machine learning)[19]。

本研究所用的3種靶基因預測軟件基于不同的算法，通過算法間的互補提高miRNA預測的科學性和準確性[20]。MicroCosm Targets主要運用miRanda算法，識別要預測的miRNA的潛在結(jié)合位點。該算法要求mRNA的3′ UTR與種子序列完全互補，并通過堿基的配對評估m(xù)iRNA-mRNA雙體結(jié)構(gòu)的熱力學穩(wěn)定性，且每個靶基因至少在數(shù)據(jù)庫中的兩個物種間是保守的[21,22]。綜合這些特性，本研究利用該軟件預測出744個miR-376e-3p的靶基因。miRGator對靶基因的預測有3種算法(miRanda, PicTar, TargetScan)可選擇，本研究選擇來自miRBase數(shù)據(jù)庫的 miRanda算法預測到了465個miR-376e-3p的靶基因。由于miRGator除了具備MicroCosm Targets的特性，還具有位點的開放性預測，因此預測得到的結(jié)果比MicroCosm少。MiRDB的靶基因預測由MirTarge工具進行，利用機械算法鑒別miRNA靶基因結(jié)合位點相關(guān)的共同特征[23]。本研究中該軟件預測出193個miR-376e-3p的靶基因，在3個軟件中預測的靶基因最少。對3個軟件的預測結(jié)果取交集，最終得到25個miR-376e-3p的靶基因，大大縮小了靶基因的范圍，并在一定程度增加了預測的精確度。因此，為了縮小在靶基因預測時的盲目性和片面性，考慮不同預測軟件的理論基礎(chǔ)和特性是必要的。

GO共有3個本體，分別描述基因的分子功能(molecular function)、所處的細胞位置(cellular vocabulary)和參與的生物學過程(biologicalprocess)[24]。本研究就其中的2個本體進行了研究。分子功能分析發(fā)現(xiàn)，miR-376e-3p有21個靶基因富集到了3個分子功能，其中具有脂蛋白粒子受體活性的靶基因有Vldlr和Cxcl16。生物學過程分析發(fā)現(xiàn)，miR-376e-3p有23個靶基因分別富集于14個生物學過程中，其中Vldlr參與了除動物器官發(fā)育以外的13個生物學過程。早在2006年，P. Degrace等研究發(fā)現(xiàn)，Vldlr是肝臟合成甘油三酯的轉(zhuǎn)運蛋白，與脂肪代謝密切相關(guān)[25]。2014年Nguyen等[26]以小鼠的前體脂肪細胞為研究對象，進一步證實Vldlr是調(diào)節(jié)脂肪代謝的關(guān)鍵基因，具有誘導脂肪生成，促使脂肪細胞肥大的作用。同樣具有脂蛋白粒子受體活性的靶基因Cxcl16，在相關(guān)研究中主要側(cè)重于動脈硬化、炎癥性疾病和HIV病毒感染[27]，在脂肪代謝的研究中并不多見。因此，推測miR-376e-3p可能通過作用于其潛在靶基因Vldlr調(diào)控綿羊的脂肪代謝。

表3 富集到Process Ontology的基因

4 結(jié)論

3種靶基因預測軟件分析得到25個miR-376e-3p的潛在靶基因。這些基因一共富集到包括3種分子功能和14個生物學過程，其中miR-376e-3p可能通過作用于其靶基因Vldlr在綿羊的脂肪代謝中發(fā)揮一定的作用。

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(編輯：武英耀)

Target genes prediction and GO functional analysis of the ovine mir-376e-3p

Ma Yuan1, Hu Ziqiao1,2, Zhang Yingjiao1, Zhang Yan3, Shen Caiyun3, Zhang Fuquan3, Liu Wenzhong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China； 2.MillenniumGenomicsIncorporated,Shenzhen518005,China； 3.TheanimalhusbandryandveterinaryservicecenterofZuoyun,Zuoyun037100,China)

[Objective]Study the regulation of miRNA on fat metabolism can partly reveal the molecular regulatory mechanism of the fat metabolism.[Methods]This study selected miR-376e-3p from theresult of high throughput sequencing by our lab before, this miRNA was significant differentially expressed between tail fat tissues from different fat-tailed sheep, and it was a key miRNA of fat metabolism. Three different prediction softwares were used to predict the target genes of miR-376e-3p, and mapping those predicted genes to pathways by GO.[Results]Theresult showed that miR-376e-3p has 25 potential target genes, and 21 of them are mapped to 3 different function ontology, 23 of them mapped to 14 different process ontology, among those genesVldlrhas lipoprotein particle receptor activity.[Conclusion]We speculated that miR-376e-3p may regulate the fat metabolism by through its potential target genesVldlr. This study lays a foundation for further study the function of miR-376e-3p andVldlrin ovine fat metabolism.

Sheep, MiR-376e-3p, Target gene prediction, GO analysis

2017-03-31

2017-04-22

馬元(1990-)，男(漢)，山西太原人，碩士研究生，研究方向：肉用綿羊的分子遺傳育種

*通信作者：劉文忠，教授，博士生導師，Tel: 0354-6288337；E-mail: tglwzyc@163.com

國家自然科學基金(31372292)

S826

A

1671-8151(2017)07-0499-05