改性蒙脫土脫除花生油中黃曲霉毒素B1條件優(yōu)化研究

馬文文 刁恩杰 李向陽 董海洲 陳 寧

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，泰安 271018) (山東金勝糧油集團2，臨沂 276600)

改性蒙脫土脫除花生油中黃曲霉毒素B1條件優(yōu)化研究

馬文文1刁恩杰1李向陽1董海洲1陳 寧2

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，泰安 271018) (山東金勝糧油集團2，臨沂 276600)

為了提高鈉基蒙脫土(Na-MMT)脫除花生油中黃曲霉毒素B1(AFB1)的效率，本試驗以Na-MMT為原料，選用6種有機季銨鹽作為改性劑對其進行改性，并利用響應(yīng)面法對改性Na-MMT脫除花生油中AFB1的條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，改性Na-MMT脫毒效果顯著優(yōu)于未改性Na-MMT(P<0.05)；在6種改性劑中，十八烷基三甲基氯化銨(1831)改性后的Na-MMT脫毒效果顯著優(yōu)于其他5種改性劑(P<0.05)，且在添加量為20% CEC(Na-MMT陽離子交換能力)改性的Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1效果最好。分別以吸附時間、吸附溫度、改性吸附劑添加量為因素進行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳吸附溫度為53.79 ℃、吸附劑添加量為3.13%、吸附時間為29.46 min；在此條件下，花生油中AFB1含量從(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，脫毒率為84.69%。有機改性能有效提高Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1的效果，可在花生油加工企業(yè)推廣應(yīng)用，以提高油的食用安全性。

有機改性蒙脫土 吸附脫毒 黃曲霉毒素B1響應(yīng)面 花生油

花生油營養(yǎng)價值高、口感好、香味濃，因此受到我國及亞洲各國消費者的喜愛。然而，我國很多地區(qū)生產(chǎn)的花生油經(jīng)常被檢測出含有黃曲霉毒素B1(AFB1)，特別是我國南方地區(qū)生產(chǎn)的花生油中AFB1含量超出我國限量要求(20 μg/kg)的幾十倍[1-2]。AFB1是一種真菌毒素，人和動物經(jīng)常食用污染AFB1的食物可能會導(dǎo)致急性或慢性中毒，如急性肝損傷、壞死、甚至是肝癌[3-4]。由于花生油是我國居民消費的主要食用油之一，經(jīng)常食用AFB1污染的花生油，可能會使我國居民慢性中毒或患肝癌的幾率明顯增加。

自從人類發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來，一直在探尋有效預(yù)防和脫除食物中黃曲霉毒素的方法，經(jīng)常研究和使用的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法[5-7]。物理吸附法常用于脫除玉米、花生粕等飼料原料中污染的黃曲霉毒素，但在食品中應(yīng)用報道較少[8]。在油脂精煉環(huán)節(jié)，經(jīng)常用蒙脫土進行油脂脫色，同時可部分吸附去除花生油中的黃曲霉毒素。但是，蒙脫土是一種親水性的硅酸鹽類礦物，在前期的試驗研究中，發(fā)現(xiàn)其在油脂中的分散性差，容易聚團，不能與油脂充分混合，進而導(dǎo)致其在油脂中分布不均勻，吸附脫毒效果差。本研究通過6種有機季銨鹽對蒙脫土進行改性，提高蒙脫土的親油性、增加其層間距，以期提高蒙脫土對花生油中AFB1的吸附脫除率，同時對改性蒙脫土的吸附脫毒條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

鈉基蒙脫土(Na-MMT)：青島玉洲化工有限公司，純度99%，陽離子交換容量(CEC):pH 7.6，139 mmol/100 g，不含氯離子；花生油：自榨，AFB1含量為(29.20±2.12)μg/kg；季銨鹽改性劑見表1，均為分析純：上海金山經(jīng)緯化工有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(分子式C17H12O6，分子質(zhì)量312.27)，純度大于98%：上海生物工程有限公司。

表1 改性劑種類、結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量

1.2 主要儀器設(shè)備

TGF-1榨油機：東莞天工坊有限公司；LC-20AT高效液相色譜：日本島津公司；VORTEX KB-3渦旋混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UGC-12W氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TG1650-WS離心機,上海盧湘儀離心儀器有限公司；DFT-50粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生油中AFB1測定[5]

稱取5.0 g油樣，加入15.0 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=70∶30)，用力振搖1 min，濾紙過濾后取4 mL濾液，加入2 mL石油醚，振搖靜置分層后，取底部3 mL提取液加入8 mL蒸餾水稀釋、混合，并通過0.45 μm有機濾膜，凈化后通過免疫親和柱。被洗脫的樣品加入三氟乙酸在40 ℃下衍生20 min，樣品中剩余的甲醇和三氟乙酸經(jīng)過氮吹儀吹干后，用乙腈水(乙腈∶水=15∶85)振蕩溶解后進行高效液相色譜分析。

液相色譜進樣條件：色譜柱：Kromasil 100-5 C18 150 mm×4.6 mm；乙腈-水二元梯度洗脫條件：15%乙腈洗脫6 min，17%乙腈洗脫2 min，25%乙腈洗脫6 min，15%乙腈洗脫8 min，85%乙腈洗脫4 min，15%乙腈洗脫3 min；熒光檢測器進行檢測(λ激發(fā)=360 nm，λ發(fā)射=440 nm)；流速：1 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2 蒙脫土有機改性及改性劑選擇

1.3.2.1 Na-MMT的改性

稱取20 g Na-MMT于400 mL去離子水中，置于60 ℃水浴中，在200 r/min下攪拌2 h，得到蒙脫土懸浮液。按Na-MMT陽離子交換量(CEC)的40%在懸浮液中分別加入溶解的1831(3.87 g)、D1821(6.52 g)、1827(4.71 g)、1631(3.56 g)、1227(3.78 g)及1231(2.94 g)，于60 ℃水浴中攪拌5 h(200 r/min)。經(jīng)離心、清洗至上清液無氯離子存在，然后放入80 ℃的烘箱中烘干，冷卻，粉碎后過200目篩，密封并分別標(biāo)記為M1831、MD1821、M1827、M1631、M1227和M1231，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 有機改性劑選擇

分別取25 g花生油倒入6個100 mL燒杯中，分別加入花生油量的1%(質(zhì)量比)6種改性Na-MMT，未改性Na-MMT做對照，在35 ℃、150 r/min條件下攪拌吸附60 min，于5 000 r/min離心，提取油樣按照1.3.1步驟分離、純化并測定AFB1殘留量。

篩選出吸附效果最好的Na-MMT改性劑，按照Na-MMT陽離子交換量(CEC)的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%對其進行梯度改性，方法同1.3.2.1，再確定有機改性劑的最佳添加量。

1.3.3 改性蒙脫土對花生油中AFB1吸附脫毒條件優(yōu)化

1.3.3.1 吸附劑添加量的影響

分別在2組盛有25 g花生油的燒杯中加入1%、2%、3%、4%、5% Na-MMT和改性Na-MMT，在35 ℃、150 r/min條件下攪拌吸附60 min后，于5 000 r/min離心，提取油樣按照1.3.1步驟分離、純化并測定AFB1殘留量。

1.3.3.2 吸附時間的影響

分別在2組盛有25 g花生油燒杯中加入3% Na-MMT和改性Na-MMT，在35 ℃、150 r/min條件下分別攪拌吸附15、30、45、60、75 min后，于5 000 r/min離心，提取油樣按照1.3.1步驟分離、純化并測定AFB1殘留量。

1.3.3.3 吸附溫度的影響

分別在2組盛有25 g花生油燒杯中加入3% Na-MMT和改性Na-MMT，分別在35、45、55、65、75 ℃恒溫水浴中攪拌吸附30 min(攪拌速度150 r/min)，于5 000 r/min離心，提取油樣按照1.3.1步驟分離、純化并測定AFB1殘留量。

1.3.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化花生油中AFB1吸附脫毒條件

根據(jù)上述單因素試驗的測定結(jié)果，運用Box-Behnken中心組合試驗的設(shè)計原理設(shè)計響應(yīng)面試驗。以吸附溫度(A)、吸附時間(B)、M1831添加量(C)為變量，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計見表2。采用Design-Expert 8軟件進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義。

表2 Box-Behnken設(shè)計試驗

1.4 統(tǒng)計分析

每組試驗均進行3次重復(fù)，并采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機改性劑的選擇

Na-MMT是一種親水性的硅酸鹽，在油中存在分散性差、分布不均勻等缺陷，從而降低了其吸附脫除油中AFB1的能力。本研究選用6種有機季銨鹽，即十八烷基三甲基氯化銨(1831)、十八烷基二甲基芐基氯化銨(1827)、雙十八烷基二甲基氯化銨(D1821)、十六烷基三甲基氯化銨(1631)、十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)和十二烷基三甲基氯化銨(1231)分別對Na-MMT進行改性，結(jié)果見圖1。

注：字母不同表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)，下同。圖1 不同改性劑對Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1效果的影響

從圖1可以看出，6種有機改性劑均能顯著提高Na-MMT的吸附脫毒效果(P<0.01),經(jīng)改性Na-MMT吸附脫毒后的花生油中AFB1從(29.20±2.12)μg/kg分別減少到(13.44±0.63)μg/kg(M1231)、(13.95±1.08)μg/kg(M1227)、(12.82±0.99)μg/kg(M1631)、(14.30±0.38)μg/kg(MD1821)、(12.58±0.98)μg/kg(M1827)和(12.00±1.09)μg/kg(M1831)，吸附脫毒效果均顯著高于未改性的Na-MMT(15.55±0.55 μg/kg)(P<0.05)。由于所用季銨鹽均為陽離子表面活性劑，改性后的Na-MMT親油性增強，因此，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)改性后的Na-MMT在花生油中的分散性得到明顯改善、聚團減少，提高了與花生油的接觸面積和混合均勻度，進而提高了其對花生油中AFB1的吸附脫除效果。另外，有機季銨鹽陽離子的分子直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鈉離子，通過離子交換置換下Na-MMT層間的鈉離子，從而增大了Na-MMT的層間距，季銨鹽碳鏈越長，改性后的Na-MMT片層間距越大(圖2)，在一定程度上層間距的增大有利于提高其對AFB1吸附能力[9-10]。

圖2 Na-MMT與6種改性Na-MMT的XRD圖譜(40% CEC)

在6種季銨鹽改性劑中，1831改性后的Na-MMT吸附脫毒效果最好，其分子質(zhì)量大小位于6種季銨鹽中間(見表1)，這說明季銨鹽改性劑分子質(zhì)量的大小與改性Na-MMT吸附脫毒效果密切相關(guān)，改性劑分子量太大或太小都會降低改性Na-MMT的吸附脫毒效果，其原因有待進一步研究。另外，D1821改性的Na-MMT的吸附脫毒效果最差，這可能是由于D1821的分子結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量決定的，既D1821為雙鏈烷基結(jié)構(gòu)，其長鏈進入Na-MMT片層雖增加了片層間距，但也占據(jù)了較多的片層空間，阻礙了AFB1分子進入片層(表1)。因此，本試驗選用1831作為改性劑做進一步的研究。

2.2 改性劑1831添加量的確定

為確定1831改性劑最佳添加量，本試驗按照Na-MMT陽離子交換能力(CEC)的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的量添加到Na-MMT懸浮液中進行改性，結(jié)果見圖3。圖3表明，隨著改性劑添加量的增加，改性Na-MMT的吸附脫除花生油中AFB1的能力先增加后降低，在20%CEC添加量時，吸附脫毒效果達到最高，花生油中AFB1殘留量由(29.20±2.12)μg/kg顯著降低到(8.86±0.69)μg/kg(P<0.05)，減少了69.66%，而未改性的Na-MMT降低到(15.55±0.55)μg/kg，僅減少了46.75%。當(dāng)1831添加量低于20%CEC時，隨著改性劑添加量的增加，有利于提高Na-MMT親油性和層間距，進而提高其吸附脫除AFB1的性能；而當(dāng)1831添加量超過20%CEC時，改性Na-MMT吸附脫除AFB1的能力顯著降低(P<0.05)，這可能是由于改性劑過多插入到Na-MMT的片層間，占據(jù)了較多的AFB1吸附活性位點，降低了本身的陽離子交換能力所致[10-11]。另外，過多的改性劑也可能進入Na-MMT片層間的空隙，阻礙了AFB1分子進入，進而降低了Na-MMT吸附脫毒效果。因此1831的添加量選擇在20% CEC Na-MMT當(dāng)量。

圖3 1831添加量對Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1效果的影響

2.3 改性蒙脫土(M1831)吸附脫毒條件優(yōu)化

2.3.1 M1831添加量對脫除花生油中AFB1效果的影響

改性前后Na-MMT添加量對花生油中AFB1吸附脫毒效果見圖4。

注：大小寫字母不同分別表示Na-MMT和M1831添加量不同引起的吸附脫毒效果存在顯著差異，“**”表示在相同添加量條件下Na-MMT和M1831吸附脫毒效果存在極顯著差異(P<0.01)，“*”表示存在顯著差異(P<0.05)，下同。圖4 改性前后Na-MMT添加量對花生油中AFB1吸附脫毒效果的影響

由圖4得出，改性前后的Na-MMT均能有效吸附脫除花生油中殘留的AFB1(P<0.01)，且隨著吸附劑添加量的增加，油中AFB1脫除效果越好。當(dāng)吸附劑添加量為3%時，花生油中殘留的AFB1從(29.20±2.12)μg/kg分別降低到(9.09±0.50)μg/kg(Na-MMT)和(6.91±0.46)μg/kg(M1831)，分別減少了68.87%(Na-MMT)和76.34%(M1831)。當(dāng)添加量超過3%時，Na-MMT和M1831都不能顯著降低油中AFB1殘留量(P>0.05)。與Na-MMT吸附脫毒效果相比，M1831吸附脫毒效果得到極顯著提高(P<0.01)。

2.3.2 吸附時間對脫除花生油中AFB1效果的影響

吸附時間對改性前后Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1的效果見圖5。由圖5可得出，在設(shè)定的吸附時間內(nèi)，改性前后的Na-MMT均能顯著降低花生油中的AFB1殘留量(P<0.01)。在相同的吸附時間時，M1831的吸附脫毒率顯著高于Na-MMT(P<0.05)。Na-MMT在吸附時間45 min時，吸附脫毒率達到最大值為73.15%，而M1831在吸附時間30 min時達到最大值為79.56%，因此改性后的Na-MMT能明顯減少對花生油中AFB1的吸附脫除時間，這與改性后Na-MMT親油性增強[12]，更容易分散到油中與油充分混合有關(guān)。當(dāng)Na-MMT和M1831吸附時間分別超過45、30 min后，油中AFB1吸附脫毒率有下降的的趨勢，這可能是因為隨著吸附時間的增加，吸附劑表面吸附的AFB1發(fā)生解析，在吸附攪拌的作用下AFB1分子掙脫吸附表面能而重新釋放到油中[13]。

圖5 吸附時間對花生油中AFB1吸附脫毒效果的影響

2.3.3 吸附溫度對脫除花生油中AFB1效果的影響

吸附溫度對改性前后Na-MMT吸附脫除花生油中AFB1的效果見圖6。由圖6可得出，在設(shè)定的吸附溫度內(nèi)，隨著吸附溫度的升高，Na-MMT和M1831吸附脫除花生油中AFB1的效果迅速增加，并分別在65、55 ℃時增加趨于平緩，此時油中AFB1脫除率分別達到79.32%和84.04%；當(dāng)吸附溫度超過55 ℃時，升高溫度并不能顯著提高Na-MMT和M1831的吸附脫毒率(P>0.05)，這是由于在溫度低于55 ℃時，升高溫度會提高吸附劑的吸附活性，增加油中AFB1分子運動速度，從而提高吸附劑的吸附脫毒能力；但繼續(xù)升高溫度，油中整個體系分子的運動速率繼續(xù)加快，催化氧化、色素分解等多種反應(yīng)進行[14]，干擾了AFB1與吸附劑的結(jié)合；另外，在吸附達到平衡時，繼續(xù)升高溫度，則有利于解吸過程的發(fā)生，從而導(dǎo)致吸附劑的吸附脫毒能力趨于平緩和穩(wěn)定。

圖6 吸附溫度對花生油中AFB1吸附脫毒效果的影響

2.3.4 吸附脫除花生油中AFB1響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行響應(yīng)面試驗。以M1831添加量、吸附時間、吸附溫度為變量，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果如表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計展開了17組試驗，其中包括12個析因試驗和5個中心試驗(見表3)。由結(jié)果得出，吸附溫度(A)、吸附時間(B)、M1831添加量(C)與AFB1殘留量的二次多項回歸方程為：

AFB1=4.48+0.26A+0.15B-0.18C-0.14AB+0.068AC+0.18BC+0.61A2+1.06B2+0.43C2

對回歸模型進行顯著性檢驗和方差分析，結(jié)果見表4。由表4可看出，本試驗所建立的模型P<0.000 1,說明該模型的二次多項式回歸擬合方程高度顯著，不同處理間的差異極顯著(P<0.01)。失擬項P=0.068 1>0.05說明在α=0.05水平上失擬項不顯著，即該模型擬合度較好，應(yīng)用該模型于吸附脫除花生油中AFB1的條件優(yōu)化是可行的。

該模型三因素的P值均小于0.01，說明吸附溫度、吸附時間及M1831添加量對吸附脫毒效果的影響極顯著，其影響順序為吸附溫度>M1831添加量>吸附時間。3個因素的二次項P值均小于0.01，交互項AC不顯著，AB顯著，BC極顯著，對油中AFB1殘留量的影響并非線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。

表4 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析

注：**表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

根據(jù)回歸方程，得出M1831吸附脫除花生油中AFB1的最佳條件為：吸附溫度為53.79 ℃，M1831添加量為3.13%，吸附時間為29.46 min，預(yù)期得到的花生油中AFB1殘留量從(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.42±0.00)μg/kg。進一步對優(yōu)化條件進行驗證，得到吸附脫毒后的AFB1殘留量從(29.20±2.12)μg/kg降低到(4.47±0.29)μg/kg，吸附脫毒率達到84.69%，與預(yù)期結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。吸附脫毒后的花生油中AFB1殘留量低于GB 1534—2003對花生油中AFB1的限量要求(20 μg/kg)。

3 結(jié)論

有機季銨鹽改性能顯著提高Na-MMT對花生油中AFB1的吸附脫毒效果，6種有機季銨鹽中1831改性后的Na-MMT吸附脫毒效果明顯優(yōu)于其他季銨鹽，且在20%CEC添加量時改性效果最好。吸附溫度、吸附時間和M1831添加量均顯著影響花生油中AFB1的吸附脫毒效果，且吸附溫度>M1831添加量>吸附時間。響應(yīng)面法優(yōu)化M1831吸附脫毒工藝為吸附溫度53.79 ℃、時間29.46 min、M1831添加量3.13%，在該條件下可將花生油中AFB1殘留量降低到(4.47±0.29)μg/kg，達到GB 1534—2003對花生油中AFB1的限量要求(20 μg/kg)。Na-MMT有機改性工藝及改性吸附劑的脫毒工藝可在花生油加工企業(yè)進行推廣應(yīng)用，以保障油的食用安全性。

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Optimization of Removing Aflatoxin B1in Peanut Oil by Modified Montmorillonite

Ma Wenwen1Diao Enjie1Li Xiangyang1Dong Haizhou1Chen Ning2

(College of Food Science & Engineering,Shandong Agricultural University1,Taian 271018) (Shandong Jinsheng Cereal & Oils Group2,Linyi 276600)

Na-montmorillonite(Na-MMT)was modified with six organic quaternary ammonium salts as modifiers for improving its detoxifying efficiency on Aflatoxin B1(AFB1)in peanut oil.The response surface method(RSM)was used to optimize the detoxifying conditions of AFB1in peanut oil with modified Na-MMT.The results showed that the modified Na-MMT were all significantly better than Na-MMT in detoxifying efficiency on AFB1in peanut oil(P<0.05).Among the six modifiers,the octadecyl trimethyl ammonium chloride(1831)was the best one in improving the detoxifying efficiency of Na-MMT(P<0.05).Na-MMT modified by 1831 with 20%CEC(cation exchange capacity of Na-MMT)of addition had the best detoxifying efficiency on AFB1in peanut oil.The adsorption time,adsorption temperature,and addition amount of modified Na-MMT were chosen to optimize the detoxifying conditions,and the optimum adsorption temperature was 53.79 ℃,the addition amount of modified Na-MMT was 3.13%,and the adsorption time was 29.46 min.Under the optimum detoxifying conditions,the AFB1in peanut oil could be removed from(29.20±2.12)μg/kg to(4.47±0.29)μg/kg with 84.69% of detoxification.Therefore,organically modified Na-MMT could significantly improve the detoxifying efficiency of AFB1in peanut oil,which could be popularized and applied in the peanut oil processing enterprises for improving the edible safety of oil.

organically modified montmorillonite,adsorption detoxification,aflatoxin B1，response surface method，peanut oil

公益性行業(yè)專項(201203037)，山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014ZZCX07204)，山東省高校科技發(fā)展計劃(J14LE15)

2015-12-15

馬文文，女，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

刁恩杰，男，1977年出生，博士，糧油食品加工與質(zhì)量控制 董海洲，男，1957年出生，教授，糧油食品加工與質(zhì)量控制

TS210.4

A

1003-0174(2017)06-0139-07