運用MLPA技術檢測男性不孕患者Y染色體微缺失的臨床應用

楊帆 林琳 趙克溫

臨床研究

運用MLPA技術檢測男性不孕患者Y染色體微缺失的臨床應用

楊帆 林琳 趙克溫

目的 調(diào)查男性不育患者中Y染色體微缺失的分布頻率及缺失位點。方法 選擇2015年1月至2016年12月上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心收治的110例男性不育患者，抽取外周靜脈血DNA；運用多重鏈接依賴性探針擴增（MLPA）技術檢測Y染色體微缺失情況，分析比較不同缺乏類型組Y染色體缺失率及缺失位點的差異。結果 110例男性不育患者中，有36例檢出存在無精子因子（AZF）區(qū)不同程度微缺失，缺失率為32.7%；其中AZFc區(qū)缺失發(fā)生頻率最高，占總缺失的75.0%（27/36）；Y染色體微缺失患者無精、少精的發(fā)生率更高72.2%（26/36）。結論 男性不育患者尤其是無精癥／少精癥患者Y染色體微缺失發(fā)生率較高，應在治療前進行遺傳檢測及咨詢。

Y染色體微缺失； 多重連接依賴性探針擴增技術； 男性不育

多重連接依賴性探針擴增（MLPA）技術是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和半定量分析的技術，其原理是經(jīng)過探針的雜交、連接、聚合酶鏈式反應（PCR）及毛細管電泳，對多個靶序列的擴增產(chǎn)物量進行相對定量分析。自推出以來，由于其高效檢測基因突變和拷貝數(shù)的能力已廣泛應用于各種分子生物學和遺傳學的研究。本研究應用MLPA技術對男性不育患者Y染色體進行檢測，旨在通過簡單快捷的方法發(fā)現(xiàn)Y染色體異常，調(diào)查Y染色體微缺失的分布以及發(fā)生頻率，為輔助生殖提供必要的遺傳咨詢。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月至2016年12月本院婦產(chǎn)科生殖中心男性不育患者110例，年齡21～47歲，平均（29.9±6.1）歲；排除感染和抗精子抗體陽性等原因造成的不育。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）精液分析標準分為：無精癥（連續(xù)3次精液檢測和睪丸穿刺均未見精子）、少精癥（精子密度＜15×106/mL）和精液正常。

1.2 儀器和試劑 QIAamp Blood DNA Mini基因組DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司；SALSA MLPA的P360-B1 Y染色體微缺失配套試劑盒購自荷蘭MRC-Holland公司；3500xL Dx基因測序儀和ProFlex PCR擴增儀均購自美國應用生物系統(tǒng)公司。1.3 方法

1.3.1 DNA提取 抽取患者2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用QIAamp Blood DNA Mini試劑抽提。

1.3.2 MLPA檢測 P360-B1 Y染色體微缺失試劑盒包含55對探針（130～507nt），針對Y染色體無精子因子（AZF）區(qū)域內(nèi)的多個序列標簽位點（STSs）；其中AZFa區(qū)包括RPS24P1、ARSEP、BPY1等區(qū)域的16個探針，AZFb區(qū)包括RBMY1J、DY2、KDM5D等區(qū)域的15個探針，AZFc區(qū)包括DAZ、BPY2、CDY等區(qū)域的12個探針。根據(jù)試劑盒要求，主要實驗步驟包括：DNA變性（98 ℃變性5 min、25 ℃冷卻）；分子雜交（95 ℃孵育1 min、60 ℃孵育16～20 h）；連接反應（54 ℃15 min、98 ℃ 5 min、20 ℃冷卻）；特異性PCR擴增（95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，共擴增35個循環(huán)，最后72℃延伸20 min，15 ℃冷卻）和擴增產(chǎn)物的片段分析。運用Coffalyser.Net軟件進行MLPA結果分析，比較樣本結果與男性對照的劑量率值（DQ值），即0.8＜DQ＜1.2 為正常。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，組間缺失差異采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 男性不育患者中Y染色體微缺失位點及分布在110例男性不育患者中，共檢測到36例患者存在Y染色體微缺失，缺失率為32.7%，主要涉及AZF的3個區(qū)域，其中AZFa缺失2例，缺失率為5.6%；AZFb缺失2例，缺失率為5.6%；AZFc缺失27例，缺失率為75.0%；AZFbc缺失3例，缺失率為8.3%；AZFac和AZFabc缺失各1例，缺失率均為2.7%。見表1。

表1 36例存在Y染色體微缺失患者的位點分布

2.2 無精癥和少精癥患者中Y染色體微缺失情況在110例男性不育患者中無精癥患者43例，少精癥患者24例，分別存在單純?nèi)笔?、單純重復和重?缺失3種缺失類型。在檢測到Y染色體微缺失的36例患者中，無精癥和少精癥患者占26例，缺失率為38.8%（26/67），精子正常組中占10例，缺失率23.3%（10/43），無精癥和少精癥組患者Y染色體微缺失率高于精子正常組（P＜0.5）。見表2，圖1。

表2 不同缺失類型的不同臨床表現(xiàn)

注：A為正常Y染色體；B為Y染色體缺失；C為Y染色體重復圖1 MLPA方法檢測Y染色體微缺失結果

3 討論

Y染色體長臂上與精子發(fā)生密切相關的區(qū)域被稱為AZF，分為AZFa、AZFb、AZFc 3個區(qū)域，區(qū)域基因片段缺失、重復是導致男性原發(fā)性不育的遺傳病因之一［1］。Y染色體微缺失的發(fā)生率是僅次于克氏綜合征的第二位遺傳因素，常規(guī)基因檢測是無精癥、少精癥診斷流程中的重要組成部分［2］。其中AZFc的缺失出現(xiàn)較多的表現(xiàn)型，包括唯支持細胞綜合征（SCOS）、無精癥、少精癥等。本研究結果表明，在Y染色體微缺失患者中AZFc缺失率最高為75.0%，AZFa和AZFb的缺失率分別為5.6%，5.6%，AZFbc的缺失率為8.3%，與國內(nèi)外報道的AZFc區(qū)是主要缺失區(qū)域相符，缺失率略高于60%。對于AZFc微缺失是否會直接導致男性不育，多篇文獻報道存在不同見解［3-5］。AZFc區(qū)缺失患者可通過睪丸穿刺獲得精子，但是否會影響卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術（ICSI）治療效果、影響胚胎質量，目前也還存在爭議［6-7］。此外，本研究結果中發(fā)現(xiàn)，AZF區(qū)域內(nèi)存在單個基因缺失，例如AZFa區(qū)的USP9Y、AZFc區(qū)的DAZ2。有文獻報道，USP9Y基因缺失的攜帶者表型差異巨大，提示此基因在精子生成過程中更多的是協(xié)調(diào)而非決定性的作用［8］。

本研究選用的Y染色體微缺失試劑可以同時檢測AZF的多個區(qū)域，可以有效檢測出插入的串聯(lián)重復序列。結果顯示，在Y染色體微缺失的36例患者中，無精癥和少精癥患者的Y染色體缺失率為38.8%（26/67），高于精子正常組的Y染色體缺失率23.3%（10/43）。該數(shù)值與相關報道中顯示的在無精癥和少精癥患者中Y染色體微缺失率介于1%～55%［9］相符。缺失率的范圍較大可能是因為每個研究的序列標簽位點（STS）引物選擇不同，也有可能與人種、遺傳背景、環(huán)境等因素有關［10］。

目前，性染色體異常的臨床診斷主要依賴于核型分析，但核型分析操作繁瑣、檢測周期較長；而熒光原位雜交（Fish）雖有高分辨率，但受其檢測范圍限制，對于微小的染色體缺失仍難以檢測。MLPA技術的局限性在于不能檢測染色體的平衡易位、不適合檢測未知的點突變等。但是，MLPA技術憑借其檢測通量大、重復性好、效率高等優(yōu)點可成為簡單、便捷的篩查手段之一。通過增加MLPA檢測平臺，男性不育患者的診斷體系得到了很大程度的完善，可根據(jù)缺失區(qū)域為患者制定合理的治療方案提供依據(jù)，為輔助生殖提供遺傳咨詢。

1 Papachristou GI， Muddana V， Yadav D， et al. Comparison of BISAP， Ranson's， APACHE-II and CTSI scores in predicting organ failure， complications， and mortality in acute pancreatitis ［J］. Am J Gastroenterol，2010，105（2）：435-441； quiz 442.

2 楊卓，郭野，李宏軍，等. EAA/EMQN Y染色體微缺失分子診斷應用指南解讀［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2015，38（7）：454-456.

3 Fernandes S， Huellen K， Goncalves J， et al. High frequency of DAZ1/ DAZ2 gene deletions in patients with severe oligozoospermia［J］. Mol Hum Reprod，2002，8（3）：286-298.

4 Zhang F， Li Z， Wen B， et al. A frequent partial AZFc deletion does not render an increased risk of spermatogenic impairment in East Asians ［J］. Ann Hum Genet，2006，70（Pt 3）：304-313.

5 Giachini C， Guarducci E， Longepied G， et al. The gr/gr deletion（s）：a new genetic test in male infertility? ［J］. J Med Genet，2005，42（6）：497-502.

6 Van Golde RJ， Wetzels AM， de Graaf R， et al. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic men with microdeletions in the azoospermia factor c region of the Y chromosome［J］. Hum Reprod，2001，16（2）：289-292.

7 吳畏，周作民，林敏，等. Y染色體微缺失患者與無精子或嚴重少弱精子癥患者ICSI治療結局比較［J］.中華男科學雜志，2011，17（9）：771-774.

8 Tyler-Smith C， Krausz C. The will-o'-the-wisp of genetics—hunting for the azoospermia factor gene ［J］. N Engl J Med，2009，360（9）：925-927.

9 Mittal RD， Singh G， Srivastava A， et al. Y chromosome microdeletions in idiopathic infertility from Northern India ［J］. Ann Genet，2004，47（4）：331-337.

10 王燕，林元，黃海龍，等.特發(fā)性不育患者Y染色體AZF微缺失篩查及表型分析［J］.中國計劃生育學雜志，2015，23（12）：819-821.

（本文編輯：李銀平）

Clinical application and research of MLPA technology to detect Y chromosome microdeletions

Yang Fan1, Lin Lin1, Zhao Kewen2.1Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 200025 Shanghai, China2Department of Pathophysiology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 200025 Shanghai, China

Objective To investigate Y chromosome microdeletions and their distribution characteristics among the male infertile patients. Methods 110 male infertility patients admitted to Reproductive Center of Obstetrics and Gynecology in Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine from January 2015 to December 2016 were Selected . The DNA was extracted from peripheral venous blood. Y chromosome microdeletion was detected by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). The frequency and site of Y chromosome microdeletions were compared between azoospermia and oligospermia patients . Results Y chromosome microdeletions were found in 36 cases (32.7%) in 110 infertile patients . Microdeletion of AZFc region was the most frequent it was 75.0% of all microdeletions (27/36). The azoospermic and oligospermic incidence was higher in patients with Y chromosome microdeletions 72.2% (26/36). Conclusion The occurrence of Y chromosome microdeletions is higher in azoospermic and oligospermic patients, it is necessary for them to have the genetic detection and the genetic counsel before performing treatments.

Y Chromosome Microdeletion; Multiplex ligation-dependent probe amplification; Male Infertility

200025 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科（楊帆 林琳）200025 上海，上海交通大學醫(yī)學院病理生理教研室（趙克溫）

趙克溫，Email：zkewen@shsmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.01.004

2017-01-18）