小麥HMW-1Bx17基因啟動子的功能驗證

王亞紅，劉縉，王玉國

(1.運城學院 機電工程系，山西 運城 044000；2.運城學院 生命科學系， 山西 運城 044000；3.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

小麥HMW-1Bx17基因啟動子的功能驗證

王亞紅1,3，劉縉2*，王玉國3*

(1.運城學院 機電工程系，山西 運城 044000；2.運城學院 生命科學系， 山西 運城 044000；3.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

[目的]小麥HMW-1Bx17基因是在小麥胚乳中特異高表達的基因，該基因啟動子的獲得可為進一步研究小麥高分子量麥谷蛋白種子特異表達的調(diào)控模式提供基礎材料，并為小麥品質(zhì)改良的基因工程研究奠定基礎。[方法]本文以改良的CTAB法提取小麥“舜麥1718”基因組DNA為模板，根據(jù)已知序列設計引物，利用嵌套PCR擴增1Bx17基因啟動子片段。構建1Bx17基因啟動子啟動下的GUS(β-葡糖苷酸酶) 基因表達載體，用基因槍法分別導入小麥根、莖、葉、胚乳及胚中進行瞬時表達，同時構建了1Bx17基因啟動子驅(qū)動的抗菌蛋白Gnk2-1基因表達載體用于小麥幼胚穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。[結果]X-gluc染色檢測表明，GUS基因在該啟動子的驅(qū)動下能在小麥胚乳中特異表達。通過對再生抗性植株的RT-PCR鑒定，初步表明已獲得轉(zhuǎn)基因植株，并進一步證明了啟動子的驅(qū)動功能。[結論]本文所獲得小麥1Bx17基因的啟動子在小麥基因工程遺傳改良等方面具有一定的利用潛力。

小麥； 1Bx17基因； 啟動子；Gnk2-1基因； 瞬時表達

小麥是全球種植面積最大，也是我國主要栽培的糧食作物之一[1]。隨著人民生活水平的提升，高品質(zhì)小麥育種已經(jīng)成為小麥育種研究者的重要目標之一。研究表明，高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)通過分子間二硫鍵的聚合作用，共同影響著面筋強度和面團彈性[2,3]。其中HMW-GS雖然只占小麥貯藏蛋白的10%，但其數(shù)量、類型、結構和含量卻對面筋強度和面團黏彈性等加工性狀起決定性作用[4,5]。為改善小麥品質(zhì)，近年來諸如1Ax、Bx7、Dx5、Dy10、Bx14、Bx20、By20等越來越多的高分子量麥谷蛋白優(yōu)質(zhì)亞基基因被克隆和轉(zhuǎn)化[6～9]。在此過程中，為了避免組成型表達增加植物的代謝負擔和能量浪費，分離和鑒定能夠在胚乳中高效特異表達的啟動子，并應用于轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`顯得尤為重要[10]。

已有研究表明，小麥HMW-1Bx17基因是在小麥種子中高效表達的優(yōu)質(zhì)亞基基因[11,12]。因此，本研究利用嵌套PCR從山西本地優(yōu)質(zhì)品種“舜麥1718”小麥基因組中克隆了1Bx17基因啟動子片段[13]。并構建1Bx17基因啟動子驅(qū)動的GUS報告基因真核表達載體，利用基因槍法分別導入小麥根、莖、葉、胚乳及胚中，以驗證啟動子的胚乳特異性驅(qū)動功能。在此基礎上，進一步構建了1Bx17基因啟動子驅(qū)動的包含銀杏種仁抗真菌蛋白Gnk2-1的表達載體，用于小麥幼胚轉(zhuǎn)化[14,15]。初步鑒定表明已獲得轉(zhuǎn)基因植株，試驗結果進一步驗證了啟動子的胚乳表達活性。本文同時也為進一步研究抗真菌蛋白Gnk2-1在小麥中的抗病作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本研究以山西本地栽培品種“舜麥1718”為植物材料，抽提基因組DNA。植物真核表達載體pAHC25，包含Gnk2-1基因的質(zhì)粒均由本試驗保存。質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自美國AXYGEN公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等皆購自大連TaKaRa有限公司；pGM-T克隆試劑盒購自北京天根公司；引物合成和序列測定均由上海生工完成，其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純藥品。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因組DNA提取

取20～30粒小麥“舜麥1718”成熟種子，經(jīng)過夜浸泡露白后，24 ℃暗培養(yǎng)3 d，剪取適量幼嫩葉片用于抽提基因組DNA。

抽提液的配置：溶液I(0.35 mol·L-1山梨醇，0.1 mol·L-1Tris，5 mmol·L-1EDTA-Na2，pH調(diào)至7.5)；溶液II(0.2 mol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA-Na2， 2.0 mol·L-1NaCl，2%CTAB，pH調(diào)至7.5)；溶液III(5% N-月桂酰肌氨基鈉鹽)，按照1∶1∶0.4體積比混和，加入亞硫酸氫鈉(3.8 g·L-1)，65 ℃預熱，既為抽提液。

取0.15 g小麥幼嫩葉片，經(jīng)過液氮研磨后放入盛有700 μL抽提液(65 ℃預熱)的1.5 mL離心管中，充分混勻，65 ℃水浴裂解40 min。加入700 μL氯仿：異戊醇(24∶1)，猛烈混勻，離心(12 000×g離心10 min)。取上清于新離心管中，加入0.8倍預冷異丙醇并混勻，在-20 ℃冰箱中靜置30 min。隨后離心(12 000×g，10 min), 棄上清，將沉淀用1 mL 70% 乙醇清洗一次，離心干燥，溶于50 μL含有RNase A的無菌水中。1.2.2HMW-GS1Bx17基因啟動子的克隆

根據(jù)已知1Bx17基因啟動子序列(GenBank accession number： KC254854)設計嵌套引物：

引物1：5′-ACCAAGCCAAATACTCCA

引物2：5′-GCTCGTGCTCACATTGTAG-3’

引物3：5′-GACTACTGCCGCAAAGAG-3’

PCR擴增體系為：gDNA 1 μL，引物1 (10 mmol·L-1) 1 μL，引物2 (10 mmol·L-1) 1 μL，5×HS PCR bufer(Mg2+Plus) 10 μL，dNTP Mixture (10 mmol each) 0.5 μL，Prime STARTMHS DNA聚合酶(5 U·μL-1)) 0.25 μL，ddH2O補足50 μL；PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、40 s，72 ℃、2.5 min， 30個循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min。第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為下一輪PCR模板，用引物1和引物3再進行一次PCR反應，反應條件同上。PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，回收產(chǎn)物與pGEM-T載體16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α；隨機各挑取10個單克隆，抽提質(zhì)粒后進行酶切鑒定，并送上海生工進行測序分析。

1.2.3 pBx17-GUS和pBx17-GNK載體的構建

利用PCR法在1Bx17啟動子片段上下游引物上分別引入HindIII和SamI酶切位點(下劃線)：

引物4：5’-CCCAAGCTTGGGACCAAGCC AAATACTCCA-3’

引物5：5’-TCCCCCGGGGGACTCAGTGA ACTGTCAGTGAA-3’

用HindIII和SamI兩種內(nèi)切酶對pAHC25質(zhì)粒進行部分酶切，回收7 684 bp的片段，與引入酶切位點的1Bx17啟動子片段，按照摩爾比1∶3，16 ℃過夜連接。次日將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，從轉(zhuǎn)化平板隨機挑取5個單克隆，提取質(zhì)粒，并做酶切鑒定。正確的克隆命名為pBx17-GUS。

pBx17-GNK的構建：以來自銀杏種仁抗真菌蛋白基因為模板，設計引物6及引物7(粗體為起始密碼子和雙終止密碼子，下劃線為酶切位點)。分別在引物上引入SamI和SacI酶切位點(下劃線表示)。

引物6：5’-TCCCCCGGGGGAATGAAGACTATGAGAATG-3’

引物7：5’-CGAGCTCGTTATTAGAAGCTCCTCTGCTC-3’

pBx17-GUS經(jīng)過SamI和SacI雙酶切，再與引入雙酶切位點的Gnk2-1基因ORF片段混合，16 ℃過夜連接。并對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，陽性克隆通過進一步測序選擇讀碼框正確的克隆，命名pBx17-GNK，用于小麥幼胚轉(zhuǎn)化。

1.2.4 基因槍瞬時轉(zhuǎn)化

選取開花后12～14 d的小麥品種“舜麥1718”幼嫩種子、經(jīng)表面消毒后，去除種皮，將胚和胚乳分離后，正面向上與幼嫩的小麥根、莖、葉擺放在高滲MS培養(yǎng)基(含有0.4 mol·L-1甘露醇)中央直徑3 cm的范圍內(nèi)，暗培養(yǎng)4 h預處理。

用構建好的表達質(zhì)粒DNA包裹金粉粒。將2.5 mg直徑1.0 μm金粉置于離心管中，加無水乙醇200 μL，用超聲波粉碎機分散至手感溫度略發(fā)燙。離心(10 000×g，5 min)，去上清。加200 μL 70%乙醇，渦旋振蕩30 s。靜置1 min。再次離心(16 000×g，5 min)，去上清(重復3次)。加入50 μL無菌水，渦旋振蕩，離心沉淀，棄上清。在沉淀的金粉中加入50%甘油100 μL，振蕩。取50 μL懸液邊振蕩邊迅速依次加入5 μL質(zhì)粒DNA(1 g·L-1)，50 μL氯化鈣溶液(2.5 mol·L-1)，20 μL亞精胺(0.1 mol·L-1)，渦旋振蕩30 s，然后冰上靜置10 min，10 000×g離心6 min，棄上清。加入150 μL 70%乙醇，10 000×g離心3 min，棄上清(重復2次)。加入200 μL無水乙醇10 000×g離心3 min，棄上清。加入50 μL無水乙醇振蕩成懸浮液，置于冰上備用。采用PDS 1 000/He Biolistic Particle Delivery System (Bio-Rad) 進行轟擊，壓力為1 350 Pa，轟擊距離為6 cm，轟擊1槍。轟擊后繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)16 h。

1.2.5 組織化學染色

將轟擊后的小麥胚、胚乳、根、莖、葉分別置于一定量的X-gluc底物溶液中，37 ℃過夜恒溫培養(yǎng)，當胚乳GUS藍斑較為明顯時取出小麥各組織，并于無水乙醇和乙酸按 3∶1配置的固定液中固定處理。染色后選擇有代表性的個體在解剖顯微鏡下照相。

1.2.6 基因槍幼胚轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因材料選取開花后12～14 d的小麥品種“舜麥1718”未成熟胚，預處理以及基因槍微粒子彈制備方法同1.2.3，轟擊參數(shù)：壓力為1 100 Pa，轟擊距離為6 cm，轟擊1槍，轟擊后繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)16 h。然后將幼胚轉(zhuǎn)移至含有2 mg·L-12，4-D和5 mg·L-1PPT的MS固體培養(yǎng)基上，進行16 h光照，8 h暗培養(yǎng)，誘導幼胚愈傷組織。3周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有5 mg·L-1PPT的分化培養(yǎng)基上進行分化。轉(zhuǎn)移大約3 cm高的綠苗至含有5 mg·L-1PPT 1/2 MS固體生根培養(yǎng)基上，進行幼苗壯根培養(yǎng)。待長出3～5條根后，經(jīng)鍛煉后移栽溫室。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的PT-PCR鑒定

經(jīng)過早期PCR篩選，共篩選獲得11株T0代轉(zhuǎn)基因抗性植株，其中有4株正常結實。在開花14 d左右參照文獻中的方法提取小麥胚乳總RNA，進行RT-PCR檢測Gnk2-1基因表達情況[16]。引物序列如下：

引物8：5′-TGAATTCGGCCTTCAT-3’

引物9：5′-CCTCTGCTCGTATTGGAT -3’

PCR擴增體系為：cDNA 0.5 μL，10×PCR bufer(Mg2+Plus) 2.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol each)0.5 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.25 μL，ddH2O補足25 μL；PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、40 s，30個循環(huán); 72 ℃充分延伸5 min。反應產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 試驗結果

2.1 小麥基因組DNA提取和HMW-GS1Bx17基因啟動子克隆

“舜麥1718”幼嫩葉片用于抽提基因組DNA，經(jīng)過電泳檢測如圖1(A)所示，泳道1～2可見清晰條帶，大小與基因組理論值接近，無彌散拖尾，說明基因組質(zhì)量較好。對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠檢測，如圖1(B)所示，泳道1在約1 600 bp處出現(xiàn)單一條帶，與理論大小1 676 bp基本一致，初步表明該條帶可能是目標啟動子序列。測序結果表明，該序列與已知序列(GenBank accession number： KC254854)一致性達到99%，表明成功獲得了小麥1Bx17基因啟動子序列。

圖1 小麥基因組gDNA電泳圖(A)和小麥1Bx17啟動子PCR擴增結果(B)Fig.1 Agrose gel electrophoresis of wheat gDNA (A) and 1Bx17 promoter(B) 注：M,DL2000 分子量標準；(A):1～2，小麥基因組DNA,箭頭所指為目標條帶; (B):1, 1Bx17啟動子片段Note：M, DL2000 DNA marker；(A):1～2, Genomic DNA of wheat, Arrows point to the target band．(B):1, 1Bx17 promoter

2.2 pBx17-GUS和pBx17-GNK載體的構建

pBx17-GUS的構建：對重組質(zhì)粒做酶切鑒定，結果如圖2(A)所示。重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到3條明顯的條帶，其大小分別與酶切片段理論值5 531 bp、2 153 bp、1 676 bp大小一致。表明載體構建成功。

pBx17-GUS經(jīng)過SamI和SacI雙酶切，回收大片段，再與引入酶切位點的Gnk2-1基因閱讀框連接。對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，結果如圖2(B)所示，泳道1可以觀察到兩條電泳條帶，大小與載體片段(7 454 bp)和Gnk2-1基因片段(418 bp)大小一致。初步表明載體構建成功。進一步通過測序選擇讀碼框正確的克隆，命名為pBx17-GNK，用于后續(xù)小麥轉(zhuǎn)化。

圖2 pBx17-GUS(A)和pBx17-GNK(B)載體的酶切鑒定結果Fig.2 Enzyme analysis of plasmid pBx17-GUS and pBx17-GNK 注：(A)：M, DL 10 000 分子量標準；(A):1，pBx17-GUS表達載體經(jīng)過Hind III 和Sam I酶切后的電泳結果。(B)：M, DL 2 000 分子量標準；(B):1，pBx17-GNK經(jīng)過Sam I和Sac I雙酶切后的電泳結果Note：(A)：M, DL 10 000 DNA marker；1, Restriction enzyme analysis of pBx17-GUS by Hind III and Sam I．(B): M, DL 2 000 DNA marker；1, Restriction enzyme analysis of pBx17-GUS by Sam I and Sac I

2.3 1Bx17基因啟動子的瞬時表達

將質(zhì)粒pBx17-GUS通過基因槍法瞬時轉(zhuǎn)化小麥不同組織，染色結果顯示，轉(zhuǎn)化后的胚乳表面有明顯的藍色斑點(圖3(E))，說明GUS基因已經(jīng)導入了小麥胚乳細胞并獲得表達。與胚乳相比，小麥幼嫩根(圖3(A))、莖(圖3(B))、葉(圖3(C))、幼胚(圖3(D))、均沒有觀察到檢測到GUS的表達活性。表明小麥1Bx17基因啟動子具有胚乳表達特異性，可以驅(qū)動異源基因在小麥胚乳中專一表達。因此，若將小麥品質(zhì)相關的目標基因或者種仁抗菌蛋白基因融合在該啟動子下游，也將會在小麥種子中獲得特異性表達，這可能會進一步提高小麥的品質(zhì)或貯藏特性。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定

對4株能夠正常結實的再生抗性植株進行RT-PCR檢測。結果如圖4所示，3～6泳道可觀察到大小約為400 bp左右的電泳條帶，這與2泳道內(nèi)以質(zhì)粒pBx17-GNK為模板擴增得到的條帶大小一致。而未轉(zhuǎn)基因的野生型植株，檢測結果為陰性，說明目標基因Gnk2-1已整合入這4株植株基因組中并被轉(zhuǎn)錄。試驗結果初步表明我們已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。同時，也進一步驗證了1Bx17啟動子的胚乳表達活性。

圖3 1Bx17 promoter驅(qū)動下β-葡糖苷酸酶 (GUS)在小麥各組織中的瞬時表達結果Fig.3 The transient expression of the β-glucuronidase(GUS)gene in wheat endosperm 注：(A)：根，(B)：莖，(C)：葉，(D)：幼胚，(E)：胚乳Note：(A)：Root; (B)：Stem; (C)：Leaf; (D)：Immature embryo; (E)：Endosperm

圖4 轉(zhuǎn)基因抗性植株的RT-PCR鑒定Fig.4 RT-PCR analysis of transformed resistant plants 注：M,100 bp Ladder分子量標準；1，為負對照：未進行基因轉(zhuǎn)化的野生型植株；2，為正對照：pBx17-GNK質(zhì)粒；3-6，轉(zhuǎn)基因抗性再生植株Note：M: 100 bp Ladder marker; 1，Non-transformed control plant (negative control); 2, Plasmid pBx17-GNK (positive control); 3-6, RT-PCR analysis of transgenic plants

3 討論與結論

β-葡萄糖甘酶(GUS)因其組織染色檢測的便利性和在植物中表達的廣譜性，使其在啟動子結構與功能研究和轉(zhuǎn)基因標記等方面得到廣泛應用[17,18]。外源基因在受體中轉(zhuǎn)錄效率關鍵取決于啟動子的特性，適宜的啟動子對于外源基因的高效表達起重要作用。由于組織特異性啟動子和誘導型啟動子只在特定的環(huán)境或條件下啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄，可有效避免外源基因的組成型表達對植物本身造成的能量浪費和潛在傷害。因此，組織特異性啟動子或誘導型啟動子的開發(fā)和應用研究日益受到科研人員的重視[19]。

已有研究表明，HMW-GS1Bx17蛋白基因是在小麥胚乳中高表達的優(yōu)質(zhì)亞基基因，其表達特性很大程度上取決于啟動子[12,20]。因此，本試驗從小麥基因組DNA中分離和克隆了大小為1 627 bp的1Bx17基因啟動子序列。并將其與GUS基因融合，構建基因槍表達載體，分別導入小麥根、莖、葉、胚及胚乳組織中以驗證該啟動子的功能。試驗結果表明，GUS基因在胚乳中專一性表達，這說明該啟動子具有小麥胚乳組織表達特異性，可以驅(qū)動外源基因在小麥種子中表達。因此，1Bx17基因的啟動子在改良小麥品質(zhì)、貯藏特性等方面的基因工程研究中具有一定的應用潛力。

本文將實驗室之前獲得的銀杏種仁抗菌蛋白Gnk2-1基因與1Bx17胚乳特異啟動子融合，對小麥幼胚進行了遺傳轉(zhuǎn)化，通過對有4株正常結實的再生抗性植株進行RT-PCR檢測，初步表明目的基因已整合進入小麥基因組中并得到表達，同時也進一步證明了1Bx17啟動子的胚乳表達活性。文中轉(zhuǎn)基因植株的獲得也為進一步研究抗真菌蛋白Gnk2-1在小麥貯藏特性中的作用奠定了基礎。

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(編輯：韓志強)

Characterization of the promoter ofHMW-1Bx17 gene from wheat

Wang Yahong1,3, Liu Jin2*, Wang Yuguo3*

(1.DepartmentofMechanicalandElectricalEngineering,YunchengUniversity,Yuncheng044000,China; 2．DepartmentofLifeSciences,YunchengUniversity,Yuncheng044000,China; 3．CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]HMW-1Bx17 protein gene is one of the highly expressed genes in wheat endosperm. Promoter of 1Bx17 gene can provide the basic materials for further studying regulation model of wheat high molecular weight glutenin gene, and lay a foundation for genetic engineering research in wheat quality improvement.[Methods]The wheat “ShunMai 1718” genomic DNA was extracted based on the improved CTABmethod , and 1Bx17 promoter fragment was obtained by nested PCRmethod with genomic DNA as a template and the primers designed according to the known sequence. The expression plasmid containing GUS reporter gene driven by 1Bx17 promoter was successfully constructed, and used for transient expression assay in different tissues of wheat by particle bombardmentmethod . The expression vector containing antibacterial proteinGnk2-1 gene driven by 1Bx17 promoter was also constructed to stablely transform immature embryo of wheat for detecting the expression activity of the promoter further.[Result]X-gluc dying assay showed that the GUS gene driven by 1Bx17 promoter could be specifically expressed in wheat endosperm. The transgenic resistant plants obtained from experiment was detected by RT-PCR, theresult not only showed that we have obtained the transgenic plants, but also verify the function of the promoter further.[Conclusion]1Bx17 promoter has application potential in improvement of quality by plant genetic engineering.

Wheat, 1Bx17 gene, Promoter,Gnk2-1 gene, Transient expression

2017-04-19

2017-05-09

王亞紅(1981-)，女(漢)，陜西西安人，助教，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學

*通信作者：王玉國，教授，博士生導師，Tel:13835462639;E-mail: tgwygn@126.com；劉縉，講師，博士，Tel:15536274037;E-mail:liugene@163.com

運城學院博士啟動項目 (YQ-2011040)；運城學院產(chǎn)學研項目(XK-2015030)

S512.103.53; Q78

A

1671-8151(2017)07-0487-06