左乙拉西坦對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的影響

吳建坤，牛爭(zhēng)平

左乙拉西坦對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的影響

吳建坤1，牛爭(zhēng)平2

目的 觀察左乙拉西坦(LEV)對(duì)硝酸甘油所致偏頭痛大鼠行為學(xué)及對(duì)高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的影響，探討左乙拉西坦對(duì)偏頭痛的防治作用以及可能的作用機(jī)制。方法 將24只健康雄性SD大鼠普通喂養(yǎng)1周，采用分層隨機(jī)法，將其分成假模型組(6只)和模型組(18只)。制作實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，造模成功后再將模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(6只)、LEV低劑量干預(yù)組(6只)及LEV高劑量干預(yù)組(6只)。各組按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別給予生理鹽水及LEV不同劑量灌胃。造模成功后觀察大鼠在行為學(xué)方面的改變。30 min作為一個(gè)觀察時(shí)間單元，采取持續(xù)時(shí)間分段計(jì)數(shù)的方式觀察90 min內(nèi)各個(gè)時(shí)間段的大鼠撓頭、爬籠和甩頭的次數(shù)。復(fù)制偏頭痛模型3 h后，給予腹腔注射麻醉，進(jìn)行甲醛灌注，取頸髓1-2。用免疫組化方法對(duì)谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)染色，然后用光學(xué)顯微鏡觀察谷氨酸和GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，并在同側(cè)脊髓后角部位隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，依次記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 行為學(xué)變化：與假模型組對(duì)照，其余各組大鼠的撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)均呈現(xiàn)明顯增加(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，LEV干預(yù)組大鼠撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)均隨著給藥劑量的升高而降低。谷氨酸和GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)：與假模型組比較，其余各組的谷氨酸免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P<0.05)，GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，LEV低、高劑量干預(yù)組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0.05)，GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P<0.05)，且呈劑量依賴性。結(jié)論 LEV可以改善偏頭痛大鼠在行為學(xué)方面的變化，能使高頸髓谷氨酸能中間神經(jīng)元的表達(dá)降低，GABA能中間神經(jīng)元的表達(dá)增強(qiáng)，且呈劑量依賴性,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)頸髓中間神經(jīng)元“興奮-抑制”穩(wěn)態(tài)的平衡有關(guān)。

偏頭痛；左乙拉西坦；中間神經(jīng)元；谷氨酸；γ-氨基丁酸

左乙拉西坦(levetiracetam,LEV,商品名：開(kāi)浦蘭)為吡拉西坦類藥物，主要用于治療癲癇，并且有較好的臨床效果。目前已有大量研究指出左乙拉西坦可用于治療偏頭痛、雙向心境障礙及神經(jīng)痛[1]。Krusz首次發(fā)現(xiàn)左乙拉西坦在防治偏頭痛方面有一定的療效，但其詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。

偏頭痛屬于原發(fā)性頭痛疾病，臨床常為反復(fù)發(fā)作的、搏動(dòng)性的頭痛，多呈單側(cè)，常伴惡心和嘔吐，部分病人發(fā)作前可有視覺(jué)、感覺(jué)障礙等先兆。慢性偏頭痛給個(gè)人及社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的生活和心理負(fù)擔(dān)，但其潛在的機(jī)制尚不完全清楚[2]。有些偏頭痛病人在臨床上訴有頸部肌肉的僵硬、痙攣或者疼痛等[3]，這些癥狀甚至先于頭痛的發(fā)生，因此處理偏頭痛病人的頸部癥狀已成為臨床需求。然而，目前很少有把此兩者相結(jié)合研究的報(bào)道。

顱內(nèi)硬腦膜初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的激活、脊髓傷害感受性神經(jīng)元的興奮性增高及敏化為偏頭痛發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這種脊髓傷害感受性神經(jīng)元的高反應(yīng)性稱為“中樞敏化”[4]。中樞敏化在偏頭痛的發(fā)作中起著重要作用，有研究顯示頭痛可使頸部肌肉產(chǎn)生異常的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，三叉神經(jīng)-頸反射(trigeminocervical reflex，TCR)[5]所產(chǎn)生的改變即探究了三叉神經(jīng)頸復(fù)合體的傷害性信息傳遞，為疼痛的中樞機(jī)制提供了組織解剖基礎(chǔ)，也揭示了疼痛信息在周?chē)c中樞之間的轉(zhuǎn)化可能傳導(dǎo)通路和機(jī)制。對(duì)于脊髓水平中樞敏化，有文獻(xiàn)報(bào)道其可能的機(jī)制為中間神經(jīng)元的改變[6]。中間神經(jīng)元包括興奮性中間神經(jīng)元和抑制性中間神經(jīng)元，分別以谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma amino acid butyric acid，GABA)為代表發(fā)揮效應(yīng)，并把感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元聯(lián)系在一起。有研究證實(shí)，GABA與疼痛信息的處理有關(guān)，GABA能中間神經(jīng)元產(chǎn)生的抑制性信號(hào)傳入障礙可導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性升高[7]。

對(duì)于偏頭痛與中間神經(jīng)元間的聯(lián)系，目前有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出偏頭痛大鼠頸髓興奮性谷氨酸能中間神經(jīng)元表達(dá)增強(qiáng)，抑制性GABA能中間神經(jīng)元表達(dá)減弱[3]，LEV可使癲癇小鼠海馬區(qū)的GABA能神經(jīng)元內(nèi)在特性及編碼能力增強(qiáng)[8]，但LEV對(duì)偏頭痛大鼠中間神經(jīng)元是否有影響，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究LEV對(duì)偏頭痛大鼠高頸髓中間神經(jīng)元的影響，探討其對(duì)偏頭痛防治作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重250 g～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。維持室溫22 ℃，相對(duì)濕度50%，壓強(qiáng)梯度30 Pa，自然光照節(jié)律，普通飲食。

1.2 藥品和試劑 兔抗GABA抗體，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；兔多克隆抗體to L Glutamate(abcam9440)、SABC試劑盒、DAB顯色劑，由博士德生物工程有限公司提供；硝酸甘油注射液(每支5 mg)由河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20057216，產(chǎn)品批號(hào)：1604202)；LEV(0.5 g/片)由UCB Pharma S.A.(比利時(shí))生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：H20110410，產(chǎn)品批號(hào)：137713)，按照成年人每天1000 mg為低劑量，2 000 mg為高劑量，根據(jù)人和大鼠的等效劑量換算，計(jì)算大鼠LEV用藥量，用生理鹽水配成LEV溶液(低劑量為100 mg/kg，高劑量為200 mg/kg)備用；4%多聚甲醛固定液，博士德生物工程有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：11K17B68；10%水合氯醛溶液：100 mL生理鹽水加入10 g水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20151010)，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。

1.3 動(dòng)物造模給藥 將24只健康雄性SD大鼠普通喂養(yǎng)1周后，采用分層隨機(jī)法，將其分成假模型組(6只)和模型組(18只)，參照文獻(xiàn)方法[9-10]，假模型組大鼠于頭頸背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg，模型組大鼠于皮下注射硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg，完畢時(shí)輕柔背部，防止出現(xiàn)血腫塊，再將模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(6只)、LEV低劑量干預(yù)組(6只)及LEV高劑量干預(yù)組(6只)。假模型組大鼠給予生理鹽水2mL/kg灌胃，1次/日，連續(xù)7 d。于末次灌胃后1 h進(jìn)行皮下注射生理鹽水2 mL/kg。模型對(duì)照大鼠給予生理鹽水2 mL/k g灌胃，1次/日，連續(xù)7 d。于末次灌胃后1 h進(jìn)行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。LEV低劑量干預(yù)組大鼠給予LEV 100 m g/kg灌胃，1次/日，連續(xù)7 d。于末次灌胃后1 h進(jìn)行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。LEV高劑量干預(yù)組大鼠給予LEV 200 mg/kg灌胃，1次/日，連續(xù)7 d。于末次灌胃后1 h進(jìn)行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。

1.4 大鼠行為學(xué)檢測(cè) 造模成功以后用攝像機(jī)拍攝大鼠隨后90 min的行為表現(xiàn)，每30 min作為一觀察時(shí)間單位，采取持續(xù)時(shí)間分段計(jì)數(shù)的方式觀察各個(gè)時(shí)間段內(nèi)大鼠撓頭、爬籠和甩頭的情況并記錄次數(shù)。

1.5 大鼠灌注固定和標(biāo)本準(zhǔn)備 復(fù)制偏頭痛大鼠模型3 h后，所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，仰臥位固定。開(kāi)胸、暴露心臟，通過(guò)心尖部插管至主動(dòng)脈，將250 mL生理鹽水沿左心室插管處勻速注入，當(dāng)心臟膨大時(shí)剪開(kāi)右心耳，可見(jiàn)血液流出，待流出的液體變淡，成清亮后更換為4%多聚甲醛，先快速注入50 mL，可見(jiàn)大鼠四肢抽搐，隨后放慢速度，共注入250 mL多聚甲醛，大鼠肝臟變?yōu)榛野住３浞止潭ê笕〈笫蠛笳芯€暴露脊柱，咬骨鉗輕輕去除棘突，用蚊式止血鉗將椎骨輕輕掰開(kāi)，暴露脊髓，用蚊式鑷提起一端，用蚊式剪將兩側(cè)的脊神經(jīng)剪斷，取頸髓1-2，浸入固定液中保存。對(duì)頸髓組織行石蠟切片，厚度3 μm一張，每塊組織切4張，貼于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，60 ℃烤片2 h備用。

1.6 病理切片常規(guī)HE染色 先行常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行免疫組化染色。

1.7 圖像定量分析 在同側(cè)脊髓后角隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，相同背景下采圖，觀察免疫陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)，記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)變化 觀察大鼠各個(gè)時(shí)間段行為學(xué)指標(biāo)(撓頭、爬籠、甩頭)的變化，發(fā)現(xiàn)假模型組大鼠起先30 min內(nèi)的爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)明顯多于本組其他時(shí)間段，可能與皮下注射引起的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。與假模型組比較，其余各組大鼠的撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)于注射硝酸甘油后各時(shí)間段均呈明顯增加(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，LEV干預(yù)組大鼠撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)均隨著給藥劑量的升高而降低，其中在30 min時(shí)間段，LEV低、高劑量干預(yù)組大鼠的撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)和甩頭次數(shù)均有明顯差異(P<0.05)；在60 min時(shí)間段，LEV低劑量干預(yù)組大鼠的撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)、甩頭次數(shù)及LEV高劑量干預(yù)組的大鼠撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LEV高劑量干預(yù)組的大鼠甩頭次數(shù)沒(méi)有明顯差異(P>0.05)；在90 min時(shí)間段，LEV低劑量干預(yù)組的大鼠撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)及LEV高劑量干預(yù)組的大鼠撓頭次數(shù)有明顯差異(P<0.05)，而LEV低劑量干預(yù)組的大鼠甩頭次數(shù)及LEV高劑量干預(yù)組的大鼠爬籠次數(shù)、甩頭次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1～3。

表1 各時(shí)間段大鼠撓頭次數(shù)的變化(±s) 次

表2 不同時(shí)間段大鼠爬籠次數(shù)的變化(±s) 次

表3 不同時(shí)間段大鼠甩頭次數(shù)的變化(±s) 次

2.2 大鼠頸髓中間神經(jīng)元的變化 鏡下可見(jiàn)谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿呈棕褐色，周?chē)?，胞體呈錐體形、圓形或橢圓形，有一個(gè)或多個(gè)突起，主要分布在脊髓后角。與假模型組比，其余各組的谷氨酸免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P<0.05)，與模型對(duì)照組比較，LEV低、高劑量干預(yù)組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見(jiàn)表4。γ-氨基丁酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為黃褐色，類圓形或卵圓形，核染為主，以后角分布為著。與假模型組比較，其余各組的GABA免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P<0.05)，與模型對(duì)照組比較，LEV低、高劑量干預(yù)組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見(jiàn)表5。

表4 大鼠頸髓谷氨酸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較(±s) 次

表5 大鼠頸髓GABA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較(±s) 次

3 討 論

目前，關(guān)于偏頭痛發(fā)生的機(jī)制更傾向于三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)。包括外周疼痛感受器對(duì)化學(xué)刺激產(chǎn)生的激活和敏化，反復(fù)持續(xù)的刺激所導(dǎo)致的脊髓后角神經(jīng)元的超敏反應(yīng)，隨后接連發(fā)生的中樞敏化及相關(guān)腦網(wǎng)絡(luò)異常[11-12]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在固有的疼痛調(diào)節(jié)通路，末梢感受器將疼痛信號(hào)傳入到脊髓二級(jí)神經(jīng)元、三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體，而三叉神經(jīng)頸復(fù)合體作為中樞疼痛調(diào)節(jié)通路中的重要環(huán)節(jié)，有研究顯示，反應(yīng)其傳導(dǎo)通路的三叉神經(jīng)-頸反射和瞬目反射(BR)在偏頭痛病人中出現(xiàn)了電生理變化，如潛伏期延長(zhǎng)、波幅降低等改變[6]。中間神經(jīng)元連接著感覺(jué)神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，介導(dǎo)信號(hào)的傳入和傳出，有研究指出運(yùn)動(dòng)指令可能通過(guò)中間神經(jīng)元進(jìn)行傳遞[13]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，興奮性遞質(zhì)以Glu為代表，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)與以GABA為代表，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，與感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)密切相關(guān)，當(dāng)這種“興奮-抑制”穩(wěn)態(tài)失衡，對(duì)傷害性信息傳遞的抑制作用減弱時(shí)，會(huì)提高中樞神經(jīng)的興奮性。最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在偏頭痛大鼠模型中，大鼠頸髓1-2前角ChAT和C-Fos蛋白表達(dá)量均增多，Glu能神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，GABA能神經(jīng)元抑制性減弱，說(shuō)明頸髓1-2前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)生了激活現(xiàn)象，這一結(jié)果可能與偏頭痛病人的頸部肌肉癥狀相符合，進(jìn)一步證明了中間神經(jīng)元介入了偏頭痛過(guò)程，“興奮-抑制”平衡破壞，功能紊亂，成為導(dǎo)致感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)功能異常的一種機(jī)制[3]。Grilllner[14]研究證實(shí)，在脊髓中Glu能神經(jīng)元可通過(guò)互相激活，從而使整個(gè)興奮性中間神經(jīng)元被激活。Li 等[15]發(fā)現(xiàn)，Glu的異樣轉(zhuǎn)運(yùn)可對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形成選擇性的傷害。選擇性基因敲除GABA合成酶Gad2表達(dá)的中間神經(jīng)元可影響肌肉活動(dòng)，而增加GABA、運(yùn)用GABA受體激動(dòng)劑能緩解肢體痙攣癥狀[16-17]。

LEV已廣泛用于成人及兒童的癲癇部分性發(fā)作和繼發(fā)全面性發(fā)作的治療，而且對(duì)難治性部分性發(fā)作有很好的療效。近年來(lái)有大量報(bào)道指出LEV對(duì)偏頭痛的防治有良好的效果。Pizza等[18]對(duì)老年性偏頭痛病人給予LEV進(jìn)行防治，結(jié)果顯示其頭痛發(fā)作的次數(shù)減少，耐受性也較好。LEV可使每月偏頭痛發(fā)作的次數(shù)明顯減少，其發(fā)作次數(shù)降低50%以上的病人百分比為64%，而安慰劑組為22%。王維等[19]發(fā)現(xiàn)不管單用LEV還是聯(lián)合用藥，治療12周時(shí)均可使偏頭痛的發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時(shí)間和疼痛程度降低，不良反應(yīng)較少，病人耐受性較好，且聯(lián)合用藥的效果更顯著。

有關(guān)LEV防治偏頭痛的研究大多為臨床觀察，而闡述其作用機(jī)制的卻很少。在LEV治療癲癇方面，倪紅等[8]發(fā)現(xiàn)LEV組干預(yù)后癲癇小鼠海馬區(qū)GABA能神經(jīng)元內(nèi)在特性和編碼能力增強(qiáng)，而目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的變化[3]。

本實(shí)驗(yàn)以LEV為干預(yù)藥物，通過(guò)免疫組化的方法，觀察硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的變化。結(jié)果顯示，與模型組大鼠比較，LEV低、高劑量干預(yù)組大鼠的撓頭次數(shù)、爬籠次數(shù)及甩頭次數(shù)均明顯減少，谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯降低，GABA免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯升高，提示谷氨酸和GABA在偏頭痛發(fā)作中的作用可能是通過(guò)下調(diào)脊髓興奮性Glu的釋放，減少NMDA受體和GABA受體的磷酸化，使興奮性NMDA受體功能下調(diào)，抑制性GABA能神經(jīng)元的作用增強(qiáng)[20]。此外，PKC(與中樞敏化相關(guān)的蛋白激酶C)還可使環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)以及激活轉(zhuǎn)錄因子-2(AFT-2)磷酸化，調(diào)節(jié)c-Fos和C-Jun的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)一步引起脊髓中間抑制性神經(jīng)元的凋亡[21]。因此，在偏頭痛傷害性信息傳遞過(guò)程中，內(nèi)源性抑制作用被阻斷，而脊髓神經(jīng)元的興奮性升高。

綜上所述，對(duì)于硝酸甘油所誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型，其高頸髓部位的谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元之間的穩(wěn)態(tài)失衡，興奮功能上調(diào)，抑制作用下降，這可能為偏頭痛中樞機(jī)制提供了理論擴(kuò)充，而LEV可能是通過(guò)調(diào)節(jié)頸髓中間神經(jīng)元“興奮-抑制”穩(wěn)態(tài)的平衡來(lái)改善偏頭痛大鼠頭痛癥狀的。本實(shí)驗(yàn)仍需要補(bǔ)充頸髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化及實(shí)驗(yàn)對(duì)象的電生理檢查，進(jìn)一步研究LEV對(duì)中間神經(jīng)元影響的具體機(jī)制。

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(本文編輯王雅潔)

國(guó)家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目(No.2013-544)

1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

牛爭(zhēng)平，E-mail:nzp105@sina.com

信息：吳建坤，牛爭(zhēng)平.左乙拉西坦對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經(jīng)元的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1456-1460.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.010

1672-1349(2017)12-1456-05

2017-05-06)