HSYA與芍藥苷聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)腦組織與血漿CD62P的影響

吳麗彩，余夢黎，廖金明，徐愉林，鄭麗嫻，姚 暉，秦莎莎*，張繼平*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院，廣東佛山528300；2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東湛江524023；3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515；4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東佛山528000；5.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

HSYA與芍藥苷聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)腦組織與血漿CD62P的影響

吳麗彩1，余夢黎2，廖金明3，徐愉林2，鄭麗嫻3，姚 暉4，秦莎莎5*，張繼平4*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院，廣東佛山528300；2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東湛江524023；3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515；4.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東佛山528000；5.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織與血小板活化的影響。方法SPF級雄性SD大鼠，隨機(jī)分為HSYA組（5.0mg·kg-1）、芍藥苷組（5.0mg·kg-1）HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥組（合用組）（各5.0mg·kg-1）、銀杏內(nèi)酯組（5.0mg·kg-1）、模型組和假手術(shù)組。大腦中動脈線栓法復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血1 h再灌注6 h后尾靜脈注射給藥7 d，末次給藥2 h后收集相應(yīng)標(biāo)本保存；蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀（FCM）法檢測全血中P-選擇素(CD62P)含量。結(jié)果HE染色結(jié)果提示，與模型組比較，HSYA、芍藥苷及合用組均能明顯改善急性腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度，以合用組尤為明顯。FCM結(jié)果提示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠全血中CD62P的活化程度顯著增加（p＜0.01）；與模型組相比，合用組與銀杏內(nèi)酯組均能顯著抑制全血中CD62P的活化程度（p＜0.05）；與合用組相比，芍藥苷組全血中CD62P的活化程度顯著增加（p＜0.01），但HSYA組與合用組之間抑制作用無顯著性差異。結(jié)論HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的的海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制可能與抑制CD62P表達(dá)有關(guān)。

HSYA；芍藥苷；血小板活化

腦卒中具有死亡率、發(fā)病率、致殘率和復(fù)發(fā)率高及并發(fā)癥多的特點(diǎn)，約80%的腦卒中屬于缺血性腦卒中［1］。隨著中國人口老齡化的進(jìn)程，急性缺血性腦卒中不僅成為中國第一位死因，且患病率呈上升趨勢及年輕化趨勢［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)［4-6］，羥基紅花黃色素A（HSYA）與芍藥苷單獨(dú)應(yīng)用及二者聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷都具有保護(hù)作用。腦卒中的發(fā)生發(fā)展與血小板的活化密切相關(guān)［7-5］。本文通過改良線栓法復(fù)制局灶性腦缺血再灌注模型，觀察全血中血小板活化標(biāo)記物CD62P活化程度及海馬組織的病理變化，探討HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制與血小板活化的關(guān)系。

1 材料與方法

動物SPF級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)（大學(xué)城）實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0020；SPF級動物飼養(yǎng)環(huán)境由廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SYXK（粵）2012-0125。

1.1 藥物及試劑

HSYA（純度89.5%，成都康邦生物科技有限公司，批號160301）；芍藥苷（純度98%，南京澤朗生物科技有限公司，批號20150723）；銀杏內(nèi)酯注射液（成都百裕科技制藥有限公司，批號08150404）；FITC標(biāo)記的大鼠IgG1、CD62P抗體（批號SC-2855），PE標(biāo)記的大鼠IgG1（SC-2866），均來自美國Santa Cruz公司。

1.2 儀器

流式細(xì)胞儀（美國BD公司），石蠟切片機(jī)（德國徠卡儀器公司），BMJ—A型包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司），普通光學(xué)顯微鏡（蘇州倍特嘉光電科技公司）。

1.3 分組及給藥

SPF雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為6組，每組20只：HSYA組（5.0mg·kg-1）、芍藥苷組（5.0mg·kg-1）、HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥組（合用組）（各5.0 mg·kg-1）、銀杏內(nèi)酯組（5.0 mg·kg-1）、模型組和假手術(shù)組（等量生理鹽水）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，復(fù)制腦缺血再灌注模型。腦缺血1 h再灌注6 h后尾靜脈注射相應(yīng)的藥物給藥7 d，每天1次。

1.4 模型復(fù)制

3%戊巴比妥鈉（3 ml/·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，參照文獻(xiàn)［9］方法沿頸部正中線縱向切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）。使線栓通過CCA分叉部進(jìn)入ICA，結(jié)扎ICA切口和栓線，1 h后抽出栓線，再灌注6 h，造成大腦中動脈栓塞（MCAO）動物模型。假手術(shù)組除了不插線栓，其余同手術(shù)組。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 海馬區(qū)腦組織病理

頸椎脫臼處死大鼠，開顱取腦，參照文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行大鼠腦組織HE染色，光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.2 檢測血漿CD62P含量

大鼠麻醉后，腹主動脈取血2ml于3.8%枸櫞酸鈉抗凝管，取5μl全血分別加入事先置有單抗的流式管內(nèi)，其中對照管（每組兩個(gè)對照管）含Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE各5μl，實(shí)驗(yàn)管含CD61-PE、CD62P-FITC各55μl，室溫暗處孵育20 min，各管在分別加入1ml預(yù)冷（2-8°C）1%多聚甲醛，充分混勻，2-8°C避光放置30min，然后上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）對急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬區(qū)腦組織的影響假手術(shù)組海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯損傷及病變；模型組海馬CA1區(qū)大量液化性壞死，結(jié)構(gòu)不清晰，神經(jīng)細(xì)胞大量壞死，未見正常神經(jīng)元細(xì)胞；與模型組比較，給藥組海馬CA1區(qū)部分細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞皺縮，體積縮小，與周圍細(xì)胞分離，嗜酸性變及凋亡，且HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對腦損傷的改善程度較二者單獨(dú)用藥好，見圖1。

（2）對全血CD62P含量的影響與假手術(shù)組相比，模型組組大鼠全血CD62P的活化程度顯著增加（p＜0.05）；與模型組相比，合用組、銀杏內(nèi)酯組全血CD62P的活化程度顯著降低（p＜0.05）；與合用組相比，HSYA組CD62P活化程度顯著增加（p＜0.05），見表2。

圖1 各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)變化（HE，×400）

表2 HSYA與芍藥苷聯(lián)用對CD62P活化程度的影響（±s，%）

表2 HSYA與芍藥苷聯(lián)用對CD62P活化程度的影響（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，##p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05；與合用組比較&&p＜0.01

組別HSYA組芍藥苷組合用組銀杏內(nèi)酯組模型組假手術(shù)組N 5 6 8 7 9 7 CD62P 0.264±0.123 0.351±0.117&& 0.195±0.147* 0.210±0.128* 0.390±0.106## 0.095±0.051

3 討論

急性腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的生理病理過程，涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥因子釋放、自由基損傷、細(xì)胞凋亡等方面［11］，其中海馬區(qū)細(xì)胞凋亡起著重要的作用。本文采用改良線栓法復(fù)制急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞皺縮，體積縮小，與周圍細(xì)胞分離，嗜酸性變及凋亡，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］，提示HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織病理損傷具有明顯的保護(hù)作用，且優(yōu)于二者單獨(dú)給藥，說明兩者具有協(xié)同作用。

腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，從損傷機(jī)制上看臨床上改善損傷的藥物主要為抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)劑、抗氧化劑等藥物。腦血栓的形成是急性腦梗死常見病因［13］，缺血后的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失，因此利用抗血小板藥物抑制血小板激活，不僅可以預(yù)防血栓的形成，還可以減輕由血小板激活而誘發(fā)的炎癥反應(yīng)［14］；CD62P是目前所知的反映血小板活化與釋放最特異性的標(biāo)志物［15］，CD62P的表達(dá)在促使梗死形成及血小板激活中起著關(guān)鍵性作用，CD62P的表達(dá)量與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)，腦卒中病情好轉(zhuǎn)時(shí)CD62P的表達(dá)量減少甚至不表達(dá)，反之亦然［16］。有報(bào)導(dǎo)腦梗死時(shí)血漿中CD62P的表達(dá)先升后降，但7 d后仍高于正常水平［17-18］，因此通過對CD62P活化程度的檢測不僅可以判斷腦梗死預(yù)后程度，而且還可以同時(shí)指導(dǎo)治療。本文研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給藥7天后，模型組全血中CD62P的活化程度較假手術(shù)組高，表明大鼠體內(nèi)尚有炎癥反應(yīng)及血小板活化，而HSYA組和合用組對CD62P活化具有明顯的抑制作用，且合用組與HYSA組比較無明顯差別，但與芍藥苷相比有明顯的抑制作用，提示抗血小板是HSYA的主要作用［19］，HSYA與芍藥苷聯(lián)用對CD62P的抑制作用亦優(yōu)于芍藥苷單獨(dú)用藥。

綜上所述，HSYA、芍藥苷對急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用各有其側(cè)重點(diǎn)，但二者聯(lián)合用藥卻具有優(yōu)勢互補(bǔ)的作用，HSYA與芍藥苷聯(lián)合用藥對腦缺血再灌注損傷的作用優(yōu)于二者單獨(dú)用藥，其聯(lián)合用藥可能與抑制CD62P的表達(dá)有關(guān)。

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【責(zé)任編輯：鄧軍文 dengjunwen69@126.com】

Effect of HSYA combined with paeoniflorin on hippocampus brain tissue and the expressionof CD62P with cerebral ischemia reperfusion injury in rats

WU Li-cai1,YU Meng-li2,LIAO Jin-ming3,XU Yu-lin2,ZHENG LI-xian3, YAO Hui4,QIN Sha-sha5,ZHANG Ji-ping4

（1.Shunde Hospital,Southern MedicalUniversity,Foshan 528300,China;2.SchoolofPharmacy,GuangdongMedicalUniversity, Zhanjiang524023,China;3.Collegeof TraditionalChineseMedicine,Southern MedicalUniversity,Guangzhou 510515,China; 4.Affiliated Foshan Hospital,Southern MedicalUniversity,Foshan 528000,China;5.Schoolof TraditionalChineseMedicine, Guangdong PharmaceuticalUniversity,Guangzhou 510006,China）

Objective To investigate the effects of HSYA combined with paeoniflorin on brain tissue and the expression of plateletactivation in ratmodelswith cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods Male SPF of SD ratswere randomly divided into HSYA group(5mg·kg-1),paeoniflorin group(5mg·kg-1),combination group HSYA and paeoniflorin(combination group)(5mg·kg-1)and ginkgolidegroup(5mg·kg-1),modelgroup and the sham operation group.The ratmodel ofmiddle cerebral artery occlusion (MCAO)was induced bymodified suturemethod.After 1 h of cerebral ischemia followed by 6 h reperfusion,rats tail intravenous injection for 7 days,to collectand preserve the corresponding index after the lastadministration of2 h;hematoxylin eosin(HE) stainingwasused to observe themorphologicalchangesofnerve cells in the hippocampus;flow cytometry(FCM) assaywasused to observe the P-selectin(CD62P)content in blood.Results The resultsofHE staining showed thatcompared with themodelgroup,HSYA,paeoniflorin and the combination group could obviously improve the damage degree of the neurons in the hippocampus of ratswith acute cerebral ischemia and reperfusion.FCM results showed that compared with sham operation group,the activation degree of CD62P was significantly increased in model group(p＜0.01);compared with the model group,combination group and the degree of activation ofginkgolide groups could significantly inhibit thewhole blood CD62P (p＜0.05);compared with the combined group,the activation degree of CD62P significantly increased in paeoniflorin group(p＜0.01),but between the HSYA group and the combination group had no significant difference inhibition.Conclusion The protectivemechanism ofHSYA combined with paeoniflorin on hippocampalneuronsmay be related to inhibition ofCD62Pexpression on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

HSYA;paeoniflorin;plateletactivation

TS251.1

A

2017-05-12

佛山市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2016AB002981）；廣東省中醫(yī)藥局課題（20162145）；佛山市十三五重點(diǎn)?？祈?xiàng)目（FSZDZ K135025）

吳麗彩（1975-），女，廣東順德人，南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院主管藥師。

*通信作者：秦莎莎（1989-），女，湖北襄陽人，廣東藥科大學(xué)2014級碩士研究生。張繼平（1964-），男，重慶人，南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院研究員。

1008-0171（2017）04-0085-04