檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血清中長(zhǎng)鏈非編碼RNA-SchLAP1和DEK表達(dá)的臨床意義

劉東楠，張錦輝，夏榮鈞，王慧瑩，張娟，殷玉龍，尹銘旋，林黎娟

（遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院，遼寧丹東118003）

【醫(yī)藥與衛(wèi)生】

檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血清中長(zhǎng)鏈非編碼RNA-SchLAP1和DEK表達(dá)的臨床意義

劉東楠，張錦輝，夏榮鈞，王慧瑩，張娟，殷玉龍，尹銘旋，林黎娟*

（遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院，遼寧丹東118003）

為了研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA-SchLAP1在結(jié)直腸癌（CRC）患者血清中的表達(dá)及臨床意義，收集CRC患者血清標(biāo)本60例、健康人血清標(biāo)本20例，利用RT-PCR方法檢測(cè)SchLAP1和DEK的表達(dá)情況，分析二者與CRC患者臨床病理學(xué)參數(shù)及生存期的相關(guān)性。結(jié)果顯示，SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表達(dá)水平均明顯高于健康人群；SchLAP1高表達(dá)率與臨床分期明顯相關(guān)，而DEK高表達(dá)與組織分化程度及臨床分期明顯相關(guān)，兩種基因的高表達(dá)率經(jīng)Spearmans檢驗(yàn)具有明顯相關(guān)性；SchLAP1和DEK同時(shí)高表達(dá)的患者5年生存率和無(wú)瘤生存率明顯低于單獨(dú)一種表達(dá)或兩種均不表達(dá)者。因此，檢測(cè)血清中SchLAP1和DEK基因的表達(dá)對(duì)評(píng)估CRC預(yù)后均有一定的臨床意義，二者同時(shí)檢測(cè)時(shí)價(jià)值更明顯。

LncRNA；SchLAP1；DEK；結(jié)直腸癌；血清

我們的前期研究已經(jīng)表明，DEK高表達(dá)與包括人類結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)，可做為CRC的生物標(biāo)志物用于早期診斷和預(yù)后評(píng)估[1-3]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是位于胞核或胞漿的一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA的總稱，其表達(dá)受發(fā)育調(diào)控，具有組織和細(xì)胞特異性，近年來(lái)已成為腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)[4]。LncRNASchLAP1（Second Chromosome Locus Associated with Prostate-1）最早在前列腺癌患者中被發(fā)現(xiàn)呈過(guò)表達(dá)，可以做為病人預(yù)后不良（包括腫瘤的轉(zhuǎn)移和前列腺癌特異性死亡）的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)[5]。目前，CRC相關(guān)lncRNAs及SchLAP1的研究較少[6]，它們?cè)贑RC細(xì)胞惡性演進(jìn)過(guò)程中的作用需要研究者深入分析，尤其是對(duì)SchLAP1的進(jìn)一步探索將為CRC預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的生物標(biāo)記物。本研究旨在探討CRC患者血清中SchLAP1和DEK表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年1月~2011年7月丹東地區(qū)經(jīng)手術(shù)切除后病理學(xué)證實(shí)為CRC患者的術(shù)前血清標(biāo)本60例。所有病例均有嚴(yán)格的隨診資料，病理參數(shù)包括年齡、性別、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA水平及臨床分期等?；颊吣挲g為34～71歲，中位年齡為54歲，男女比例為42∶18；根據(jù)TNM和FIGO分期，35例為早期（Ⅰ-Ⅱ）、25例為晚期（Ⅲ－Ⅳ）；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第七版標(biāo)準(zhǔn)分類，15例高分化、45例為中或低分化。20位健康體檢人員的血清標(biāo)本也被納入，患者手術(shù)前均未接受放、化療。

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，80位入選者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR是由Bio-Rad序列檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)制造商的指示使用雙鏈DNA-specific SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司，日本），指示提取血清樣本的總RNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶引物合成第一鏈cDNA（TaKaRa公司，日本）和低聚糖（dT）。PCR反應(yīng)都是在20μL反應(yīng)物中，以94℃變性4 min開(kāi)始，進(jìn)行PCR擴(kuò)增23~36周期，94℃15 min和53~58℃30 sec，引物退火，并在72℃延長(zhǎng)10 min，用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。再用Champchemi專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（賽智公司，中國(guó)）和LANE 1D軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行量化（賽智公司，中國(guó)）。RT-PCR反應(yīng)重復(fù)三次。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。CRC患者血清中SchLAP1和DEK差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)；SchLAP1表達(dá)與CRC患者的臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

RT-PCR結(jié)果顯示，SchLAP1和DEK在CRC患者血清中的表達(dá)分別4.497±1.567和3.781±1.219，均明顯高于健康人（2.639±1.095和1.463±0.853）（P＜0.05）；SchLAP1在CRC血清中的高表達(dá)率為65.00%（39/60），其在晚期（Ⅲ～Ⅳ）患者血清中的高表達(dá)率明顯高于早期（Ⅰ～Ⅱ）患者（P＝0.041），而DEK在CRC中的高表達(dá)率為63.33%（38/60），其中分化程度中、低的患者和晚期的患者血清中高表達(dá)率明顯高于分化程度高及早期的患者（P值分別0.006和0.005）（見(jiàn)圖1和表1）。*P＜0.05,**P＜0.01

圖1 RT-PCR檢測(cè)兩種基因在20例健康人及60例結(jié)直腸癌患者血清標(biāo)本中的表達(dá)水平（P值均＜0.05）

表1 60例CRC患者血清中SchLAP1和DEK表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

續(xù)表160例CRC患者血清中SchLAP1和DEK表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.2 SchLAP1與DEK同時(shí)高表達(dá)對(duì)患者生存期的影響

Spearman檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種基因的高表達(dá)存在明顯相關(guān)性，P＝0.017（見(jiàn)表2）。

表2 Spearman檢驗(yàn)分析60例CRC患者血清中SchLAP1表達(dá)與DEK表達(dá)之間的關(guān)系

為了進(jìn)一步闡明SchLAP1與DEK同時(shí)高表達(dá)對(duì)CRC患者預(yù)后的影響，我們通過(guò)Kaplan-Meier方法進(jìn)行了生存期分析。60例CRC血清標(biāo)本中，兩種基因同時(shí)高表達(dá)患者的5年生存率及無(wú)瘤生存率均明顯低于單一基因高表達(dá)者和兩種基因同時(shí)低表達(dá)者（見(jiàn)圖2），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Kaplam-Meier生存分析曲線

由圖2 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，兩種基因同時(shí)高表達(dá)患者的生存率均明顯低于單一基因高表達(dá)者和兩種基因同時(shí)低表達(dá)。由圖2（A）可知：5年生存率，第1組與第2、3、4組相比P值分別為0.27、0.22和0.31；由圖2（B）可知：無(wú)瘤生存率，第1組與第2、3、4組相比P值分別為0.27、0.16和0.26。（第1組：SchLAP1與DEK同時(shí)高表達(dá)組，共29例；第2組：SchLAP1低表達(dá)而DEK高表達(dá)組，共9例；第3組：SchLAP1高表達(dá)而DEK低表達(dá)組，共10例；第4組：SchLAP1與DEK同時(shí)低表達(dá)組，共12例）。

3 討論

盡管有了手術(shù)切除及放、化療等較為先進(jìn)的治療手段和技術(shù)，CRC患者5年生存率和生活質(zhì)量仍未見(jiàn)明顯改善，尤其是晚期CRC。尋找能夠早期確診的生物標(biāo)志物、針對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展相關(guān)基因?qū)嵤┑闹委煷胧┦歉深A(yù)CRC腫瘤演進(jìn)、降低復(fù)發(fā)和死亡率的關(guān)鍵[1]。

隨著基因芯片和新一代高通量測(cè)序技術(shù)等的發(fā)展，lncRNA在轉(zhuǎn)錄組中的重要地位已測(cè)序明確。它們具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、染色質(zhì)修飾和細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)之間的運(yùn)輸?shù)榷喾N功能，在腫瘤形成、預(yù)后標(biāo)志物作用、治療模式風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等方面起著非常重要的作用[4]。因此，深入研究CRC相關(guān)lncRNAs的分子調(diào)控機(jī)制可以為早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供有效的生物標(biāo)志物和新的分子治療靶點(diǎn)，為臨床制定相應(yīng)的治療策略提供新思路。新興的LncRNA-SchLAP1被命名為與前列腺-1相關(guān)的第二個(gè)染色體基因座，也稱為L(zhǎng)INC00913，是腫瘤侵襲和血行轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)。通過(guò)體外及體內(nèi)功能獲得和功能缺失實(shí)驗(yàn)表明，SchLAP1對(duì)SWI/SNF染色質(zhì)修飾的基因組定位和調(diào)控產(chǎn)生抵抗，阻止了SWI/SNF復(fù)合物的抑癌功能、促進(jìn)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致致死性癌癥的發(fā)展[6]。通過(guò)擾亂SWI/SNF復(fù)合物，SchLAP1可導(dǎo)致成百上千的基因表達(dá)的改變，促進(jìn)了全面的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而并非通過(guò)單一的信號(hào)通路增加腫瘤的惡化風(fēng)險(xiǎn)。另外，SWI/SNF復(fù)合物與已知的腫瘤抑制基因和癌基因產(chǎn)物如RB、BRCA1、c-MYC和MLL之間也直接發(fā)生作用[7]。已有報(bào)導(dǎo)提出SWI/SNF核心元件BRG-1和催化亞單位BRMS1的缺陷可促進(jìn)結(jié)CRC的擴(kuò)散[8]，因此我們大膽預(yù)測(cè)SChLAP1也可能在CRC的演進(jìn)中起到一定的作用。該預(yù)測(cè)在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到證實(shí)，即SchLAP1的確在CRC患者血清中的表達(dá)明顯高于健康人，而且分期越晚的患者高表達(dá)率越高，而臨床分期是被公認(rèn)具有預(yù)后評(píng)估意義的臨床參數(shù)，說(shuō)明SChLAP1對(duì)CRC的預(yù)后評(píng)估有一定的意義。

癌基因DEK曾被我們前期研究證明在染色體重建、基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[1，3，9]。本次研究我們利用RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本中SchLAP1與DEK的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)一步推測(cè)SchLAP1對(duì)CRC病變演進(jìn)的影響，結(jié)果顯示，SchLAP1的表達(dá)水平與DEK明顯相關(guān)，且SchLAP1與DEK同時(shí)高表達(dá)的患者比DEK單獨(dú)高表達(dá)的患者生存期更為降低，說(shuō)明SchLAP1與DEK同時(shí)檢測(cè)對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估作用更強(qiáng)于單獨(dú)檢測(cè)DEK表達(dá)水平，也就間接說(shuō)明SchLAP1可以作為一個(gè)潛在標(biāo)志物起到對(duì)CRC預(yù)后評(píng)估以及治療靶標(biāo)的作用。

SchLAP1在CRC中高表達(dá)的作用機(jī)制尚不十分清楚。不排除其在腫瘤細(xì)胞中構(gòu)成了一個(gè)未被發(fā)現(xiàn)的信號(hào)通路，當(dāng)然，這種假設(shè)需要未來(lái)更多的研究來(lái)支持。

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（責(zé)任編輯：鞠衍清）

Clinical significance of detecting LncRNA-SchLAP1 and DEK in serum of patients with colorectal cancer

LIU Dong-nan，ZHANG Jin-hui,XIA Rong-jun，WANG Hui-ying，ZHANG Juan，YIN Yu-long，YIN Ming-xuan,LIN Li-juan

（School of Medicine，Eastern Liaoning University，Dandong 118003，China）

To study the expression and clinical significance of lncRNA-SchLAP1 in serum of patients with colorectal cancer(CRC)，the serum specimens of 60 patients with CRC and 20 healthy persons were selected. SchLAP1 and DEK expression were detected by RT-PCR method.Moreover，the correlation of the SchLAP1 and DEK with clinical pathology parameters and survival of patients were analyzed by statistical methods.The results showed that both of SchLAP1 and DEK overexpression in serum of CRCs were obviously higher than that of healthy persons.Additionally，the expression of SchLAP1 was obviously related with clinical stage of CRCs，and the expression of DEK was obviously related with differentiation and clinical stages of CRCs.By combination analysis,CRC with DEK overexpression concomitant with SchLAP1 overexpression had a significantly lower 5-year survival rate and disease-free survival rate than those without SchLAP1 overexpression.Therefore，detecting the expression of SchLAP1 and DEK in serum of CRC has certain clinical significance to evaluate prognosis.

LncRNA；SchLAP1；DEK；colorectal；prognosis

R393

A

1673-4939（2017）02-0120-05

10.14168/j.issn.1673-4939.2017.02.09

2016-12-01

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015020554）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2015189）；遼東學(xué)院省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（201611779048）

劉東楠（1994-），男，遼寧鐵嶺人，遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院本科生，研究方向：臨床護(hù)理。

*通訊作者：林黎娟（1968-），遼寧丹東人，博士，教授，研究方向：惡性腫瘤診斷及預(yù)后標(biāo)志物。