牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)土壤nirK、nirS型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

王 婷,劉麗麗,張克強(qiáng),王 風(fēng),杜會(huì)英,高文萱,3,*

1 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所, 天津 300191 2 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300387 3 天津大學(xué)化工學(xué)院,天津 300072

?

牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)土壤nirK、nirS型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

王 婷1,2,劉麗麗2,張克強(qiáng)1,王 風(fēng)1,杜會(huì)英1,高文萱1,3,*

1 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所, 天津 300191 2 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300387 3 天津大學(xué)化工學(xué)院,天津 300072

以徐水縣梁家營(yíng)長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)田為研究對(duì)象,利用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)分析和克隆文庫(kù)構(gòu)建,研究了5種施肥處理(清水灌溉CK、無(wú)機(jī)肥灌溉CF、牛場(chǎng)肥水不同濃度、不同次數(shù)灌溉T4、T5和T11)下土壤中nirK、nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的演變。結(jié)果表明,不同施肥處理下nirK、nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著差異,但群落結(jié)構(gòu)卻有明顯變化：nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)既受施肥種類又受施肥量影響,優(yōu)勢(shì)種群尤其對(duì)施肥種類和施肥量響應(yīng)顯著；nirS型反硝化細(xì)菌則主要受施肥種類影響,施肥量影響微弱。牛場(chǎng)肥水處理和無(wú)機(jī)肥處理分別促進(jìn)和抑制不同的nirS型反硝化細(xì)菌,群落主成分受無(wú)機(jī)肥促進(jìn)、牛場(chǎng)肥水抑制。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,土壤中nirK型反硝化細(xì)菌主要與假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和根瘤菌屬(Rhizobium)的反硝化細(xì)菌具有較近的親緣關(guān)系；nirS型反硝化細(xì)菌主要與勞爾氏菌(Ralstonia)和紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)有較近的親緣關(guān)系。試驗(yàn)土壤中反硝化微生物多與目前已報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌親緣關(guān)系較近,這可能與微生物分析取自表層土有關(guān)。

nirK；nirS；反硝化細(xì)菌；牛場(chǎng)肥水灌溉；T-RFLP；群落多樣性

反硝化過(guò)程與土壤氮素?fù)p失和溫室氣體排放密切相關(guān),是土壤研究中的重點(diǎn)問(wèn)題[1]。反硝化作用致使土壤喪失20%—30%的氮肥,是土壤肥力下降的重要原因[2]；反硝化作用還產(chǎn)生大量N2O,全球70%的N2O排放來(lái)自土壤[3],其中農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的排放量約占25%[4],是導(dǎo)致溫室作用的重要因素；因此,反硝化過(guò)程研究對(duì)于保持土壤肥力、減少溫室氣體排放具有重要意義。反硝化過(guò)程是土壤微生物還原硝態(tài)氮生成NO、N2O和 N2的過(guò)程,其中亞硝酸還原酶(Nir)催化亞硝酸鹽還原成NO,是催化反硝化作用中最關(guān)鍵的一步反應(yīng),是整個(gè)反硝化過(guò)程中的限速步驟[5],因而其編碼基因(nir)成為反硝化細(xì)菌中研究最多的功能基因[5],在反硝化研究中被廣泛用作分子標(biāo)記[6]。亞硝酸還原酶分為cd1-亞硝酸還原酶和Cu-亞硝酸還原酶兩種,分別由nirS和nirK基因編碼[6]。兩種基因在微生物中的分布存在差異,nirS基因在反硝化菌中的存在比nirK更廣泛,但nirK基因卻存在于許多親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株中[5]。

施肥是影響土壤質(zhì)量及其可持續(xù)利用最深刻的農(nóng)業(yè)措施之一,對(duì)土壤結(jié)構(gòu)、生物肥力和生產(chǎn)力等方面產(chǎn)生重要影響[7-9],施肥制度的不同也可導(dǎo)致土壤微生物種群數(shù)量和活性發(fā)生變化,進(jìn)而影響土壤反硝化過(guò)程[10]。Chang Yin等[11]研究發(fā)現(xiàn),施加無(wú)機(jī)肥顯著改變nirK型反硝化細(xì)菌的群落組成,而對(duì)nirS型反硝化細(xì)菌的群落組成影響不顯著；而施加有機(jī)肥則對(duì)兩者均無(wú)影響。宋亞娜等[12]發(fā)現(xiàn),施用氮肥和氮肥用量增加有助于提高稻田土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)和豐度,同時(shí)促使nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,尤其在表層土壤中及水稻齊穗期內(nèi)表現(xiàn)最為明顯。Wolsing和Prieme[13]通過(guò)長(zhǎng)期定位試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥的農(nóng)田中nirK型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和反硝化速率均有明顯差異。因此,當(dāng)施肥制度發(fā)生變化時(shí),有必要研究土壤微生物中nirK和nirS型反硝化細(xì)菌群落變化,進(jìn)而明確新的施肥制度對(duì)土壤反硝化過(guò)程的影響。

隨著集約化飼養(yǎng)程度的不斷提高、養(yǎng)殖污染問(wèn)題日益受到重視,將養(yǎng)殖廢物發(fā)酵產(chǎn)生的沼液作為一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)液體肥料,通過(guò)水肥還田替代傳統(tǒng)施肥方式,在很多國(guó)家和地區(qū)得到應(yīng)用和推廣[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)相比不施肥和常規(guī)施肥,沼液肥水灌溉不僅能夠提高作物質(zhì)量,還能夠提高土壤微生物活性[16-20]。如鄭學(xué)博等[16]發(fā)現(xiàn)沼液全氮處理較不施肥和單施化肥處理提高了土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量和微生物總量；馮偉等[17]研究發(fā)現(xiàn)沼液與尿素配合施用可以提高小麥根際土壤微生物數(shù)量和酶活性；馮丹妮等[18]研究發(fā)現(xiàn)與清水對(duì)照和常規(guī)施肥相比,施用沼液會(huì)增加微生物數(shù)量并提高土壤酶活性。然而目前對(duì)于液態(tài)牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)土壤反硝化過(guò)程以及反硝化土壤微生物的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用在河北省徐水縣長(zhǎng)期定位試驗(yàn),應(yīng)用末端限制性片段多態(tài)性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)和構(gòu)建克隆文庫(kù)方法,探明了按當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣施肥以及不同灌溉次數(shù)、不同濃度的牛場(chǎng)肥水灌溉的施肥方式下,冬小麥-夏玉米大田0—5 cm土層中nirS、nirK型反硝化細(xì)菌群落的多樣性和組成變化,為深入探討牛場(chǎng)肥水灌溉施肥對(duì)大田氮素循環(huán)過(guò)程及反硝化作用影響提供相應(yīng)依據(jù),并為大田合理施肥、提高牛場(chǎng)肥水灌溉效果提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

本實(shí)驗(yàn)以徐水縣梁家營(yíng)長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)田為研究對(duì)象。徐水縣地處太行山東麓,河北省中部,北緯38°09—39°09,東經(jīng)115°19—115°46,屬大陸性季風(fēng)氣侯,年平均氣溫11.9℃,年均降水量546.9毫米,年日照時(shí)數(shù)平均2744.9小時(shí)。試驗(yàn)于2010 年10 月至2014 年6月在河北省徐水縣進(jìn)行。冬小麥-夏玉米輪作是當(dāng)?shù)刂饕姆N植制度,冬小麥當(dāng)年10月上旬耕種,次年6月中旬收獲,冬小麥秸稈還田；夏玉米在小麥?zhǔn)斋@后一周內(nèi)耕種,當(dāng)年9 月底收獲,夏玉米秸稈人工收獲,作為青貯飼料喂養(yǎng)奶牛。試驗(yàn)地種植前耕層土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.5 g/kg、pH值7.76、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.39 g/kg、硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.09 mg/kg、銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.24 mg/kg、速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)64.19 mg/kg。

實(shí)驗(yàn)田每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)9m,寬6m,面積54m2,四周1m土體內(nèi)用塑料布隔開(kāi),種植方式為冬小麥-夏玉米輪作。共設(shè)5個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū),且小區(qū)之間隨機(jī)分布,CK處理為不施肥處理,僅用清水灌溉；CF處理為常規(guī)施肥處理,在播種后、拔節(jié)期分別施加底肥(冬小麥播種時(shí)施復(fù)合肥(N 含量15%,P2O5含量21%,K2O 含量6%)375 kg/hm2；冬小麥拔節(jié)期追肥尿素600 kg/hm2；玉米播種時(shí)施復(fù)合肥(N 含量25%,P2O5含量10%,K2O 含量10%)600 kg/hm2),其他生育期清水灌溉；T4、T5和T11為牛場(chǎng)肥水處理組,其中T4處理用30%的沼液灌溉1次(越冬期),T5處理用30%的沼液灌溉2次(越冬期、返青期),T11處理用50%的沼液灌溉兩次(越冬期、返青期),其他生育期均以清水灌溉。各處理的施肥方式、施肥時(shí)間和施肥成分見(jiàn)表1；肥水沼液原液成分見(jiàn)表2。

表1 各個(gè)處理施肥量

表2 灌溉肥水沼液原液成分

土壤樣品在小麥?zhǔn)崭詈?6月中旬)進(jìn)行采集,采用5點(diǎn)法采集土樣,每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5點(diǎn)采集0—5cm的表層土,去除根系、雜草、土壤動(dòng)物和石塊等雜質(zhì)后混勻,于-20℃冰箱保存。

1.2 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物總DNA的提取方法和步驟按照土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNAR SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)的說(shuō)明進(jìn)行。將提取的DNA用Nano Drop核酸蛋白儀(ND- 1000)測(cè)定濃度及質(zhì)量,于-20 ℃冰箱中保存。

1.3nirK、nirS型反硝化細(xì)菌 T-RFLP 分析

按照表3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行純化回收,并用Nano Drop核酸蛋白儀(ND- 1000)檢測(cè)純化產(chǎn)物濃度及質(zhì)量。產(chǎn)物回收后,nirK基因擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HaeⅢ(TaKaRa)進(jìn)行酶切,nirS基因擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HhaⅠ(TaKaRa)進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系和條件按各內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。酶切產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物及反應(yīng)條件

1) 上下游引物分別標(biāo)注為F和R; 2) 用于PCR T-RFLP實(shí)驗(yàn)的上游引物都用6-FAM熒光標(biāo)記

1.4nirK、nirS基因克隆及測(cè)序分析

以土壤基因組DNA為模板,按照表3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行純化,純化后的產(chǎn)物分別與pMD19R-T Vector載體進(jìn)行連接反應(yīng)。

將10 μL連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到100 μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中,涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白斑克隆子,用通用引物M13F(5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′,TaKaRa),M13R(5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′,TaKaRa)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,選取大約100個(gè)克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

綜合T-RFLP數(shù)據(jù),計(jì)算不同處理nirK、nirS型反硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)[14],并且用CANOCO for Windows 4.5軟件對(duì)nirK、nirS基因T-RFLP 結(jié)果進(jìn)行PCA分析。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建nirK、nirS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。相關(guān)數(shù)據(jù)的方差分析和相關(guān)性分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥對(duì)土壤nirK型反硝化細(xì)菌的影響

2.1.1 不同施肥處理下土壤nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖1 不同處理nirK型反硝化細(xì)菌T-RFs相對(duì)豐度百分比 Fig.1 Percentage of relative abundance of bacteria nirKT-RFs in different treatments (mean±SE,n=3)

圖2 不同施肥處理土壤nirK型反硝化細(xì)菌群落的主成分分析 Fig.2 Principal component analysis of soil denitrifying bacteria nirK under different fertilize treat

將不同處理土壤樣品的nirK功能基因擴(kuò)增后用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ酶切并進(jìn)行T-RFLP分析,得到55、65、95、100、105、110、125、155和190 bp 9種主要片段(圖1)。各處理間的優(yōu)勢(shì)片段存在明顯差異, CK、CF、T4、T5和T11處理的最大優(yōu)勢(shì)菌分別為155、110、95、105和155bp,說(shuō)明不同施肥種類、不同施肥量都導(dǎo)致nirK基因T-RFs結(jié)果產(chǎn)生顯著變化。

根據(jù)nirK基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(圖2)發(fā)現(xiàn),第1主成分PC1可以解釋46.8%的物種變量,第2主成分PC2可以解釋30%的物種變量。不同濃度的牛場(chǎng)肥水處理(T4、T5、T11)之間nirK型反硝化細(xì)菌主要種類具有明顯差異,T5處理主要分布在PC1的正軸,T4、T11則大部分分布在 PC1的負(fù)軸,說(shuō)明不同濃度的牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)土壤中nirK型反硝化細(xì)菌主要種類影響不同。同時(shí),CF處理分布在PC2的正軸而其余處理在PC2上相差不大,說(shuō)明施加無(wú)機(jī)肥使土壤中nirK型反硝化細(xì)菌次要種類有所增加,而牛場(chǎng)肥水灌溉則無(wú)明顯影響。

2.1.2 不同施肥處理下土壤nirK型反硝化細(xì)菌多樣性變化

利用nirK基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行序列多樣性分析(表4),發(fā)現(xiàn)所有處理組之間, Shannon-wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Margalef 指數(shù)和Pielou指數(shù)E都沒(méi)有顯著差異。

2.1.3nirK型反硝化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究選取所有處理nirK基因混合樣品構(gòu)建克隆文庫(kù),共挑選了120個(gè)克隆子測(cè)序并進(jìn)行NCBI網(wǎng)站的BLAST比對(duì)分析,剔除假陽(yáng)性克隆與重復(fù)數(shù)據(jù),結(jié)合酶切分型分析最終獲得了14個(gè)有代表性的操作分類單元。

表4 不同施肥處理土壤反硝化細(xì)菌nirK基因多樣性指數(shù)

圖3 基于nirK型反硝化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法)Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree of nirK gene sequences每個(gè)克隆名稱后面的數(shù)字表示酶切片段長(zhǎng)度,括號(hào)中的數(shù)字表示相同片段的克隆數(shù)

利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),依據(jù)序列在進(jìn)化樹(shù)上的分布和已知微生物的相似度,將進(jìn)化樹(shù)分為3簇。第Ⅰ簇片段包括55、65、130、155、170、190bp,與假單胞菌屬(Pseudomonas)和產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)有較高的分類值；第Ⅱ簇片段包括95、105、170、190bp,與根瘤菌屬(Rhizobium)有較高的分類值；第Ⅲ簇片段包括55、155和190bp,與根瘤菌屬(Rhizobium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的部分已知微生物相似。由于反硝化功能基因在不同微生物之間存在水平傳遞,所以反硝化菌nirK功能基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系和16S rRNA 分類對(duì)應(yīng)關(guān)系很差[21],存在相同片段長(zhǎng)度代表不同反硝化菌和不同片段長(zhǎng)度代表相同反硝化菌的情況。

2.2 施肥對(duì)nirS型反硝化細(xì)菌的影響

2.2.1 不同施肥處理下土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

將不同處理土壤樣品的nirS功能基因擴(kuò)增后用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ酶切,主要得到70、100、110、120、160、172、327和336 bp 8種片段(圖4),其中172bp為CK、T4、T5和T11處理的最大優(yōu)勢(shì)菌,120bp為CF處理最大優(yōu)勢(shì)菌。

圖4 不同處理nirS型反硝化細(xì)菌T-RFs相對(duì)豐度百分比 Fig.4 Percentage of relative abundance of bacteria nirS T-RFs in different treatments (mean±SE,n=3)

70、100、120和172bp片段百分比含量受施肥影響顯著,說(shuō)明這四種T-RFs所代表的反硝化菌群可能對(duì)施肥條件敏感。其中172bp在牛場(chǎng)肥水灌溉處理組(T4、T5和T11)中豐度較CF和CK顯著提高,而120bp表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。這兩種T-RFs都是nirS群落中的主要菌群,二者可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,牛場(chǎng)肥水灌溉有利于172bp菌群生長(zhǎng)而不利于120bp菌群生長(zhǎng),而常規(guī)施肥(CF)具有相反影響。70bp和100bp片段豐度雖然出現(xiàn)顯著變化,但是在各處理組間并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。

圖5 不同施肥處理土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落的主成分分析 Fig.5 Principal component analysis of of soil denitrifying bacteria nirS under different fertilize treat

根據(jù)nirS基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(圖5)發(fā)現(xiàn),第1主成分PC1可以解釋81.7%的物種變量,第2主成分PC2可以解釋10.1%的物種變量；牛場(chǎng)肥水灌溉處理(T4、T5、T11)與無(wú)機(jī)肥處理組(CF)的nirS型反硝化細(xì)菌主要種類PC1存在明顯差異,無(wú)機(jī)肥處理組(CF)主要分布在PC1的正軸,牛場(chǎng)肥水處理組全部則分布在PC1的負(fù)軸,說(shuō)明nirS型反硝化細(xì)菌主要種類(PC1)受施肥種類影響明顯,牛場(chǎng)肥水處理大幅降低了主要成分所占比例而無(wú)機(jī)肥處理使主要成分比例提高；與清水灌溉相比,所有施肥處理均降低了nirS型反硝化細(xì)菌次要種類(PC2)所占比例,其中高施肥量處理(CF、T11)降低最明顯,說(shuō)明nirS型反硝化細(xì)菌次要種類(PC2)主要受施肥量影響,高施肥量使其比例降低。但由于第2主成分僅能解釋10.1%的物種變量,遠(yuǎn)低于第1主成分(81.7%),所以施肥量對(duì)nirS型反硝化細(xì)菌總體貢獻(xiàn)微弱。

2.2.2 不同施肥處理下土壤nirS型反硝化細(xì)菌多樣性變化

利用nirS基因T-RFs相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行序列多樣性分析(表5),發(fā)現(xiàn)清水灌溉組(CK)的Shannon-wiener指數(shù)(不顯著)和Simpson指數(shù)(顯著)略高于施肥處理組,而施肥處理組之間各指數(shù)均無(wú)顯著差異,說(shuō)明施肥處理可能使nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性有所降低,而各施肥組之間多樣性無(wú)顯著差別。

2.2.3nirS型反硝化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究選取所有處理nirS基因混合樣品構(gòu)建克隆文庫(kù),共挑選了110個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序分析,剔除假陽(yáng)性克隆和重復(fù)數(shù)據(jù),最終獲得了27個(gè)有代表性的操作分類單元。

表5 不同施肥處理土壤反硝化細(xì)菌nirS基因多樣性指數(shù)

圖6 基于nirS序化化細(xì)列的反硝菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法)Fig.6 Neighbour-joining phylogenetic tree of nirS gene sequences每個(gè)克隆名稱后面的數(shù)字表示酶切片段長(zhǎng)度,括號(hào)中的數(shù)字表示相同片段的克隆數(shù)

實(shí)驗(yàn)得到的大多數(shù)nirS序列和已知的反硝化微生物相似性較低,但和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自土壤的其它nirS序列有較高的相似性(73%—99%)。利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6),依據(jù)序列在進(jìn)化樹(shù)上的分布和部分已知微生物的相似度,將進(jìn)化樹(shù)分為5簇?？寺⌒蛄兄饕蟹植荚诘冖?、Ⅲ簇,其中第Ⅰ簇與副球菌屬(Paracoccus)有較高的相似度,包括T-RFs 70 、120 、160、172、180、190 、203 、244p、313 和335 bp片段；第Ⅲ簇與β-變形菌綱(β-Proteobacteria)的伯克氏菌目(Burkholderiales)的Ralstonia和Rubrivivaxgelatinosus有較高的相似度,包括T-RFs 70 、100 、160和172 bp片段。第Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ簇沒(méi)有相似的已知物種。

3 討論

影響土壤反硝化作用的因素主要有溫度、pH、水分、含氧量、碳氮類型和碳氮比以及土壤質(zhì)地、土壤利用和耕作方式等[22]。在本研究中,各試驗(yàn)田的光照、土壤、作物、種植方式、灌溉方式均相同,即去除溫度、水分、含氧量、土壤質(zhì)地和耕作方式的影響,不同施肥方式通過(guò)pH、碳氮類型和碳氮量對(duì)反硝化微生物產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)的土壤樣品取自0—5cm的表層土,氧氣含量高,利于好氧反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)土壤中nirK型反硝化細(xì)菌主要與假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、根瘤菌屬(Rhizobium)的反硝化細(xì)菌具有較近的親緣關(guān)系。nirS型反硝化細(xì)菌主要與副球菌屬(Paracoccus)、伯克氏菌目(Burkholderiales)反硝化細(xì)菌具有較近的親緣關(guān)系；這些反硝化微生物多與目前已報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌親緣關(guān)系較近。

大量研究表明,nirK型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥敏感,不同的施肥條件會(huì)對(duì)nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。例如羅希茜等[23]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期單施化肥(尿素)即可明顯改變nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成；Wolsing[13]、Chen[24]、以及Martin Wolsing[25]等人均發(fā)現(xiàn)施加無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥對(duì)nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演變?cè)斐娠@著差異?？梢?jiàn)有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥的施用對(duì)nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。這與本研究中CK、CF以及不同水平牛場(chǎng)肥水處理組(T4、T5和T11)造成nirK基因T-RFs顯著變化的結(jié)果相一致。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),T4、T5和T11之間nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異也顯著,說(shuō)明即使是相同施肥種類,不同的施肥量也會(huì)導(dǎo)致nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化；但CF、T4、T5、T11和CK之間群落變化不具有規(guī)律性,這一點(diǎn)也體現(xiàn)在PCA分析中,各處理點(diǎn)呈現(xiàn)隨機(jī)分布的趨勢(shì)。這種nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨施肥的種類和施肥量呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律顯著變化的現(xiàn)象,說(shuō)明nirK型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類、施肥量都十分敏感,施肥條件小幅改變都可能造成群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著變化。另外,本研究發(fā)現(xiàn)所有處理在四種多樣性指數(shù)上都無(wú)顯著差異,說(shuō)明施肥條件改變不會(huì)對(duì)nirK型反硝化細(xì)菌群落多樣性造成影響,這與羅希茜[23]等人的發(fā)現(xiàn)一致。

有研究表明,nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響顯著,如莫旭華等[26]發(fā)現(xiàn),不同類型的反硝化細(xì)菌對(duì)無(wú)機(jī)氮肥的反應(yīng)不同而導(dǎo)致了nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)改變,但未改變nirS型反硝化細(xì)菌的多樣性；尹昌等[27]研究發(fā)現(xiàn),黑土中nirS型反硝化菌種群的群落結(jié)構(gòu)和豐度對(duì)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥有顯著的響應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)nirS型反硝化菌種群對(duì)環(huán)境的變化不敏感,如Yoshida等[28]發(fā)現(xiàn),在水稻土中nirS型反硝化菌對(duì)環(huán)境變化不敏感；Chang Yin等[11]發(fā)現(xiàn),我國(guó)南方水稻土中nirS型反硝化菌的群落結(jié)構(gòu)對(duì)施加無(wú)機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥處理處理均沒(méi)有顯著的響應(yīng)。根據(jù)上述研究,nirS型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥響應(yīng)存在一定矛盾,推測(cè)可能與土壤條件、作物種類有關(guān),nirS不敏感的研究都是以水稻為研究對(duì)象,再如羅希茜等[23]也發(fā)現(xiàn)水稻土nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)氮肥施加不敏感。本研究以冬小麥-夏玉米輪作田為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)施肥種類會(huì)對(duì)nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響,這與莫旭華等[26]和尹昌等[27]研究發(fā)現(xiàn)相符。此外,本研究發(fā)現(xiàn)牛場(chǎng)肥水灌溉條件下,不同施肥量(T4、T5和T11)之間群落結(jié)構(gòu)變化不大。因此推測(cè),nirS型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類有一定敏感性,而對(duì)不同牛場(chǎng)肥水施肥量在實(shí)驗(yàn)條件下不敏感。

4 結(jié)論

本文采用T-RFLP技術(shù),系統(tǒng)研究不施肥、無(wú)機(jī)肥和不同水平牛場(chǎng)肥水處理對(duì)nirK、nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明：

(1)實(shí)驗(yàn)條件下,不同施肥條件使nir型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變：nirK型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類、施肥量都十分敏感；而nirS型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥種類有一定敏感性,對(duì)不同牛場(chǎng)肥水施肥量不敏感。

(2)實(shí)驗(yàn)條件下,不同施肥條件對(duì)nirK和nirS型反硝化細(xì)菌群落多樣性造成的影響無(wú)顯著性差異。

(3)本試驗(yàn)土壤中nirK和nirS型反硝化細(xì)菌主要與好氧反硝化細(xì)菌親緣關(guān)系較近。

[1] 黃樹(shù)輝, 呂軍. 農(nóng)田土壤N2O排放研究進(jìn)展. 土壤通報(bào), 2004, 35(4): 516- 522.

[2] Firestone M K. Biological.denitrification. In: Nitrogen in Agricultural Soils. F.J. Stevenson, Agronomy Monograph 22, American Society of Agronomy, 1982, 289-326.

[3] Conrad R. Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4, OCS, N2O, and NO).MicrobiologyReviews, 1996, 60: 609- 640.

[4] Mosier A R, Duxbury J M, Freney J R, Heinemeyer O, Minami K. Assessing and mitigating N2O emissions from agriculture soils.ClimaticChange, 1998, 40: 7- 38.

[5] Braker G, Zhou J, Wu L, Devol A H, Tiedje J M. Nitrite reductase genes(nirKandnirS)as functional markers to investigate diversity of denitrifying bacteria in Pacific northwest marine sediment communities.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2000, 66(5): 2096- 2014.

[6] R?sch C, Mergel A, Bothe H. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2002, 68(8): 3818- 3829.

[7] Carpenter-Boggs L, Kennedy A C, Reganold J P. Organic and biodynamic management: Effects on soil biology.SoilScienceSocietyofAmericaJournal, 2000, 64: 1651- 1659.

[8] Li J, Zhao B Q, Li X Y, Jiang R B, So H B. Effects of long-term combined application of organic and mineral fertilizer on microbial biomass, soil enzyme activities and soil fertility.AgricultureSciencesinChina, 2008, 7(3): 336- 343.

[9] 王海濤, 鄭天凌, 楊小茹. 土壤反硝化的分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展及其影響因素. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 32(10):1915- 1924.

[10] 劉若萱, 賀紀(jì)正, 張麗梅. 稻田土壤不同水分條件下硝化/反硝化作用及其功能微生物的變化特征. 環(huán)境科學(xué), 2014, 35(11): 4275- 4283.

[11] Yin C, Fan F, Song A, Li Z, Yu W, Liang Y. Different denitrification potential of aquic brown soil in Northeast China under inorganic and organic fertilization accompanied by distinct changes ofnirS- andnirK-denitrifying bacterial community.EuropeanJournalofSoilBiology, 2014, 47- 56.

[12] 宋亞娜, 林智敏, 林艷. 氮肥對(duì)稻田土壤反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 20(1): 7- 12.

[13] Wolsing M, Prieme A. Observation of high seasonal variation in community structure of denitrifying bacteria in arable soil receiving artificial fertilizer and cattle manure by determining T-RFLP ofnirgene fragment.FEMSMicrobiologyEcology, 2004, 8: 261- 271.

[14] Liu J, Wang W, Zhang Y, Jiang N. A strategy for sustainable livestock husbandry wastewater treatment in China.InternationalJournalofEnvironmentandPollution, 2011, 45(1/3): 157- 165.

[15] 唐華, 郭彥軍, 李智燕. 沼液灌溉對(duì)黑麥草生長(zhǎng)及土壤性質(zhì)的影響. 草地學(xué)報(bào), 2011, 19(6): 939- 942.

[16] 鄭學(xué)博, 樊劍波, 何園球, 崔鍵, 徐磊, 祝振球, 周靜. 沼液化肥全氮配比對(duì)土壤微生物及酶活性的影響. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2015,31(19):142- 150.

[17] 馮偉,管濤,王曉宇,朱云集,郭天財(cái). 沼液與化肥配施對(duì)冬小麥根際土壤微生物數(shù)量和酶活性的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 04:1007- 1012.

[18] 馮丹妮, 伍鈞, 楊剛, 張璘瑋, 張乙涵, 王靜雯. 連續(xù)定位施用沼液對(duì)水旱輪作耕層土壤微生物區(qū)系及酶活性的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 33(8): 1644- 1651.

[19] Braker G, Fesefeldt A, Witzel K P. Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes(nirKandnirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples.AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 1998, 64(10): 3769- 3775.

[20] Hill T C J, Walsh K A, Harris J A, Moffett B F. Using ecological diversity measures with bacterial communities.FEMSMicrobiologyEcology, 2003, 43: 1- 11.

[21] 宋亞娜, 吳明基, 林艷. 稻田土壤nirS型反硝化細(xì)菌群落對(duì)氮肥水平的響應(yīng). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(9):1818- 1826.

[22] 劉秋麗, 馬娟娟, 孫西歡, 李京玲. 土壤的硝化-反硝化作用因素研究進(jìn)展. 農(nóng)業(yè)工程, 2011, 1(4): 79- 83.

[23] 羅希茜, 陳哲, 胡榮桂, 吳敏娜, 秦紅靈, 魏文學(xué). 長(zhǎng)期施用氮肥對(duì)水稻土亞硝酸還原酶基因多樣性的影響. 環(huán)境科學(xué), 2010, 31(2): 423- 430.

[24] Chen Z, Luo X Q, Hu R G, et al. Impact of long-term fertilization on the composition of denitrifier communities based on nitrite reductase analyses in a paddy soil.MicrobialEcology, 2010, 60(4): 850- 861.

[25] Martin Wolsing, Anders Priemé. Observation of high seasonal variation in community structure of denitrifying bacteria in arable soil receiving artificial fertilizer and cattle manure by determining T-RFLP of nir gene fragments.FEMSMicrobiologyEcology, 2006,48(2): 261- 271.

[26] Iribar A, Hallin S, Miguel J, Garabétian F. Potential denitrification rates are spatially linked to colonization patterns ofnosZgenotypes in an alluvial wetland.EcologicalEngineering, 2015, 191- 197.

[27] 尹昌, 范分良, 李兆君, 宋阿琳, 朱平, 彭暢, 梁永超. 長(zhǎng)期施用有機(jī)和無(wú)機(jī)肥對(duì)黑nirS型反硝化菌種群結(jié)構(gòu)和豐度的影響. 環(huán)境科學(xué), 2012, 11: 3967- 3975.

[28] Yoshida M,Ishii S, Otsuka S, Senoo K.nirK-harboring denitrifiersare more responsive to denitrification-inducing conditions in rice paddy soil thannirS-harboring bacteria.MicrobesandEnvironments, 2010, 25(1): 45- 48.

[29] 沈仕洲, 王風(fēng), 薛長(zhǎng)亮, 張克強(qiáng). 沼液灌溉對(duì)冬麥田CO2、N2O排放及土壤因子的影響. 節(jié)水灌溉, 2015, 7: 25- 31.

[30] 杜會(huì)英, 馮潔, 郭海剛, 王風(fēng), 趙君怡, 張克強(qiáng). 麥季牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)冬小麥-夏玉米輪作土壤氮素平衡的影響. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2015, 31, (3): 159- 165.

Effects of cattle fertilizer on community structure ofnirK- andnirS- type denitrifying bacteria in soil

WANG Ting1,2, LIU Lili2, ZHANG Keqiang1, WANG Feng1, DU Huiying1, GAO Wenxuan1,3,*

1Agro-EnvironmentalProtectionInstitute,MinistryofAgriculture,Tianjin300191,China2TianjinNormalUniversity,collegeofLifeSciences,Tianjin300387,China3TianjinUniversity,SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,Tianjin300072,China

Field experiments of winter wheat-summer maize rotation were conducted in Xushui, Hebei Province, North China Plain irrigation area, to explore the effects of dairy effluent irrigation on diversity and community structure ofnirK- andnirS- type denitrifying bacteria through terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis and gene sequence analysis. Five treatments were designed, including no fertilizers treatment (CK), conventional fertilization (CF) and dairy effluent irrigations with 3 fertilizer levels (T4, T5 and T11). The results showed that no significantly differences were noted in diversity indexes ofnirK- andnirS- denitrifying bacteria in all treatments. And T-RFLP analysis ofnirKandnirSgenes addressed significant differences in community composition: both fertilizer type and amount affected the relative abundance ofnirK- T-RFs significantly, especially for dominant T-RFs, and therefore affectednirK- community composition; organic and inorganic fertilizer treatments increased or decreased differentnirS- T-RFs′ relative abundance, resulting in significant differences innirS- community composition. Phylogenetic analysis ofnirKandnirSgene indicated that thenirK- type denitrifiers were mainly composed ofPseudomonas,AlcaligeneandandRhizobium,nirS- type denitrifiers were mainly composed ofRalstoniaandRubrivivax. Most of these identified denitrifying bacteria were belong to families of aerobic denitrifying bacteria. A possible reason was that samples for biological analysis were taken from topsoil.

nirK;nirS; denitrifying bacteria; cattle fertilizer; terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP); community structure

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41371481)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD15B02)

2016- 04- 18; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2017- 02- 22

10.5846/stxb201604180714

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wenxuangao@hotmail.com

王婷,劉麗麗,張克強(qiáng),王風(fēng),杜會(huì)英,高文萱.牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)土壤nirK、nirS型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(11):3655- 3664.

Wang T, Liu L L, Zhang K Q, Wang F, Du H Y, Gao W X.Effects of cattle fertilizer on community structure ofnirK- andnirS- type denitrifying bacteria in soil.Acta Ecologica Sinica,2017,37(11):3655- 3664.