蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌活性物質(zhì)的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

甄 偉,袁艮霞,王 惠,黃麗麗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院， 陜西楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌活性物質(zhì)的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

甄 偉1,3,袁艮霞1,3,王 惠1,黃麗麗2,3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院， 陜西楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

為探索蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsamali) 野生型菌株03-8產(chǎn)生的活性物質(zhì)及其與致病性的關(guān)系，在以蔗糖為碳源的MS液體培養(yǎng)基中25 ℃靜置培養(yǎng)20 d，利用大孔樹(shù)脂吸附、二氯甲烷萃取、薄層層析和高效液相色譜等手段分離純化，1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、HMQC譜對(duì)純化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并測(cè)定其生物活性。最終分離得到一個(gè)化合物D-2；結(jié)構(gòu)鑒定為1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇；該化合物1 mg/mL的丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液不能在煙草和蘋(píng)果葉片上引起壞死斑，但對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用。

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌；提取分離；鑒定；抑菌活性

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病(Apple valsa canker)是由蘋(píng)果黑腐皮殼屬真菌Valsamali引起的蘋(píng)果病害[1-2]。目前，控制蘋(píng)果腐爛病害主要是采用刮除受感染樹(shù)皮和涂抹殺菌劑的方法[3-4]。但是，效果不佳，主要原因是目前對(duì)該病菌的致病機(jī)理了解甚少。因此，探究蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)及其與致病性的關(guān)系具有重要意義。

關(guān)于蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌活性代謝產(chǎn)物的研究主要集中在果膠酶方面[5-8]。關(guān)于小分子的活性物質(zhì)，目前只有Okuno等從該病菌的MS培養(yǎng)發(fā)酵液中提取分離出五種異香豆素物質(zhì)[9]。關(guān)于其他結(jié)構(gòu)類型的小分子物質(zhì)當(dāng)前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用蔗糖為碳源的液體培養(yǎng)基對(duì)野生型蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌03-8的發(fā)酵濾液進(jìn)行提取分離和純化，對(duì)純物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)其生物活性進(jìn)行測(cè)定，旨在獲得新的活性相關(guān)物質(zhì)，為進(jìn)一步了解蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

供試菌種：蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsamali)野生型菌株03-8和枯草芽孢桿菌(EDR4)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室提供，4 ℃保存。

液體培養(yǎng)基：參照Okuno等[9]的MS培養(yǎng)基的配制方法，以蔗糖(質(zhì)量濃度5 g/L)代替其中的淀粉(質(zhì)量濃度10 g/L)，其他成分不變。

1.2 試劑與儀器

儀器：WD-9403A型熒光-紫外分析儀，北京市六一儀器廠； AVANCE III型核磁共振儀(500 MHz)，瑞士Bruker BioSpin 公司；高效液相色譜儀(JYD07J308)，日本島津公司；柱色譜層析硅膠，青島海洋化工有限公司；硅膠G，青島海洋化工有限公司；XAD-2型大孔吸附樹(shù)脂，美國(guó)Sigma Aldrich公司。

試劑：氯仿、甲醇、乙酸乙酯、石油醚等均購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，均為分析純；氘代氯仿購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.3 發(fā)酵濾液制備

將蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌野生型菌株03-8接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣的幼嫩菌絲處打菌餅(6 mm)，將菌餅接種于配好的液體培養(yǎng)基中，每330 mL培養(yǎng)液放置15個(gè)菌餅。接種后將三角瓶置于25 ℃恒溫室靜置培養(yǎng)20 d，每隔12 h手動(dòng)搖動(dòng)1次。將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行離心，上清依次用濾紙、0.45微米濾膜、0.22微米濾膜抽濾去除菌體，所得濾液即為發(fā)酵濾液。

1.4 提取分離

將預(yù)處理的大孔樹(shù)脂XAD-2與發(fā)酵濾液混合，體積比為1∶3，在20 ℃、120 r/min搖床振搖10 h，使發(fā)酵濾液充分吸附于樹(shù)脂上。將上述吸附后的大孔樹(shù)脂裝柱，依次以V(水)∶V(甲醇)(100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100)為洗脫劑洗脫，洗脫劑體積用量為樹(shù)脂體積的3倍，流速約1 mL/min，得5個(gè)餾分段(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，通過(guò)稱量確定各餾分段的含量，以含量較高的餾分段進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

對(duì)餾分Ⅳ的水溶液用二氯甲烷進(jìn)行萃取，濃縮得到二氯甲烷相，對(duì)二氯甲烷相進(jìn)行硅膠制備薄層層析分離，展開(kāi)劑為氯仿+甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1]，得到10個(gè)組分(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)；D組分進(jìn)一步用制備液相色譜分離，得到物質(zhì)D-2。

1.5 生物活性測(cè)定

1.5.1 致病活性測(cè)定 分別在煙草葉片和蘋(píng)果葉片上對(duì)化合物D-2進(jìn)行致病活性檢測(cè)。在煙草葉片上采用注射接種法。將1 mg/mL的D-2丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液20 μL從煙草葉片背面注入，放置 2 d 后觀察致病情況。每處理重復(fù)3次，設(shè)置丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]對(duì)照。在蘋(píng)果葉片上采用針刺法。選取枝條前端完全展開(kāi)的葉片，用無(wú)菌水沖洗晾干，用滅菌脫脂棉包裹葉柄基部，脫脂棉上滴加無(wú)菌水保濕，接種針刺傷，傷口處滴加1 mg/mL的D-2丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液20 μL，保鮮膜密封保濕，放置 2 d 后觀察致病情況。每處理重復(fù)3次，設(shè)置丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]對(duì)照。

1.5.2 抑菌活性測(cè)定 以枯草芽孢桿菌EDR4為指示菌對(duì)化合物D-2進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。取1 mg/mL 的D-2丙酮溶液20 μL加入50 mL的LB培養(yǎng)基中，以丙酮作對(duì)照；在5 mL的LB培養(yǎng)基中加入50 μL的枯草芽孢桿菌EDR4種子液，28 ℃、180 r/min搖培，4、8和12 h后分別檢測(cè)其OD值，并利用統(tǒng)計(jì)軟件Spass進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物D-2的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物D-2：紫外254 nm下有熒光吸收。1H-NMR(500 MHz，CDCl3-d6) δ:3.73 (1H,dd,J = 11.2,8.2 Hz)，3.83 (1H,dd,J = 11.2,3.5Hz)， 4.89 (1H,dd,J = 8.2,3.7 Hz)，5.32 (1H,d,J = 10.7 Hz)，5.82 (1H,d,J = 17.6 Hz)，6.77 (1H,dd,J = 17.5,11.0 Hz)，7.25(1H,d,7.4)，7.38 (1H,d,J = 7.4,7.6 Hz),7.40(1H,d,J = 7.6 Hz),7.47 (1H,s);13C-NMR(500 MHz，CDCl3-d6)δ：68.09 (C-1*),74.63(C-2*),114.32 (C-8),123.91 (C-2),125.50 (C-4),125.89 (C-6),128.76 (C-5),136.61 (C-7),137.98 (C-3),140.84 (C-1); Dept135 δ：正峰：74.63,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61；負(fù)峰：68.09,114.32。

對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知，化學(xué)位移在114.32,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61,137.98,140.84的碳原子，表明該化合物含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)以及1個(gè)碳碳雙鍵；7.25(1H,d,7.4)，7.38 (1H,d,J = 7.4,7.6 Hz),7.40(1H,d,J=7.6 Hz),7.47 (1H,s)表明苯環(huán)為1,3雙取代，5.32 (1H,d,J = 10.7 Hz)，5.82 (1H,d,J=17.6 Hz)，6.77 (1H,dd,J = 17.5,11.0 Hz)表明存在1個(gè)-CH=CH2。根據(jù)Dept135及13C-NMR可知化學(xué)位移74.63,123.91,125.50,125.89,128.76,136.61為伯碳和叔碳，68.09,114.32 為仲碳，137.98,140.84碳為季碳。綜上所述化合物D-2為1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇(圖1)。

圖1 1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇Fig.1 1-(3′-ethenylphenyl)-1,2-ethanediol

2.2 化合物D-2的生物活性

2.2.1 化合物D-2的致病活性 對(duì)化合物D-2在煙草葉片上進(jìn)行的生物活性測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品組和對(duì)照組無(wú)明顯差異。表明化合物D-2對(duì)煙草葉片沒(méi)有明顯致病活性；采用針刺法檢測(cè)化合物D-2對(duì)蘋(píng)果葉片的致病活性試驗(yàn)中，樣品組和對(duì)照組的個(gè)別處理雖然表現(xiàn)出微小差異，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果差異不顯著，表明化合物D-2對(duì)蘋(píng)果葉片沒(méi)有致病活性。分析認(rèn)為雖然化合物D-2分離自蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的發(fā)酵液中，但并非是該病菌的直接致病活性物質(zhì)。

2.2.2 化合物D-2的抑菌活性 以丙酮為對(duì)照，將化合物D-2加入接有枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液中，對(duì)化合物D-2進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，化合物D-2在與枯草芽孢桿菌接觸4 h時(shí)與對(duì)照組現(xiàn)象一樣，枯草芽孢桿菌均未生長(zhǎng)。而在接觸8 h后，對(duì)照發(fā)酵液的OD值明顯高于加有D-2發(fā)酵液的OD值，12 h兩者的區(qū)別更加明顯，表明化合物D-2對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用?？莶菅挎邨U菌是對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌有抑制作用的生防菌，本試驗(yàn)分離到的D-2源于野生型蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的發(fā)酵液，對(duì)其生防菌有抑制作用，推測(cè)這是蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)生的抵抗逆境的防御性活性物質(zhì)。

誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著性(P<0.05)。

Error bars represent SD,and different letters indicate significant difference (P<0.05).

圖2 D-2對(duì)枯草芽胞桿菌的活性曲線
Fig.2 Antibacterial activities of D-2 to Bacillus subtilis

3 討 論

本研究首次在蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的發(fā)酵液中分離得到化合物D-2，結(jié)構(gòu)分析確定為1(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇。查閱資料發(fā)現(xiàn)，以前在樹(shù)木病害的致病菌中尚未見(jiàn)報(bào)道。該化合物存在1個(gè)手性碳原子，試驗(yàn)中尚未確定該手性碳原子的構(gòu)型。

關(guān)于1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇曾有文獻(xiàn)報(bào)道在擔(dān)子菌中存在。 (1S)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇于2007年在牛肝菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)[10]；(1R)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇于2013年在木蹄菌的子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)[11]，但對(duì)其生物學(xué)功能并不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇對(duì)煙草葉片和蘋(píng)果葉片沒(méi)有致病活性，表明其不是該病菌的直接致病活性物質(zhì)，但其對(duì)枯草芽胞桿菌EDR4有抑制作用，文獻(xiàn)[11]也報(bào)道(1R)-(3-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇對(duì)枯草芽胞桿菌(ATCC 6633)有抑制作用。

枯草芽孢桿菌是對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌有抑制作用的生防菌[12-13]，從蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌發(fā)酵液中分離得到的乙二醇對(duì)其有一定抑制作用，推測(cè)可能是蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌在進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)環(huán)境，保護(hù)自身生存，與其他生物競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。這種物質(zhì)的存在可能是蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌能順利侵染寄主而致病的原因。因此可以推測(cè)，在蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治中如果增加抑制該物質(zhì)產(chǎn)生的途徑，應(yīng)該能增強(qiáng)枯草芽孢桿菌的防治效果。

由于試驗(yàn)分離得到的活性物質(zhì)量的限制，尚未對(duì)該化合物進(jìn)行其他生物活性檢測(cè)，該化合物是否在蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌代謝過(guò)程中還有其他作用有待進(jìn)一步研究。

Reference：

[1] WANG X L,WEI J L,HUANG L L,etal.Re-evaluation of pathogens causing Valsa canker on apple in China[J].Mycologia,2011,103(2):317-324.

[2] KE X W,HUANG L L,HAN Q M,etal.Histological and cytological investigations of the infection and colonization of apple bark byValsamalivar.mali[J].AustralasianPlantPathology,2012,42(1):85-93.

[3] YIN Z Y,LIU H Q,LI ZH P,etal.Genome sequence ofValsacanker pathogens uncovers a potential adaptation of colonization of woody bark[J].TheNewphytologist,2015,208(4):1202-1216.

[4] YIN Z Y,KE X W,KANG ZH SH,etal.Apple resistance responses againstValsamalirevealed by transcriptomics analyses[J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology,2016,93:85-92.

[5] 王 娟,馬 強(qiáng),庒 霞,等.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌分泌物中果膠酶的測(cè)定[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2009(4):39-40.

WANG J,MA Q,ZHUANG X,etal.Determination of pectinase in fungi secretion of apple tree canker[J].InnerMongoliaAgricultural,2009(4):39-40(in Chinese with English abstract).

[6] 何媛媛,于 哲,王海英,等.不同碳氮源對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌胞外果膠酶活性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,42(11):81-86.

HE Y Y,YU ZH,WANG H Y,etal.Effects of different carbon and nitrogen sources on activity of extracellular pectinase ofValsamalivar.mali[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2014,42(11):81-86(in Chinese with English abstract).

[7] 劉福昌,李美娜,王永洤.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌致病因素—果膠酶的初步探討[J].中國(guó)果樹(shù),1980(4):45-48.

LIU F CH,LI M N,WANG Y Q.Apple tree canker’s pathogenic factors: preliminary discuss to pectinase[J].ChinaFruits,1980(4):45-48(in Chinese).

[8] KE X W,YIN Z Y,SONG N,etal.Transcriptome profiling to identify genes involved in pathogenicity ofValsamalion apple tree[J].FungalGeneticsandBiology,2014,68:31-38.

[9] OKUNO T,OIKAWA S,GOTO T,etal.Structures and phytotoxicity of metabolites fromValsaceratosperma[J].AgriculturalandBiologicalChemistry,1986,50(4):997-1001.

[10] YANG W Q,QIN X D,SHAO H J,etal.New phenyl-ethanediols from the culture broth ofBoletusedulis[J].JournalofBasicMicrobiology,2007,47(2):191-193.

[11] ZHAO J Y,DING J H,LI ZH,etal.Three new phenyl-ethanediols from the fruiting bodies of the mushroomFomesfomentarius[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2013,15(3):310-314.

[12] 王衛(wèi)雄,徐秉良,薛應(yīng)鈺,等.蘋(píng)果樹(shù)腐爛病拮抗細(xì)菌鑒定及其抑菌作用效果測(cè)定[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,22(10):1214-1221.

WANG W X,XU B L,XUE Y Y,etal.Identification and antifugla activity of the antagonistic bacteria ofCytosporaspp[J].ChineseJournalofEco-Agriculture,2014,22(10):1214-1221(in Chinese with English abstract).

[13] 楊阿麗,陳佰鴻,毛 娟,等.生物藥劑和化學(xué)藥劑對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的抑制效應(yīng)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31(16):173-181.

YANG A L,CHEN B H,MAO J,etal.Inhibition effect of chemicals and biological fungicides on theValsaceratosperma[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2015,31(16):173-181(in Chinese with English abstract).

(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Isolation and Structural Identification of Pathogenic Substance fromValsamali

ZHEN Wei1,3,YUAN Genxia1,3,WANG Hui1and HUANG Lili2,3

(1.College of Science,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 3.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to explore the bioactive substances of the wide typeValsamali03-8 and its effects in pathogenic process,the pathogen was fermented in sucrose-carbon-source liquid media for 20 days at 25 ℃. Cultural filtrate obtained by filtration was adsorbed to the macroporous resin and eluted by different ratio of methanol and water. Then,the fractions were extracted by dichloromethane. The dichloromethane phase was separated and purified by thin layer chromatography and HPLC. The structure was elucidated by1H-NMR,13C-NMR,DEPT135 and HMQC spectra. Its biological activities were tested. Finally,a compound D-2 identified as 1-(3′-ethenylphenyl)-1,2-ethanediol was obtained.1 mg/mL of this compound in acetone water solution [V(acetone)∶V(water)=1∶4]showed antibacterial activities to Bacillus subtilis,but had no bioactivity to tobacco leaves and apple leaves.

Valsamali；Extraction and separation；Identification；Antimicrobial activity

2016-04-25 Returned 2016-06-30

National Special Fund for Agro-scientific Research in the Publich Interests(No.201203034).

ZHEN Wei,male,master student.Research area:natural products.E-mail:zhenweiwy@163.com

WANG Hui,female,professor,master supervisor.Research area:natural products.E-mail:wanghuiab@sina.com

日期：2017-06-05

2016-04-25

2016-06-30

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203034)。 第一作者：甄 偉，男，在讀碩士，從事天然產(chǎn)物的研究。E-mail：zhenweiwy@163.com 通信作者：王 惠，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：wanghuiab@sina.com

S436.611.1+1

A

1004-1389(2017)06-0946-04

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