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    柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠能量代謝的影響

    2017-07-19 11:45:59騫秀芳胡常菊張國斌
    武警醫(yī)學 2017年7期
    關(guān)鍵詞:柚皮素預處理活力

    騫秀芳,郭 喆,胡常菊,劉 丹,張國斌

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    柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠能量代謝的影響

    騫秀芳1,郭 喆1,胡常菊1,劉 丹1,張國斌2

    目的 探討柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠能量代謝的影響。方法 將大鼠隨機分為5組(n=10):假手術(shù)組、模型組,柚皮素分為三個劑量組(100、50、25 mg/kg),于建立模型前7 d開始腹腔注射給藥,通過結(jié)扎冠脈30 min再灌注2 h建立心肌缺血/再灌注損傷模型;再灌注結(jié)束后,采用比色法測定血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性,采用定磷法測定心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力,采用染色法測定心肌梗死面積(myocardial infarction surface, MIS)。結(jié)果 柚皮素高劑量組MIS縮小至32.91%,與模型組MIS(39.78%)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);柚皮素各劑量組CK活性分別降低為658.03、650.12、621.89 U/L,與模型組(809.45 U/L)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);各劑量組LDH活性分別降低為1543.08、1506.27、1326.97 U/L,與模型組(2034.56 U/L)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P< 0.01);柚皮素各劑量組可顯著升高Na+/K+-ATP酶活力為6.82、6.83、6.94 mmol Pi/(g·h),與模型組[5.54 mmol Pi/(g·h)]比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高、中劑量組可顯著升高,Ca2+/Mg2+-ATP酶活力為8.42、8.97 mmol Pi/(g·h),與模型組[7.06 mmol Pi/(g·h)]比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注所致心肌損傷的保護作用可能與改善心肌組織的能量代謝有關(guān)。

    柚皮素;心肌缺血/再灌注損傷;大鼠;能量代謝

    柚皮素(naringenin)主要存在于枳實、菝葜、化橘紅等植物中,屬類黃酮類化合物。柚皮素具有多種生物學活性,目前已有報道的如降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等[1, 2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),柚皮素對實驗動物的心肌細胞損傷具有保護作用[3-5]。本研究應用心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion)損傷大鼠模型,探討柚皮素保護心肌的作用機制是否與能量代謝有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品和試劑 柚皮素(純度98%)購自Sigma公司,試驗前用1% DMSO配制所需濃度。肌酸激酶(CK)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

    1.2 實驗動物 SD大鼠,雌雄各半,體重180~220 g,購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心,合格證號:SCXK(冀)2008-1-003。

    1.3 方法

    1.3.1 建立心肌缺血/再灌注大鼠模型 采用冠脈結(jié)扎術(shù),參照文獻[6]方法進行。簡言之,將麻醉后的大鼠仰位固定,四肢連接十二導聯(lián)心電圖機(日本光電工業(yè)株式會社產(chǎn)品,型號ECG-1350P)。頸部做氣管插管,連接小動物人工呼吸機(安徽正華生物儀器設備有限公司,型號DW-3000),設為呼吸頻率60次/min,潮氣量20 ml/kg。于胸骨左旁第3肋和第4肋間開胸,用絲線撐開肋骨,暴露心臟,沿左心耳下緣冠脈前降支起始部約4 mm處用帶線縫合針進針,深度控制在約1 mm,將一小段直徑1.5 mm的乳膠管置于縫合線下,之后結(jié)扎縫合線致大鼠心肌缺血。缺血30 min左右觀察到心電圖ST段明顯抬高或T波高聳后,松開縫合線再灌注2 h(觀察到心電圖抬高的ST段下降1/2以上或高聳的T波下降,視為再灌注成功)。

    1.3.2 分組與給藥 將大鼠隨機分為:假手術(shù)組(等體積溶媒)、模型組(等體積溶媒)、柚皮素高劑量組(100 mg/kg)、柚皮素中劑量組(50 mg/kg)、柚皮素低劑量組(25 mg/kg),于術(shù)前7 d開始腹腔注射給藥,每天1次。假手術(shù)組10只大鼠僅開胸不結(jié)扎冠脈,其他各組則每組均抽取術(shù)后成模大鼠10只進行后續(xù)試驗。

    1.3.3 測定血清心肌酶活性 再灌注結(jié)束后,動物經(jīng)腹主動脈采血,常規(guī)2500 r/min離心10 min分離血清,采用比色法分別于紫外/可見分光光度計(日本島津公司,型號UV-2550)660 nm和440 nm下測定OD值,并計算CK、LDH活性,嚴格按試劑盒說明書操作。

    1.3.4 測定心肌ATP酶活力 采血后,各組取部分心臟,生理鹽水洗凈血跡,用組織勻漿機(德國IKA集團,型號T10)制成勻漿,3500 r/min離心10 min得上清。采用定磷法于紫外/可見分光光度計660 nm下測定OD值,并計算ATP酶活力;心肌勻漿上清液的蛋白濃度采用考馬斯亮藍法定量,嚴格按試劑盒說明書操作,酶活力單位[mmol Pi(g·h)]以每小時每克組織蛋白產(chǎn)生的無機磷(Pi)含量表示。

    1.3.5 測定心肌梗死面積(MIS) 各組取心臟,用生理鹽水洗后,去除血管、脂肪及心房組織,從冠脈結(jié)扎線下方至心尖處將心室平行切成厚度相等的5片,置于0.1% NBT溶液中,37 ℃染色15 min。以數(shù)碼相機采集圖像(正常心肌呈藍色,梗死心肌則呈灰白色),采用Image Pro Plus 7.0軟件測算心室總面積和梗死區(qū)面積,并計算MIS(%)[7]。

    2 結(jié) 果

    2.1 MIS情況 模型組動物MIS達39.78%,柚皮素預處理可縮小MIS,其中高劑量組的MIS縮小至32.91%,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術(shù)組因未出現(xiàn)心肌梗死,MIS未納入統(tǒng)計學比較(圖1)。

    圖1 柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠MIS影響 與模型組比較,①P<0.05

    2.2 心肌酶活性情況 假手術(shù)組動物血清CK、LDH活性分別為179.30、596.90 U/L,模型組動物血清CK、LDH活性顯著升高,與假手術(shù)組比較組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);柚皮素預處理低、中、高劑量組CK、LDH活性,與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。

    圖2 柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷 大鼠血清CK和LDH活性影響

    與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05,③P<0.01

    2.3 ATP酶活力情況 假手術(shù)組動物心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力分別為7.26、9.23 mmol Pi/(g·h),模型組動物心肌組織Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力分別顯著降低為5.54、7.06 mmol Pi/(g·h),與假手術(shù)組比較組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);柚皮素預處理可不同程度地影響ATP酶活力,與模型組比較,高、中劑量組可升高Ca2+/Mg2+-ATP酶活力(P<0.05),高、中、低劑量組可升高Na+/K+-ATP酶活力,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3)。

    圖3 柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷 大鼠心肌組織ATP酶活力比較 與假手術(shù)組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05

    3 討 論

    采用藥物預處理的方式可促使機體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活機體自身保護機制,進而增強心肌缺血/再灌注損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受,實現(xiàn)心肌保護作用[8]。本研究觀察了柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用,結(jié)果顯示柚皮素通過預處理給藥能顯著縮小心肌梗死面積,這與梅繁勃等[5]的報道結(jié)果一致。

    當心肌缺血/再灌注發(fā)生導致心肌細胞膜受損時,心肌細胞中的蛋白酶CK和LDH外漏增加,其釋放入血的量與心肌壞死程度呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示,模型組動物血清CK和LDH活性顯著升高,反映出心肌缺血/再灌注心肌細胞損傷的程度;柚皮素預處理可顯著降低血清CK和LDH活性,提示柚皮素可通過提高細胞膜的穩(wěn)定性而保護受損的心肌組織。

    能量代謝是心肌細胞活動的物質(zhì)基礎,目前認為能量代謝障礙是心肌缺血/再灌注損傷的始動環(huán)節(jié)和損傷進一步加重的原因之一[10],ATP酶活力則可反映細胞的能量水平,在缺血性心臟病的研究中受到重視。心肌缺血/再灌注發(fā)生時,線粒體受損,ATP生成減少,使心肌細胞膜和肌漿網(wǎng)上Na+/K+-ATP酶活力降低,導致心肌細胞內(nèi)Na+濃度升高和酸中毒,通過Na+-H+交換使細胞內(nèi)Na+進一步增多,Na+超負荷會激活細胞膜上的Na+-Ca2+交換蛋白,使Ca2+內(nèi)流增多;同時肌漿網(wǎng)上Ca2+/Mg2+-ATP酶活力降低,胞內(nèi)Ca2+攝取減少造成細胞內(nèi)外Ca2+和Mg2+分布失衡,更加重了細胞內(nèi)鈣超載[11]。鈣超載則會觸發(fā)一系列的細胞損傷機制如加重線粒體損傷進而加重心肌細胞的能量缺乏,激活磷脂酶使細胞膜結(jié)構(gòu)受損,激活蛋白水解酶進而引起遲發(fā)性細胞死亡等[12]。本研究結(jié)果顯示,心肌缺血30 min再灌注2 h后,心肌組織中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力顯著降低,說明此時心肌出現(xiàn)能量代謝障礙,細胞功能受抑;柚皮素預處理則可明顯提高心肌組織中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力,進而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外離子平衡尤其是Ca2+穩(wěn)態(tài),改善心肌組織的能量代謝障礙。

    綜上所述,柚皮素預處理對心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護作用是通過保護細胞膜ATP酶活力、改善能量代謝等途徑實現(xiàn)的;至于柚皮素具體作用于能量代謝的哪個環(huán)節(jié),尚需進一步研究。

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    (2017-01-09收稿 2017-03-08修回)

    (責任編輯 武建虎)

    Effect of naringenin on energy metabolism in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury

    QIAN Xiufang1, GUO Zhe1, HU Changju1, LIU Dan1,and ZHANG Guobin2.

    1.Department of Pharmacy, the Second Hospital of Beijing Municipal Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100027, China; 2. Pharmacy College, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

    Objective To investigate the effect of naringenin on energy metabolism in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury.Methods SD rats were divided randomly into sham group, model group, naringenin low dose group (25 mg/kg), naringenin medium dose group (50 mg/kg) and naringenin high dose group (100 mg/kg) (n=10). Naringenin was intraperitoneally injected once a day for 7 days before the modeling operation. A myocardial ischemia/reperfusion injury model was established by coronary artery ligation (30 min) and subsequent reperfusion (2 hours) in rats. After the modeling operation, the CK and LDH activities in sera were examined by chromatometry, Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase activities in brain tissues were detected by phosphorus method and the myocardial infarction size (MIS) was determined by staining method.Results A high dose of naringenin significantly reduced MIS to 32.91% compared to 39.78% of model group (P<0.05). The CK activities in naringenin groups were 658.03, 650.12 and 621.89 U/L, respectively, which were significantly lower than 809.45 U/L of model group (P<0.05 orP<0.01). Naringenin significantly reduced LDH activities to 1543.08, 1506.27 and 1326.97 U/L, respectively, compared to 2034.56 U/L of model group (P<0.05 orP<0.01). Naringenin evidently increased Na+/K+-ATPase activities to 6.82, 6.83 and 6.94 mmol Pi/(g·h), respectively, compared to 5.54 mmol Pi/(g·h) of model group (P<0.05). Naringenin (100 and 50 mg/kg) significantly increased Ca2+/Mg2+-ATPase activities to 8.42 and 8.97 mmol Pi/(g·h), respectively, compared to 7.06 mmol Pi/(g·h) of model group (P<0.05).Conclusions The protective effects of naringenin pretreatment in myocardial ischemia/reperfusion injury seems to be associated with the improvement of energy metabolism.

    naringenin; myocardial ischemia/reperfusion injury; rat; energy metabolism

    國家自然科學基金(81102870)

    騫秀芳,本科學歷,主管藥師。

    1.100027,武警北京總隊第二醫(yī)院藥劑科;2.450046 鄭州,河南中醫(yī)藥大學藥學院

    張國斌,E-mail: zgb@hactcm.edu.cn

    R285.5

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