卵白蛋白肽的磷酸化改性工藝優(yōu)化

劉麗莉，李 玉，梁嚴(yán)予，李 丹，楊陳柳

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

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卵白蛋白肽的磷酸化改性工藝優(yōu)化

劉麗莉，李 玉，梁嚴(yán)予，李 丹，楊陳柳

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

在試驗(yàn)確定酶解制備卵白蛋白肽的最優(yōu)工藝條件基礎(chǔ)上，對(duì)酶解后雞蛋清卵白蛋白肽磷酸化改性工藝進(jìn)行了研究。以磷酸化程度為指標(biāo)，確定最佳磷酸鹽為三聚磷酸鈉。通過(guò)單因素和四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，研究了磷酸化工藝，確定最優(yōu)工藝條件組合為：反應(yīng)溫度30 ℃、pH值8.0、反應(yīng)時(shí)間4 h、三聚磷酸鈉添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))9%，在此條件下磷酸化程度可達(dá)到(57.27±1.68) mg/g。通過(guò)紫外光譜掃描，對(duì)磷酸化改性的卵白蛋白肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)變化分析。研究結(jié)果表明：磷酸化改性的卵白蛋白肽的紫外吸收峰發(fā)生了紅移，卵白蛋白分子的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)減少。由于磷酸基團(tuán)的嵌入，卵白蛋白肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使得磷酸化改性后的卵白蛋白肽的紫外最大吸收峰增強(qiáng)。

卵白蛋白肽；磷酸化；工藝優(yōu)化

0 引言

中國(guó)禽蛋深加工產(chǎn)品的品種單一，僅為鮮蛋總量的0.3%，而發(fā)達(dá)國(guó)家深加工蛋品為鮮蛋總量的20%，且蛋制品加工率很高[1]。由于鮮雞蛋在運(yùn)輸過(guò)程中易破碎、變質(zhì)，所以需要將新鮮的蛋清制備成蛋清粉[2]。隨著市場(chǎng)對(duì)蛋清粉需求量的增大，對(duì)蛋清粉功能和性質(zhì)的要求也越來(lái)越嚴(yán)格。目前，中國(guó)在專用蛋清粉的開(kāi)發(fā)方面一直未得到有效解決。因此，應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)蛋清粉的特性進(jìn)行改造并開(kāi)發(fā)出功能性的蛋清粉，對(duì)于拓展其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用將具有非常重要的意義。

目前，用于蛋白質(zhì)改性的方法很多。文獻(xiàn)[3]利用三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate，STP)對(duì)花生蛋白進(jìn)行磷酸化化學(xué)改性試驗(yàn)，當(dāng)STP添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為7.77%時(shí)，花生分離蛋白的持水性、乳化特性、吸油(水)性和泡沫穩(wěn)定性，比未改性的蛋白都有明顯地改善。文獻(xiàn)[4]在pH值為4.0、85 ℃的條件下，干燥加熱卵轉(zhuǎn)鐵蛋白1 d，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了0.91%，電泳遷移率也增加了，但溶解度略有下降；而改性后的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在pH值為7.0、70 ℃加熱10 min，磷酸化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白70%以上被溶解，磷酸鈣溶解能力增強(qiáng)，乳化性也有所改善。文獻(xiàn)[5]以雞蛋中卵白蛋白(ovalbumin，OVA)為對(duì)象，利用離子色譜法，簡(jiǎn)便、快捷地得到了雞蛋OVA的提取工藝路線，采用多種抗氧化活性試驗(yàn)，研究了雞蛋OVA酶解物的抗氧化活性，為全面開(kāi)發(fā)雞蛋的新型抗氧化肽產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。文獻(xiàn)[6]研究了殼寡糖的糖基化和交聯(lián)對(duì)大豆蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，證明了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)的殼寡糖的糖基化和交聯(lián)能夠?qū)Υ蠖沟鞍走M(jìn)行改性。

綜上所述，目前，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化的研究報(bào)道相對(duì)較多，但是針對(duì)卵白蛋白肽的磷酸化研究未見(jiàn)報(bào)道。磷酸化改性蛋白質(zhì)是為機(jī)體提供磷元素的一種有效、實(shí)用的方法，其作用主要是提高蛋白質(zhì)的溶解度和降低其等電點(diǎn)，從而達(dá)到改變其功能特性的目的。因此，本文以酶解后的卵白蛋白肽為反應(yīng)物，研究其磷酸化改性的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售鮮雞蛋，購(gòu)于洛陽(yáng)市丹尼斯超市；STP、焦磷酸鋅、鉻黑T、三氯乙酸均為分析純，購(gòu)于上海瀚思化工有限公司；氫氧化鉀(分析純)，購(gòu)于濟(jì)寧泰諾化工有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)，購(gòu)于天津市魯鑫化工科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉(分析純)，購(gòu)于鄭州新天和化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Labconco型真空冷凍干燥機(jī)，無(wú)錫凱派克斯科技有限公司；GL-36KT-A型超速冷凍離心機(jī)，深圳市三利化學(xué)品有限公司；UV-7500型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

OVA肽的制備：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的OVA溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.2，在52.5 ℃的水浴鍋中預(yù)熱10 min 后，加入5 500 U/g的堿性蛋白酶，酶解5 h。酶解反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物置于90 ℃的水浴鍋中5 min，使酶鈍化，冷卻至室溫，4 500 r/min離心，取上清液冷凍干燥，得到酶解后的OVA肽[7]。

磷酸化OVA肽的制備：取一定量的OVA肽溶于0.02 mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成0.01 g/mL的蛋白質(zhì)溶液。調(diào)節(jié)pH值至7.0～8.5，磷酸鹽添加量為3%～9%，磁力攪拌2.5～3.5 h，4 ℃蒸餾水透析48 h，檢測(cè)磷酸化程度，冷凍干燥備用。

針對(duì)STP、焦磷酸鈉、磷酸氫二鈉進(jìn)行初步篩選，通過(guò)單個(gè)磷酸化OVA肽試驗(yàn)，分析比較各磷酸鹽的磷酸化程度，篩選出最佳磷酸化的磷酸鹽。

分別考察反應(yīng)溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、反應(yīng)pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、反應(yīng)時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)和磷酸鹽添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%)對(duì)磷酸化程度的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(data processing system,DSP)軟件進(jìn)行四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)。以反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間和磷酸鹽添加量4個(gè)因素為自變量，磷酸化程度為指標(biāo)，設(shè)立了23個(gè)處理組，因素水平處理編碼見(jiàn)表1。

表1 因素水平處理編碼表

取一定量透析處理過(guò)的磷酸化改性后的OVA肽溶液，加入三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液使蛋白質(zhì)沉淀，5 000 r/min離心后，向上清液中加入1 mol/L的乙酸鋅2 mL，使其中的焦磷酸在pH值3.8～3.9條件下以Zn2P2O7形式沉淀。然后，將焦磷酸鋅溶于pH值為10的氨緩沖液，用鉻黑T作指示劑，用0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，當(dāng)溶液的顏色由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，即到達(dá)了滴定終點(diǎn)[8]。計(jì)算公式[9]為：

其中：C為乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1為滴定空白所需乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為滴定樣品所需乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；MP為磷的相對(duì)原子質(zhì)量，MP=30.97；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.4 紫外光譜測(cè)定

分別將OVA肽和磷酸化改性的OVA肽溶于50 mmol/L、pH值為7.4的Tris-HCl緩沖液中，配制成0.01 mg/mL蛋白溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)處對(duì)樣品進(jìn)行掃描[10]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用DPS V7.0專業(yè)版軟件和Design Expert 8.0軟件對(duì)正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)進(jìn)行分析，并作響應(yīng)曲面圖和等高線圖，其他結(jié)果通過(guò)Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸鹽的確定

按照以上試驗(yàn)方法針對(duì)3種磷酸鹽進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果表明：STP的磷酸化程度顯著優(yōu)于焦磷酸鈉和磷酸氫二鈉(P<0.05)。STP分子式為Na5P3O10，比焦磷酸鈉和磷酸氫二鈉多1～2個(gè)磷酸基團(tuán)，因此與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合概率較大，磷酸化程度也隨之變大。利用STP對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化改性，不僅可以改善蛋白質(zhì)的功能特性，而且還可以在不影響蛋白吸收的情況下，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。相關(guān)研究表明：STP改性蛋白質(zhì)是符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的，美國(guó)食品藥品管理局允許使用STP作為食品添加劑[11]。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值的確定

通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明：開(kāi)始時(shí)OVA肽的磷酸化程度隨反應(yīng)溫度升高而增大；在反應(yīng)溫度35 ℃左右，OVA肽的磷酸化程度達(dá)到最大值；隨后磷酸化程度開(kāi)始下降。因此，最佳磷酸化反應(yīng)溫度為35 ℃。

在其他反應(yīng)條件確定后，改變反應(yīng)pH值，開(kāi)始時(shí)OVA肽的磷酸化程度隨反應(yīng)pH值的升高而增大；在pH值達(dá)到9.0左右，OVA肽的磷酸化程度達(dá)到最高值；隨后磷酸化程度開(kāi)始下降。因此，最佳磷酸化反應(yīng)pH值為9.0。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間和STP添加量的確定

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，OVA肽的磷酸化程度也隨之增大；在反應(yīng)3 h左右，OVA肽的磷酸化程度達(dá)到最大值；隨后磷酸化程度基本保持不變。因此，最佳磷酸化反應(yīng)時(shí)間為3 h。

在其他反應(yīng)條件確定后，改變STP添加量，隨著STP添加量的增加，OVA肽的磷酸化程度也隨之增大；當(dāng)STP添加量達(dá)到9%時(shí)，繼續(xù)增加STP添加量，OVA肽的磷酸化程度基本保持不變。因此，選擇最佳STP添加量為9%。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸模型方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果

根據(jù)回歸模型方差分析可知：回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1=61.576 20(F0.05(6,5)=6.98)不顯著，所以認(rèn)為本次選用的二次回歸模型是合適的。此模型的決定系數(shù)R2=0.92，說(shuō)明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到高顯著水平(P<0.000 1)，表明該模型擬合結(jié)果好，能夠正確反映各因素與磷酸化程度的數(shù)量關(guān)系。經(jīng)方差分析(見(jiàn)表2)，采用DPS軟件對(duì)回歸試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，剔除不顯著項(xiàng)，得到的回歸方程如下：

Y= 58.286 74+9.535 95X2+5.017 44X3-7.050 00X1X3+

2.4 響應(yīng)面和等高線分析

為了使各因素對(duì)OVA肽磷酸化程度的影響能夠更加直觀地顯現(xiàn)出來(lái)，利用DPS軟件在P<0.01水平上，作出顯著項(xiàng)的兩因素交互影響OVA肽磷酸化程度的響應(yīng)面等高線圖，如圖1所示。根據(jù)圖1可對(duì)兩因素交互影響磷酸化程度進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，從中得出最佳因素水平。

圖1 兩因素交互影響OVA肽磷酸化程度的響應(yīng)面等高線

從圖1a中可以看出：反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間兩因素對(duì)磷酸化程度的影響呈拋物曲線形。隨著反應(yīng)溫度的上升，磷酸化程度呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)；隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，磷酸化程度也呈增加趨勢(shì)。等高線的密度大小可以反映出磷酸化程度變化的快慢，在溫度20 ℃，時(shí)間低于4 h，該區(qū)域內(nèi)兩因素稍微變化就會(huì)引起磷酸化程度的變化，等高線呈橢圓形[12]，表明反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)OVA肽磷酸化程度的交互作用顯著。

從圖1b中可以看出：反應(yīng)溫度和STP添加量對(duì)磷酸化程度的影響不同。等高線的密度大小可以反映出磷酸化程度變化的快慢，在反應(yīng)溫度低于30 ℃，STP添加量低于9%時(shí)，該區(qū)域內(nèi)兩因素稍微變化就會(huì)引起磷酸化程度的變化，等高線呈橢圓形，表明反應(yīng)溫度和STP添加量對(duì)OVA肽磷酸化程度的交互作用顯著。

2.5 確定最佳作用參數(shù)和模型驗(yàn)證試驗(yàn)

圖2 改性前后OVA肽的紫外光譜分析圖

采用DPS V7.5專業(yè)版軟件和Design Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，得到OVA肽的最佳磷酸化條件組合為：反應(yīng)溫度30 ℃、pH值為8.0、反應(yīng)時(shí)間4 h、STP添加量9%，可得到最高預(yù)測(cè)磷酸化程度為58.96 mg/g。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)所得的磷酸化程度平均為(57.27±1.68) mg/g，偏差絕對(duì)值小于3%，表明通過(guò)優(yōu)化的磷酸化條件可行。

2.6 磷酸化改性O(shè)VA肽的紫外光譜分析

紫外光譜是利用樣品分子對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的吸收程度，判定樣品的組成成分、結(jié)構(gòu)及含量。對(duì)改性前后的OVA肽進(jìn)行紫外光譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可看出：改性前后的OVA肽在280 nm附近都有強(qiáng)烈的吸收峰，這是由于OVA肽所特有的吸收峰一般在280 nm左右。由于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)殘基的側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)光的優(yōu)先吸收，以及苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)殘基的側(cè)鏈基團(tuán)和肽鍵對(duì)光的吸收，并且Trp和Tyr在波長(zhǎng)280 nm周?chē)幸粋€(gè)吸收峰，因此，蛋白質(zhì)能夠吸收一定波長(zhǎng)范圍的紫外光[13]。由于磷酸基團(tuán)的嵌入，OVA肽的結(jié)構(gòu)又發(fā)生了變化，使得磷酸化改性后的OVA肽的紫外最大吸收峰增強(qiáng)[14]。

3 結(jié)論

(1)單因素試驗(yàn)確定磷酸化改性條件：最佳磷酸鹽為STP。選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間和STP添加量為4個(gè)因素，以磷酸化程度為指標(biāo)，確定各因素最佳值為：反應(yīng)溫度35 ℃，pH值9.0，反應(yīng)時(shí)間 3 h，STP添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))9%。

(2)正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化磷酸化工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，以磷酸化程度為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面和回歸方程得到最佳工藝條件組合為：反應(yīng)溫度30 ℃、pH值8.0、反應(yīng)時(shí)間4 h、STP添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))9%，在此條件下預(yù)測(cè)磷酸化程度可達(dá)到58.96 mg/g。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得到指標(biāo)值為(57.27±1.68) mg/g，表明通過(guò)優(yōu)化的磷酸化條件可行。

(3)通過(guò)紫外光譜對(duì)OVA肽和磷酸化改性的OVA肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。磷酸化改性的OVA肽的紫外吸收峰發(fā)生了紅移，OVA分子的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)減少。由于磷酸基團(tuán)的嵌入，OVA肽的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，使得磷酸化改性后的OVA肽的紫外最大吸收峰增強(qiáng)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401622);河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)基金項(xiàng)目(152102110080);河南省教育廳自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(13A550255);河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目(2013ZCX012)

劉麗莉(1974-),女,河南商丘人,副教授,博士,主要研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工技術(shù).

2016-09-29

1672-6871(2017)03-0069-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.03.015

TS253.1

A