高效液相色譜法測(cè)定庫爾勒香梨幼果中的4種內(nèi)源激素

張占暢，孫志紅，鄭小能，劉懷鋒，

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，新疆石河子832000;2.兵團(tuán)第二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆庫爾勒841503; 3.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

高效液相色譜法測(cè)定庫爾勒香梨幼果中的4種內(nèi)源激素

張占暢1，孫志紅2，鄭小能3，劉懷鋒1，3

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，新疆石河子832000;2.兵團(tuán)第二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆庫爾勒841503; 3.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

【目的】建立高效液相色譜法(HPLC)，用于同時(shí)分離和測(cè)定庫爾勒香梨幼果中的玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、生長素(IAA)和脫落酸(ABA)4種植物內(nèi)源激素。【方法】經(jīng)過條件篩選和優(yōu)化，選用80%甲醇作為樣品提取試劑。經(jīng)過石油醚脫色，PVPP吸附雜質(zhì)和乙酸乙酯萃取，再經(jīng)Sep－Pak C18小柱純化。采用SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫40℃，流速為1 mL/ min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水(pH=3.5)，流動(dòng)相比例為:45%(A)與55% (B)。檢測(cè)器波長為254 nm。【結(jié)果】建立了玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸的高效液相色譜分析方法。運(yùn)用該方法測(cè)得加標(biāo)回收率達(dá)80.4%～91.2%，相對(duì)偏差在1.54%～8.1%，分離效果理想，實(shí)驗(yàn)效果穩(wěn)定可靠?！窘Y(jié)論】該方法前處理方法簡便，分析速度快，具有較高的重現(xiàn)性和精確性。適用于香梨幼果中內(nèi)源激素玉米素、赤霉素、生長素和脫落酸的測(cè)定分析。

庫爾勒香梨;高效液相色譜法;幼果;內(nèi)源激素

0 引言

【研究意義】植物激素是植物正常代謝的產(chǎn)物，是在植物體內(nèi)合成的，并能從產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)移到作用部位，在低濃度下就能調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的有機(jī)物質(zhì)［1］。植物內(nèi)源激素包括赤霉素、生長素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯及油菜素內(nèi)脂等六大類，對(duì)植物的生長、發(fā)育、成熟及衰老等生理過程有著顯著的支配作用，并使植物各器官間互通信息，互相協(xié)調(diào)，從而使整株植物的生長發(fā)育進(jìn)程一致［2，3］。因此，分析香梨花期幼果內(nèi)源激素含量的變化，對(duì)于研究香梨脫萼及提高品質(zhì)等具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值［4］。【前人研究進(jìn)展】目前，植物內(nèi)源激素含量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及放射免疫法(RIA)，由于后兩種對(duì)于激素的提純精度較低以及可重復(fù)性較差等問題［5－7］。而高效液相色譜法具有靈敏度高，分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，而且具備同時(shí)檢測(cè)多種植物激素的特點(diǎn)，因此采用高效液相色譜法作為檢測(cè)方法［8，9］。由于內(nèi)源激素在幼果中含量較低，種類較多，分離時(shí)易被破壞，而且檢測(cè)條件各異［10，11］。因此篩選合適的提取方法和優(yōu)化HPLC的檢測(cè)方法是試驗(yàn)的關(guān)鍵［12］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于香梨幼果的激素提取，檢測(cè)方法較少，而使用HPLC法檢測(cè)庫爾勒香梨內(nèi)源激素含量更是鮮有報(bào)道。研究從提取方法，色譜條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，而對(duì)香梨幼果中ZT、GA3、IAA、ABA 4種內(nèi)源激素含量同時(shí)進(jìn)行分離與測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立一種分析香梨幼果內(nèi)源激素的可靠方法，而為研究庫爾勒香梨生長與調(diào)節(jié)庫爾勒香梨品質(zhì)等提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

液相色譜為島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀(日本島津)，包括四元梯度泵、紫外檢測(cè)器、HPLC 2D工作站。流動(dòng)相用KQ－100VDE型超聲波清洗儀脫氣。研磨后的樣品用HITACHI CR22GⅢ冷凍離心機(jī)離心。離心后取上清液，用RE－2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。

玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，甲醇、乙酸為色譜級(jí)，乙酸乙酯，鹽酸、磷酸氫二鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。所有試劑使用前均通過0.45 μm微孔濾膜過濾。

試驗(yàn)所選材料為新疆庫爾勒地區(qū)第二師29團(tuán)園三連的香梨，于2016年4月26日采取香梨幼果，用錫箔紙包好，置于液氮中速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，放入－76℃低溫冰箱保存待測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 樣品測(cè)定

樣品前處理按照參考文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)和優(yōu)化［13，14］。準(zhǔn)確稱取2 g冷藏的香梨幼果，加入10 mL預(yù)冷的80%甲醇研磨成勻漿，置于4℃冰箱靜置后離心取上清液，重復(fù)三次合并全部上清液，將全部上清液旋蒸至原體積的三分之一，加入石油醚脫色，再加入0.1 g PVPP震蕩后過濾。將濾液用乙酸乙酯萃取并在35℃下減壓蒸干，殘留物加2 mL乙酸溶解后過Sep－Pak C18小柱純化，用甲醇洗脫后減壓蒸干，用80%甲醇溶解并定容至2 mL，溶液過0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配置

分別稱取0.01 g ZT、0.02 g IAA、0.3 g GA3和0.02 g ABA標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，即為4種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液，逐級(jí)稀釋，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用優(yōu)化的色譜條件，依次進(jìn)樣檢測(cè)，以激素質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積( mAU)為縱坐標(biāo)，建立4種激素的回歸方程。

1.2.3 色譜條件

SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;柱溫為40℃;進(jìn)樣量10 μL;;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相為甲醇:乙酸的水溶液(pH=3.5)=4.5∶5.5(V/V)。測(cè)定波長為254 nm;以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用1.2.3所述的色譜條件，對(duì)同一濃度的4種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過液相保留峰面積以及記錄保留時(shí)間，分別在一日內(nèi)測(cè)定不同時(shí)間的日內(nèi)重現(xiàn)性，取不同5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定3次。日間重現(xiàn)性分析進(jìn)行3 d的連續(xù)測(cè)定，每次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.5 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知4種激素含量的香梨幼果樣品2 g共3份，加入ZT、GA3、IAA和ABA標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3方法制備樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

植物內(nèi)源激素在不同提取液的提取效率不一樣，香梨幼果中激素含量較低，且又與酮類，酚類共存，在進(jìn)行HPLC分析時(shí)，其他物質(zhì)不可避免地對(duì)分析進(jìn)行干擾。因此，在前處理階段激素提取的關(guān)鍵就是減少雜質(zhì)的量。在選擇提取試劑時(shí)，分別以純甲醇，80%甲醇、純水、乙酸溶液(pH=3.5)作為提取溶劑。檢測(cè)結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑，不僅在后續(xù)脫色，萃取等步驟中較其他溶劑效果明顯，同時(shí)，甲醇作為提取試劑，提取效率高，雜峰較少。提取時(shí)間分別設(shè)置12、14、16、18和20 h。研究表明，激素提取效率隨著浸提時(shí)間的增加而增加，但是提取時(shí)間超過16 h后提升效果并不明顯，因此，浸提時(shí)間設(shè)置為16 h。但是，經(jīng)石油醚脫色和乙酸乙酯萃取后，依然有大量雜質(zhì)的干擾，選擇采用PVPP、Sep－PakC18小柱對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化處理，4種激素提取效果良好。

2.2 色譜條件的篩選

2.2.1 檢測(cè)波長的選擇

取4種激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外可見光光度計(jì)在190～400 nm進(jìn)行光譜掃描，檢測(cè)4種植物激素的最佳吸收波長以確定檢測(cè)波長。研究表明，4種激素的最大吸收波長分別為ABA為237 nm，IAA為235 nm，GA3為215和253 nm，ZT為257 nm;綜合分析，由于4種激素在254 nm波長條件下均有良好吸收，因此設(shè)置紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長為254 nm。

2.2.2 流動(dòng)相的比例的選擇

以甲醇和乙酸的水溶液(pH=3.5)作為流動(dòng)相，選擇不同流動(dòng)相比例對(duì)混合激素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離。分別設(shè)置甲醇比例由20%逐漸提升到80%。研究表明，甲醇含量越高，4種激素洗脫越快。當(dāng)甲醇含量在20%時(shí)，4種激素在28～29 min全部洗脫出來，但出峰時(shí)間過晚，檢測(cè)時(shí)間長，且赤霉素峰形出現(xiàn)平頭峰，表明分離效果較差(圖1 A);而當(dāng)甲醇含量達(dá)到80%時(shí)，4種激素在4～5 min洗脫出來，4種激素保留時(shí)間過短，導(dǎo)致樣品峰重疊，其中GA3與IAA峰完全重疊，并未分離出來，且其他3種激素分離度極低(圖1 B);當(dāng)甲醇含量在45%時(shí)，4種激素在13～15 min全部分離出來，激素分離度高，峰形尖銳，峰形的對(duì)稱性好，分析時(shí)間也被縮短，符合試驗(yàn)要求(圖1 C)。經(jīng)過對(duì)比激素分離度，峰形對(duì)稱性及分離時(shí)間后，表明流動(dòng)相條件為甲醇:乙酸的水溶液(pH=3.5)=4.5∶5.5(V/V)時(shí)，為最優(yōu)流動(dòng)相條件。圖1

圖1 不同流動(dòng)相比例中的內(nèi)源激素的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.1 Chromatogram of endogenous hormones in different mobile pHase:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

2.2.3 柱溫、進(jìn)樣量和流速的選擇

柱溫的選擇對(duì)激素分析效果無明顯影響，但顯著影響分析時(shí)間，當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，4種激素完全分離30～31 min，當(dāng)柱溫為40℃時(shí)，4種激素完全分離需要18～19 min。因此，為提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，選擇柱溫為40℃。流速也對(duì)分析時(shí)間有直接的影響，當(dāng)流速從0.5上升到2 mL/ min時(shí)，激素分析時(shí)間逐漸縮短，但是過大流速會(huì)增大泵壓，導(dǎo)致激素分離度下降、4種激素峰距過近等問題。經(jīng)過篩選，最終確定流速為1.0 mL/min。當(dāng)分別設(shè)置進(jìn)樣量為10、15、20 μL時(shí)，隨著進(jìn)樣量增大，前沿峰出現(xiàn)的頻率越高，且樣品過載對(duì)色譜柱危害較大。因此確定進(jìn)樣量為10 μL。

2.34 種激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 內(nèi)源激素的定性分析

采用優(yōu)化后的色譜條件，對(duì)混合激素標(biāo)準(zhǔn)液溶液進(jìn)行HPLC分析，研究表明，ZT、GA3、IAA和ABA的保留時(shí)間分別為(4.525±0.408) min、(5.433±0.50)min、(9.761±0.929)和(15.063±1.346)min。圖2

2.3.2 內(nèi)源激素的定量分析

在優(yōu)化后的色譜條件下，4種激素檢測(cè)靈敏度較高，且分離度，峰形較好。按1.4方法得出各激素的回歸方程。4種激素回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)在0.994 6～0.999 7，表明標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積相關(guān)性良好。同時(shí)，按照信噪比(S/N)為3∶1時(shí)，得到各激素的檢出限，表明測(cè)定結(jié)果有較好的精確度和靈敏度。圖1

圖2 在254 nm檢測(cè)條件下的混合激素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.2 Chromatogram of the mixture of hormones standards under 254 nm:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

表1 激素在色譜條件下的的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限Table1 Calibration curves of the standards and LOD of hormones under choosed HPLC conditions

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.4試驗(yàn)方法進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，研究表明，4種激素日內(nèi)重現(xiàn)性相對(duì)偏差在0.5%～6.92%;4種激素日間重現(xiàn)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.87%～2.53%。通過穩(wěn)定性試驗(yàn)，表明使用該方法結(jié)果較穩(wěn)定，儀器精密度及試驗(yàn)重現(xiàn)性良好。表2

2.5 實(shí)際樣品分析

取冷凍的試驗(yàn)材料2 g，按照1.2方法制備樣品并按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。香梨幼果中4種激素均得到較好的分離結(jié)果表明香梨幼果中含玉米素(ZT)16.71 μg/g、赤霉素(GA3)1.28 mg/g、生長素(IAA)32.01 μg/g、脫落酸(ABA)1.67 μg/g。圖3

2.6 回收率的測(cè)定

通過香梨幼果樣品測(cè)定結(jié)果及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，ZT、GA3、IAA、ABA的平均回收率分別為80.4%、83.2%、91.2%和90.4%，相對(duì)偏差均小于8.1%。樣品前處理方法可以滿足香梨幼果4種內(nèi)源激素的測(cè)定分析。表3

表24 種植物激素的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table2 Stability test of four kinds of plant hormones

圖3 在254 nm檢測(cè)條件下的香梨幼果的色譜圖:1－玉米素、2－赤霉素、3－生長素、4－脫落酸Fig.3 Chromatogram of the pear young fruit under 254 nm:1－zeatin(ZT)、2－gibberellic acid(GA3)、3－indole－3－acetic acid(IAA)、4－abscisic acid(ABA)

表3 各激素的加標(biāo)回收率(n=3)Table3 Result of standard addtion recovery test of hormones(n=3)

3 討論

試驗(yàn)用190～400 nm紫外光對(duì)4種激素進(jìn)行了掃描，結(jié)果表明，4種激素均在254 nm左右有較好的吸收，選擇254 nm作為檢測(cè)波長。在選擇提取溶劑方面，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)以純水及乙酸溶液作為提取溶劑時(shí)，在石油醚脫色時(shí)，脫色效果差，極易出現(xiàn)棗泥狀絮狀物。在后續(xù)的檢測(cè)中出現(xiàn)提取效果較差，提取的激素含量不穩(wěn)定等不利因素。因此，最終選擇甲醇作為提取試劑。該選擇與張玉瓊、劉妮等［8，14］研究結(jié)果一致。

在選擇純化方式方面，為避免未經(jīng)純化的提取液堵塞色譜柱，根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)，采用PVPP吸附法［6］，以盡可能的去除雜質(zhì)，達(dá)到提純激素的目的［15］。PVPP是乙烯基吡咯烷酮的交聯(lián)聚合物，具備吸附多酚類和色素類的良好性能［6，16］。Sep技術(shù)廣泛用于樣品的分離和純化，可以有效的去除干擾有機(jī)化合物。其他研究者發(fā)現(xiàn)C18小柱純化植物內(nèi)源激素效果較好，提高了激素回收率［11，17］。在試驗(yàn)中，通過在前處理過程中提取液中加入0.1 g PVPP震蕩后過濾，并在提取液壓縮后過C18預(yù)處理柱純化，有效的減少了提取液里面的雜質(zhì)，初步達(dá)到了提純激素的目的，提高了分析效果。

在內(nèi)源激素的定性分析方面，4種激素峰形尖銳，分離度較高，同時(shí)在連續(xù)3 d的穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)中，分離效果較穩(wěn)定，效果良好。在內(nèi)源激素定量分析方面，各激素相關(guān)系數(shù)均接近1，所得回歸方程理想。

利用高效液相色譜法對(duì)香梨幼果中4種內(nèi)源激素同時(shí)測(cè)定，結(jié)果符合定量分析要求，誤差小，取得了較好的效果。而赤霉素由于其檢出限較高，在此次分析中出峰難度較大。因此，試驗(yàn)中赤霉素測(cè)定的精確度和回收率與其它激素相比仍有一定差距。關(guān)于如何利用高效液相色譜法進(jìn)一步精確測(cè)定赤霉素的試驗(yàn)條件仍需進(jìn)一步的研究。

利用試驗(yàn)確定的高效液相色譜方法，對(duì)20個(gè)多個(gè)不同香梨幼果樣品進(jìn)行了4種內(nèi)源激素含量的測(cè)定，取得了較好的效果，同時(shí)也說明了該方法的可行性。

4 結(jié)論

通過優(yōu)化香梨中4種內(nèi)源激素的提取條件以及色譜條件，建立了一種以SGE ProteCol－P C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)作色譜柱，甲醇和乙酸的水溶液(pH=3.5)作流動(dòng)相，設(shè)定流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，樣品進(jìn)樣量為10 μL，采用高效液相色譜法在波長254 nm下同時(shí)測(cè)定了庫爾勒香梨幼果樣品中的玉米素、生長素、細(xì)胞分裂素和脫落酸，分析時(shí)間不超過17 min，且4種激素出峰穩(wěn)定，峰型優(yōu)質(zhì)，加標(biāo)回收率均在80%以上。該方法具有樣品前處理簡單、分離效果較好、精確度高、回收率理想、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。該方法達(dá)到了激素的定量測(cè)定要求，適用于香梨以及其他果品多種內(nèi)源激素含量的同時(shí)分析測(cè)定。

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Determination of Four Endogenous Hormones in the Young Fruit of Korla Fragrant Pear by High Performance Liquid Chromatography(HPLC)

ZHANG Zhan－chang1，SUN Zhi－h(huán)ong2，ZHENG Xiao－neng3，LIU Huai－feng LI1，3
(1.Horticultural Department，College of Agronomy，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832000，China; 2.Research Institute of AgriculturalSciences，Division Two，Xinjiang Production and Construction Corps，Korla Xinjiang 841503，China;3.Key Laboratory of Featured Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi Xinjiang 832000，China)

【Objective】A high performance liquid chromatography(HPLC)method was developed to determine the concentration of four endogenous hormones［indole－3－acetic acid(IAA)，abscisic acid (ABA)，gibberellic acid(GA3)，zeatin(ZT)］in young fruit of Korla fragrant pear.【Method】After screening and optimization of conditions，80%methanol was chosen as extraction solvent.Polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)was used to absorb impurities.The samples were extracted with petroleum ether and ethyl acetate.The extracts were purified with a reverse pHase Sep－Pak C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm particle size).The column temperature was 40℃.The flow rate was 1 mL/min.The injection volume was 10 μL.The mobile phase was 45%methanol(A)and 55%acetic acid(B，pH=3.5).The detection wavelength was 254 nm.【Result】ZT，GA3，IAA，abscisic acid analysis method of high performance liquid chromatography was established.The HPLC recovery of known concentrations of IAA，ABA，GA3，and ZT ranged between 80.4%and 91.2%.The relative standard deviations(RSDs)ranged between 1.54%and 8.1%.The experimental results were stable and reliable.【Conclusion】The HPLC method developed in this study is simple，rapid，reproducible，and accurate.Therefore，it is suitable for rapid and accurate quantification of ZT，GA3，IAA and ABA in pear fruit.

fragrant pear;HPLC;young fruit;endogenous hormone

LIU Huai－feng(1972－)，Male，Henan Province，Professor，Doctor of agriculture，The research direction is the pHysiology of fruit tree cultivation，(E－mail)lhf_agr@shzu.edu.cn

S601.2

A

1001－4330(2017)05－0886－07

10.6048/j.issn.1001－4330.2017.05.012

2017－03－03

兵團(tuán)科技計(jì)劃南疆專項(xiàng)“庫爾勒香梨優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”(2013BA038)

張占暢(1993－)，男，安徽人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌恚?E－mail)1170258813@qq.com

劉懷鋒(1972－)，男，河南人，教授，博士，研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌恚?E－mail)lhf_agr@shzu.edu.cn

Supported by:Xinjiang Production and Construction Corps Science and Technology Plan(special research program in southern Xinjiang)"Key technology research and demonstration of quality and efficient production of Korlar fragrant pear"(2013BA038)