叔丁基對苯二酚及其氧化產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用

李 軍 畢艷蘭 孫尚德 丁一冉(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

叔丁基對苯二酚及其氧化產(chǎn)物與牛血清蛋白的相互作用

李 軍 畢艷蘭 孫尚德 丁一冉
(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

采用紫外吸收光譜和熒光光譜法研究叔丁基對苯二酚(TBHQ)及其氧化產(chǎn)物叔丁基對苯二醌(TQ)與牛血清蛋白(BSA)的結(jié)合作用。結(jié)果表明，TBHQ和TQ與BSA之間發(fā)生了相互作用并形成新的聚合體；TBHQ和TQ與BSA的熒光猝滅均屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。TBHQ和TQ與BSA之間的結(jié)合常數(shù)均大于104L/mol，表明它們之間形成的配合物結(jié)合較為牢固；TBHQ和TQ與BSA之間的結(jié)合位點數(shù)均為1；通過熱力學(xué)參數(shù)方程計算得出：ΔH<0、ΔS>0和ΔG<0，表明它們之間結(jié)合的主要作用力是氫鍵和疏水作用力，此過程是自發(fā)進(jìn)行的。根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算出供能體(BSA)與受能體(TBHQ和TQ)之間的結(jié)合距離r分別為3.13和3.73 nm。研究結(jié)果表明，TBHQ和TQ與BSA的結(jié)合引起了BSA的構(gòu)象變化。

叔丁基對苯二酚 叔丁基對苯二醌 牛血清蛋白 紫外吸收光譜 熒光光譜

油脂及富油食品中常常添加酚類抗氧化劑，尤其是TBHQ，來延長其保質(zhì)期。隨著放置時間的延長，油脂及富油食品中的TBHQ會與氧氣和油脂自由基(R·和ROO·)等發(fā)生反應(yīng)生成TQ[1]。添加的TBHQ及其氧化產(chǎn)物TQ也會進(jìn)入人體進(jìn)行新陳代謝，并可能與人體自身的一些蛋白質(zhì)、酶等發(fā)生相互作用，從而影響人體的生理機(jī)能和正常的新陳代謝，因此TBHQ和TQ與生物大分子蛋白質(zhì)相互作用的研究是極為重要的。

血清蛋白是血漿中含量最豐富的可溶性蛋白和載體蛋白，它有著重要的運載、緩沖和營養(yǎng)功能，其最為顯著的功能是作為許多外源性物質(zhì)的貯存蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合。藥物學(xué)相關(guān)研究表明，藥物小分子(多為酚類物質(zhì))與蛋白質(zhì)之間會發(fā)生一定的相互作用，引起蛋白質(zhì)二級、三級空間結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象變化，這對酚類物質(zhì)在體內(nèi)的代謝會產(chǎn)生一定的影響[2]。因此，對于酚類物質(zhì)與血清蛋白之間的研究是極為重要的。研究酚類物質(zhì)與蛋白的結(jié)合將有助于解釋其代謝和運輸過程，同時也有助于解釋蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與生理功能之間的關(guān)系。另外，由于BSA與人血清蛋白是同源性蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)上具有很高的相似度，因此常常被用于代替人血清蛋白作為研究對象[3]。

對于TBHQ與蛋白質(zhì)的相互作用已有學(xué)者做了相關(guān)的研究。Shahabadi等[3]研究了TBHQ與牛血清蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)其猝滅過程是靜態(tài)猝滅，此過程引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)合位點數(shù)是1，主要作用力是疏水作用力和氫鍵，此過程是自發(fā)進(jìn)行的。但是，作為TBHQ氧化產(chǎn)物的TQ，其毒性遠(yuǎn)大于TBHQ[4]，它與蛋白質(zhì)之間的作用鮮有報道。

本試驗以TBHQ做對比，模擬人體生理pH=7.4條件，采用紫外吸收光譜和熒光光譜法來研究TQ與BSA之間的相互作用，并對其猝滅機(jī)制、作用力的類型、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化等進(jìn)行考察，這對闡明其在人體內(nèi)代謝過程中與血清蛋白的結(jié)合規(guī)律具有重要的意義，還能從微觀層面揭示TQ與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TBHQ(純度≥99.00%)、TQ(純度≥99.00%)、Tris(純度≥99.90%)：美國Sigma-Aldrich公司；BSA(第五組分，相對分子質(zhì)量68 000.00)：瑞士Roche公司；鹽酸(分析純，濃度為36.46%)：洛陽化學(xué)試劑廠；無水乙醇(色譜純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計：上海電科儀器股份有限公司；T1900型紫外分光光度計(帶有恒溫水浴裝置)：北京普析儀器有限公司；日立F7000型熒光分光光度計(帶有恒溫水浴裝置)：日本日立高新技術(shù)公司；2695-2487型高效液相色譜分析儀：美國Waters公司；SCQ-250B超聲儀：上海生彥超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.20×10-5mol/L BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.41 g BSA于500 mL棕色容量瓶，用0.10 mol/L pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.10 mol/L NaCl維持離子強度)定容至500 mL。

3.00×10-3mol/L TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.05 g TBHQ于100 mL棕色容量瓶，用色譜純無水乙醇定容至100 mL。

3.00×10-3mol/L TQ標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.05 g TQ于100 mL棕色容量瓶，用色譜純無水乙醇定容至100 mL。

所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均放置于1～4 ℃冰箱中儲存。

1.3.2 TBHQ及其氧化產(chǎn)物TQ的定性測定

分別稱取2.00 mg TBHQ、TQ標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶，用色譜純無水乙醇定容至100 mL，搖勻后儲存于1～4 ℃冰箱中備用。經(jīng)0.45 μm有機(jī)過濾膜進(jìn)行過濾后，采用高效液相色譜儀進(jìn)行定性測定。用正相HPLC法檢測TBHQ和TQ，檢測條件：色譜柱：Sunfire prep silica柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：5%乙酸乙酯的正己烷(A)：5%異丙醇的正己烷(B)；梯度洗脫：10% B等度為10 min，10% B到100% B為5 min，100% B等度為12 min；流速：0.80 mL/min；檢測波長：280、310 nm；進(jìn)樣體積：20 μL，柱溫：30 ℃。溶劑A、B均超聲脫氣40 min。

1.3.3 紫外吸收光譜測定

將濃度為1.20×10-5mol/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入9個10 mL棕色容量瓶中并定容后，再用微量注射器分別向其中加入0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.00×10-3mol/L)進(jìn)行紫外滴定。每次加入TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分別于25、37 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌6 min，以BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液做參比，進(jìn)行紫外光譜掃描并記錄其在200～400 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。將TBHQ替換為TQ，按相同方法測定。

1.3.4 普通熒光光譜和同步熒光光譜測定

將濃度為1.20×10-5mol/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入9個10 mL棕色容量瓶中并定容后，再用微量注射器分別向其中加入0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.00×10-3mol/L)進(jìn)行熒光滴定。每次加入TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分別于15、25、37 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌6 min，以BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液做參比，280 nm為激發(fā)波長，進(jìn)行熒光光譜掃描并記錄其在290～500 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜(激發(fā)光柵和發(fā)射光柵均為5 nm)。分別以Δλ=15和60 nm進(jìn)行同步熒光光譜掃描并記錄其在265～485 nm和220～440 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。將TBHQ替換為TQ，按相同方法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 TBHQ和TQ的定性測定

TBHQ作為油脂及富油食品中最常用的合成抗氧化劑，其穩(wěn)定性較好，其在空氣或油脂體系中加熱的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是TQ[1,5]。TQ在干燥的空氣中很穩(wěn)定，但在潮濕空氣中易被還原生成TBHQ。為了避免檢測過程中TBHQ和TQ之間的相互轉(zhuǎn)化，本試驗以正相HPLC法定性檢測TBHQ和TQ。圖1為TBHQ和TQ分別在雙波長測定下的正相HPLC色譜圖，其保留時間分別為27.60和5.66 min。

圖1 TBHQ和TQ的正相HPLC圖

2.2 紫外吸收光譜法

模擬人體條件，用pH為7.40的Tris-HCl溶液做參比，測量25 ℃下BSA、TBHQ、TQ以及BSA-TBHQ與BSA-TQ的紫外吸收光譜，如圖2所示。

注:1為TBHQ，2為BSA，3為BSA-TBHQ，4為TQ，5為BSA-TQ。

圖2 25 ℃下TBHQ/TQ、BSA和BSA-TBHQ/BSA-TQ的紫外吸收光譜

由圖2可知，BSA在279 nm處有最大吸收峰出現(xiàn)，TBHQ在292、254 nm處有最大吸收峰出現(xiàn)，TQ在252 nm出有最大吸收峰出現(xiàn)；BSA-TBHQ體系在279 nm處的吸光度為0.531，小于BSA與TBHQ在279 nm處的吸光度之和(分別為0.510和0.149)；BSA-TQ體系在279 nm處的吸光度為0.511，也小于BSA與TQ的吸光度之和(分別為0.005和0.515)，即BSA-TBHQ體系和BSA-TQ體系均不符合Beer定律的加和性。由此表明BSA分別與TBHQ和TQ之間發(fā)生了相互作用并且形成了新的聚合體[6]。

2.3 熒光光譜法

通常，蛋白質(zhì)的熒光是由蛋白質(zhì)的3種帶有苯環(huán)的氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的內(nèi)在基團(tuán)的特性引起的。實際上，許多蛋白的熒光主要是由色氨酸產(chǎn)生的。熒光猝滅是指由一些能夠發(fā)射出熒光的物質(zhì)同一些溶劑分子之間發(fā)生相互作用從而引起了熒光基團(tuán)熒光強度減弱的過程。這其中包括激發(fā)態(tài)的反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)變、分子的重新排列、以及基態(tài)復(fù)合物的形成和碰撞猝滅。

研究在不同溫度下(15、25、37 ℃)抗氧化劑TBHQ、TQ對BSA熒光強度的影響，結(jié)果如圖3所示。

注:c(BSA)=1.20×10-5mol/L,c(TBHQ/TQ)/c(BSA)=0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00，余同。

圖3 不同溫度下BSA與不同濃度TBHQ/TQ作用的熒光光譜(以25 ℃為例)

由圖3可以看出，不同溫度下，BSA-TBHQ和BSA-TQ 3個體系中BSA在339 nm附近均有很強的熒光發(fā)射峰，TBHQ和TQ在339 nm附近區(qū)域均無熒光發(fā)射峰；隨著不斷滴加TBHQ/TQ溶液到BSA溶液中，BSA的熒光強度會有明顯的減弱現(xiàn)象，且最大發(fā)射波長逐漸發(fā)生紅移，但BSA的峰形沒有發(fā)生變化，說明BSA與TBHQ和TQ之間發(fā)生了相互作用，BSA在變性過程中發(fā)生了構(gòu)象的變化，從而導(dǎo)致BSA發(fā)生了熒光猝滅。此結(jié)果與Shahabadi等[3]的研究結(jié)果是相似的。

2.3.1 猝滅類型

根據(jù)猝滅方式的不同，猝滅過程被分為2種，一種是動態(tài)猝滅，即指在激發(fā)態(tài)瞬間存在時，熒光基團(tuán)與猝滅劑接觸的過程；另一種是靜態(tài)猝滅，是指由一些能夠發(fā)射出熒光的物質(zhì)(基態(tài)熒光分子)與猝滅劑之間通過結(jié)合生成了非熒光復(fù)合物從而導(dǎo)致熒光強度減弱的過程。一般情況下，根據(jù)溫度和激發(fā)態(tài)壽命的不同來區(qū)分動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，這2種猝滅類型的熒光強度都與所添加猝滅劑的濃度有關(guān)。

熒光猝滅可以通過Stern-Volmer方程來表述[7]：

F0/F=1+Κqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式中：F0和F分別表示向溶液中添加猝滅劑前后的BSA的熒光強度、Kq為生物分子的猝滅速率常數(shù)、Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)、τ0為無猝滅劑時熒光分子的平均壽命的值(τ0=6.2 ns)、[Q]為猝滅劑的濃度。

圖4 不同溫度下TBHQ/TQ與BSA相互作用的Stern-Vorlmer曲線(T=15、25、37 ℃)

不同溫度下TBHQ、TQ對BSA熒光猝滅作用的Stern-Volmer曲線如圖4所示，可看出BSA的F0/F值與TBHQ/TQ在0到2.40×10-5mol/L的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，同時通過線性擬合可以得到不同溫度下(15、25、37 ℃)的直線方程和相關(guān)系數(shù)(表1)，其相關(guān)系數(shù)均>0.98，由此表明在這一系列濃度下存在單一的猝滅機(jī)制，即靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅[8]。

動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅可以溫度來區(qū)分[9]。動態(tài)猝滅由于與擴(kuò)散有關(guān)，當(dāng)溫度升高時溶液的黏度下降，同時分子的運動加速，其結(jié)果將使分子的擴(kuò)散系數(shù)增大，從而增大分子猝滅常數(shù)。反之，溫度升高可能引起配合物穩(wěn)定性的下降，靜態(tài)猝滅常數(shù)減小。

根據(jù)表1中BSA-TBHQ和BSA-TQ 3個體系在不同溫度下的Stern-Vorlmer曲線方程的斜率和截距算出3個體系在在不同溫度下的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ 3個體系的Ksv均隨著溫度的升高而減小，表明BSA與TBHQ及BSA與TQ的反應(yīng)過程都是靜態(tài)猝滅過程。另外，由表2也可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系的猝滅速率常數(shù)Kq的值約為1011L/(mol·s)。由于各種熒光猝滅劑對于生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)Kq約為1010L/(mol·s)[10]。顯然，BSA與TBHQ、TQ作用引起的猝滅常數(shù)大于最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)。進(jìn)一步表明BSA與TBHQ、TQ反應(yīng)的猝滅過程不是由動態(tài)碰撞引起的，而是因為它們之間通過靜態(tài)結(jié)合形成配合物產(chǎn)生的。

2.3.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

對于靜態(tài)猝滅過程，如果生物分子中存在相似的和獨立的結(jié)合位點，則結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點數(shù)(n)可根據(jù)方程(2)求得。

log(F0/F-1)=logKb+nlog[Q]

(2)

式中：Kb為TBHQ/TQ與蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)；n為每個蛋白分子的結(jié)合位點數(shù)。

根據(jù)方程(2)做log(F0/F-1)對log[Q]的雙對數(shù)回歸曲線，相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示。由表3可以看出，BSA-TBHQ、BSA-TQ 3個體系不同溫度下log(F0-F0/F)對log[Q]所做雙對數(shù)回歸曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.98，表明方程(2)的假設(shè)是正確的；在試驗溫度下n的值約為1，表明BSA與TBHQ、TQ的結(jié)合位點數(shù)均僅有1個；結(jié)合常數(shù)約為104L/mol，說明BSA與TBHQ、TQ之間的結(jié)合較為牢固。BSA的主要結(jié)合區(qū)域位于具有相似化學(xué)性質(zhì)的亞結(jié)構(gòu)域IIA(Sudlow’s Site I)和IIIA(Sudlow’s Site II)的疏水腔中。因此，TBHQ和TQ最可能與區(qū)域ⅡA的疏水性空腔相結(jié)合，即212位色氨酸所在的結(jié)合位點附近。

2.3.3 TBHQ、TQ與BSA的結(jié)合方式

一般情況下，小分子與生物分子之間的相互作用力有疏水作用力、靜電作用力、范德華作用力和氫鍵[11]。為了闡明TBHQ、TQ與BSA之間的相互作用，以lnKb對1/T進(jìn)行線性擬合，根據(jù)熱力學(xué)方程(3)、(4)計算其相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)如焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和自由能變(ΔG)，結(jié)果如表4所示。

lnKb=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

式中：Kb為相應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)。如果溫度變化不明顯，ΔH可視為常數(shù)。

由表4中ΔH、ΔS值可得出TBHQ、TQ與生物分子BSA之間相互作用的結(jié)合方式：ΔS>0表明了疏水作用力的存在，這是因為水分子在TBHQ、TQ周圍排列有序，蛋白質(zhì)獲得了1個隨機(jī)結(jié)構(gòu)。ΔH<0且不接近于0表明主要作用力不可能是靜電作用力。當(dāng)有氫鍵結(jié)合時，ΔH<0。因此，TBHQ、TQ與BSA相互作用的主要作用力是疏水作用力與氫鍵。并且由ΔG<0可以得知此反應(yīng)過程是自發(fā)進(jìn)行的。

2.3.4 TBHQ和TQ與BSA之間的能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)Foster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)能夠發(fā)射熒光的供能體與受能體之間的最大距離不超過7 nm，且供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體的紫外吸收光譜有足夠的重疊時，將會發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，從而導(dǎo)致熒光體發(fā)生熒光猝滅[3]。

從圖5中可以看出，TBHQ和TQ的紫外吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜均有一定程度的重疊，因此，根據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論公式(5)、(6)、(7)可求得TBHQ和TQ與BSA的結(jié)合距離r0，即能量轉(zhuǎn)移的距離。

表1 不同溫度下TBHQ/TQ與BSA相互作用的Stern-Vorlmer曲線方程和相關(guān)系數(shù)

表2 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的動態(tài)猝滅常數(shù)(Ksv)、猝滅速率常數(shù)(Kq)

表3 BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的雙對數(shù)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點數(shù)(n)

表4 不同溫度下BSA-TBHQ/BSA-TQ體系的熱力學(xué)參數(shù)

(5)

(6)

(7)

式中：E為能量轉(zhuǎn)移效率；R0為轉(zhuǎn)換能量效率取50%時的臨界距離；r0為能量轉(zhuǎn)移的實際距離；K2為偶極空間取向因子，通常取平均值2/3；φ為沒有能量轉(zhuǎn)移時供能體的熒光量子產(chǎn)率，通常蛋白質(zhì)中取色氨酸的量子產(chǎn)率0.118；n為介質(zhì)的折射率，通常取水和有機(jī)物折射率的平均值1.336；J為供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊，F(xiàn)(λ)為波長從λ到λ±Δλ范圍內(nèi)經(jīng)過矯正的供能體的熒光強度；ε為波長為λ時受能體的吸光系數(shù)。

圖5 TBHQ/TQ的紫外吸收光譜和BSA的熒光光譜疊加圖

通過對波長在300～450 nm范圍內(nèi)供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊部分進(jìn)行積分，求得BSA-TBHQ體系中J為8.92×10-16cm3·L/mol，進(jìn)一步求得E為0.02 nm，R0為1.64 nm，r0為3.13 nm，這與Shahabadi等[3]的研究結(jié)果是一致的。同理，求得BSA-TQ體系中J為2.53×10-15cm3·L/mol，進(jìn)一步求得E為0.02 nm，R0為1.95 nm，r0為3.73 nm。顯然，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系中供能體與受能體的結(jié)合距離r均<7 nm，由此表明BSA到TBHQ和TQ均以能量轉(zhuǎn)移的方式與BSA之間發(fā)生了相互作用。

2.4 構(gòu)象變化

2.4.1 紫外吸收光譜

紫外可見吸收光譜對于檢測絡(luò)合物的形成是一種簡單而有效的方法。在本研究中，以BSA溶液為參比，通過加入不同量的TBHQ、TQ到BSA溶液中，來探索BSA的結(jié)構(gòu)變化(圖6)。

從圖6可以看出，BSA的紫外吸收強度隨著TBHQ、TQ濃度的增加而增加，且擬合曲線的線性關(guān)系較好，這表明BSA與TBHQ、TQ之間形成了結(jié)合較好的復(fù)合物[6]。另外，BSA-TBHQ和BSA-TQ體系紫外吸收光譜的最大吸收峰均發(fā)生紅移，進(jìn)一步說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變。

圖6 不同溫度下BSA與不同濃度TBHQ/TQ作用的紫外吸收光譜(以25 ℃為例)

2.4.2 同步熒光

同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點而常用來探討蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，近年來越來越廣泛地被應(yīng)用在小分子和生物大分子之間相互作用的研究領(lǐng)域中。對于蛋白質(zhì)的同步熒光，Δλ=15 nm時僅表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光，因為不同氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，所以可以根據(jù)發(fā)射波長的改變判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

如圖7、圖8所示，隨著TBHQ和TQ的添加，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時被猝滅，且色氨酸殘基的熒光強度隨TBHQ和TQ添加而降低的程度明顯快于酪氨酸殘基，表明TBHQ和TQ與BSA的結(jié)合位點更接近色氨酸[3]。另外，TQ對色氨酸殘基的熒光猝滅比TBHQ更明顯，表明TQ更容易跟BSA結(jié)合。對于TQ，色氨酸和酪氨酸的最大發(fā)射波長均發(fā)生了微弱的藍(lán)移，表明TQ的加入使BSA中這2種熒光發(fā)射基團(tuán)附近的極性降低，疏水環(huán)境增強，說明構(gòu)象發(fā)生了變化[12]；TBHQ在色氨酸最大波長處發(fā)生藍(lán)移，在酪氨酸最大波長處發(fā)生紅移，表明TBHQ和BSA的相互作用改變了色氨酸殘基和酪氨酸殘基附近的構(gòu)象，使色氨酸殘基基團(tuán)附近的極性降低、疏水環(huán)境增強，酪氨酸殘基集團(tuán)附近的極性增強、疏水環(huán)境減弱。

圖7 BSA與不同濃度TBHQ作用的同步熒光光譜

圖8 BSA與不同濃度TQ作用的同步熒光光譜

3 結(jié)論

采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法研究了TBHQ和TQ與BSA的作用機(jī)制，TBHQ和TQ對BSA的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅，它們分別與BSA以1∶1的結(jié)合方式形成復(fù)合物；TBHQ和TQ與BSA的相互作用力以疏水作用力和氫鍵為主；紫外吸收光譜和同步熒光光譜表明TBHQ和TQ的加入，使得BSA在微環(huán)境中的極性發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生了變化。

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Interaction Among Tertiary Butylhydroquinone and Its Oxidation Product with Bovine Serum Albumin

Li Jun Bi Yanlan Sun Shangde Ding Yiran
(School of Food Science and Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001)

The interactions of tertiary butylhydroquinone(TBHQ)and its oxidation product—tertiary butyl benzoquinone(TQ)with bovine serum albumin(BSA)were investigated by ultraviolet absorption spectrum and fluorescence spectra.The experimental results showed that the interactions of TBHQ and TQ with BSA occurred and new polymers were formed.The quenching mechanisms of BSA with TBHQ and TQ were static quenching procedures.Both binding constants involved in the interaction between TBHQ/TQ and BSA were above 104L/mol,which indicated that the coordination compound of TBHQ and TQ with BSA was firm.The number of both binding sites involved in the interaction between TBHQ/TQ and BSA was 1.Their thermodynamic parameters equation was calculated and showed that ΔHand ΔGwere negative value and ΔSwas positive value,which indicated that hydrogen bond and hydrophobic interactions played major roles in the combination between BSA and TBHQ/TQ.ΔGwas negative value,which indicated that the interaction process was spontaneous.Based on the Forster’s theory of non-radiation energy transfer,the combination distances(r)between the donor(BSA)and acceptor(TBHQ or TQ)were 3.13 and 3.73 nm respectively.The research results of ultraviolet absorption spectrum and synchronous fluorescence spectrum showed the conbination between TBHQ/TQ and BSA induced conformational changes in BSA.

tertiary butylhydroquinone,tertiary butyl benzoquinone,bovine serum albumin ultraviolet absorption spectrum,fluorescence spectra

國家自然科學(xué)基金(31271883)，河南工業(yè)大學(xué)優(yōu)秀學(xué)位論文培育項目(PY201401)

2015-09-23

李軍，男，1989年出生，碩士，脂質(zhì)化學(xué)與品質(zhì)

畢艷蘭，女，1969年出生，教授，脂質(zhì)化學(xué)與品質(zhì)

O657

A

1003-0174(2017)04-0133-08