IMPDH基因克隆、生物信息學(xué)分析及在牦牛卵巢不同時(shí)期中的差異表達(dá)

熊顯榮，蘭道亮，胡嘉嘉，李 鍵，字向東

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

IMPDH基因克隆、生物信息學(xué)分析及在牦牛卵巢不同時(shí)期中的差異表達(dá)

熊顯榮1，蘭道亮2，胡嘉嘉1，李 鍵1，字向東1

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041)

旨在獲得牦牛IMPDH基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析其在卵巢組織中的時(shí)序表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究卵巢生長(zhǎng)發(fā)育及排卵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆牦牛的IMPDH基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析不同物種序列進(jìn)化關(guān)系，利用熒光定量qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)IMPDH基因在不同發(fā)育時(shí)期牦牛卵巢組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，克隆得到牦牛1 623 bp 的IMPDH基因cDNA 序列，內(nèi)含1 545 bp開放閱讀框序列，編碼514個(gè)氨基酸殘基。與野牦牛的相應(yīng)序列具有很高的同源性(99.4%)，表明IMPDH基因在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示IMPDH基因的表達(dá)隨年齡的增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。熒光定量qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示IMPDH基因在卵巢卵泡期表達(dá)最強(qiáng)，顯著高于紅體形成期。結(jié)果表明IMPDH參與牦牛卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育，并在卵巢活動(dòng)中有明顯的表達(dá)規(guī)律，表明IMPDH基因在牦牛繁殖周期具有重要作用，為進(jìn)一步研究牦牛IMPDH基因功能奠定基礎(chǔ)。

牦牛；克??；IMPDH；序列分析；差異表達(dá)

牦牛(Bosgrunniens) 是一個(gè)特有且珍貴的畜種，主要分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)，中國(guó)約占世界牦?？倲?shù)的95%[1]。在長(zhǎng)期的人工選擇和自然選擇作用下，牦牛對(duì)高寒草地生態(tài)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能在嚴(yán)寒、低氧、強(qiáng)紫外線輻射的惡劣環(huán)境條件下生存和繁衍后代，成為當(dāng)?shù)啬撩褓囈陨娴纳a(chǎn)和生活資料，也是主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一[2]。此外，牦牛是中國(guó)動(dòng)物遺傳資源中寶貴的基因庫(kù)和珍稀的物種。但是牦牛存在生長(zhǎng)速度慢、繁殖速率低、生產(chǎn)性能差，成為牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展及生態(tài)保護(hù)的主要瓶頸之一[3]。加快牦牛的選育育種進(jìn)程，解析繁殖機(jī)制，提高牦牛生產(chǎn)性能，對(duì)牦牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。因此，隨著牦牛基因組測(cè)序工作的完成，開展牦牛生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖性能等方面的研究，有助于挖掘牦牛優(yōu)良特性和促進(jìn)民族地區(qū)發(fā)展[2]。

卵巢組織是決定哺乳動(dòng)物繁殖效率的重要器官之一，主要生理功能包括合成相關(guān)的生殖激素與排出成熟的卵母細(xì)胞，而其功能的維持和發(fā)揮主要依賴于多種信使的傳遞和調(diào)控[4]。卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟是一個(gè)極其復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，除了需要具有較好發(fā)育能力的卵母細(xì)胞外，還需要許多信號(hào)分子的參與，如內(nèi)分泌激素、免疫和代謝信號(hào)以及來(lái)自體細(xì)胞分泌的各種調(diào)控因子[5]。哺乳動(dòng)物卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育主要經(jīng)歷四個(gè)階段：發(fā)生期——主要發(fā)生于胎兒期，由原始生殖細(xì)胞分化形成初級(jí)卵原細(xì)胞，停滯于減數(shù)分裂前期，出生后不再產(chǎn)生新的卵母細(xì)胞；發(fā)展期——隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)-垂體-下丘腦-卵巢軸的形成，第一波優(yōu)勢(shì)卵泡進(jìn)入排卵程序，隨后逐漸成熟；成熟期——進(jìn)入成年后每個(gè)周期有一個(gè)(單胎動(dòng)物)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟并排卵，整個(gè)卵泡發(fā)育過(guò)程中伴隨大量卵泡的凋亡閉鎖；衰退老化期——由于卵巢儲(chǔ)備的不可再生性，生育能力逐漸下降，直至完全喪失生育能力[6]。卵巢的生長(zhǎng)發(fā)育與排卵過(guò)程是受旁分泌、內(nèi)分泌和自分泌等作用共同協(xié)調(diào)的。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從分子水平和基因水平等方面解析哺乳動(dòng)物卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育和排卵過(guò)程，旨在為進(jìn)一步理解卵巢發(fā)育和排卵過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)，為動(dòng)物繁殖的調(diào)控、家畜繁殖力的提高、瀕危珍貴動(dòng)物的拯救和卵巢功能老齡化疾病的治療等提供新思路。

前期研究表明，次黃嘌呤核苷酸脫氧酶(IMPDH)在哺乳動(dòng)物卵巢生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中起重要作用[7]。IMPDH是生物嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶，在NAD的環(huán)境下將次黃嘌呤核苷酸(IMP)氧化合成黃嘌呤核苷酸(XMP)。在硫唑嘌呤代謝過(guò)程中，IMPDH是催化生成鳥嘌呤核苷酸的限速酶，其活性與鳥嘌呤核苷酸濃度可能存在負(fù)相關(guān)[8]。此外，IMPDH是細(xì)胞內(nèi)嘌呤代謝的活性物質(zhì)，活性與細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，因此該酶可以作為治療實(shí)體器官移植的潛在靶點(diǎn)[9]。IMPDH表型由IMPDH基因型決定。IMPDH有兩種亞型：IMPDHⅠ和IMPDHⅡ，分別由位于染色體7和染色體3的基因 IMPDH1和 IMPDH2編碼，具有84%的同源性，大小相似且分子質(zhì)量均為56 ku，共由514個(gè)氨基酸殘基組成[9]。在免疫激活的情況下，IMPDH基因表達(dá)明顯上調(diào)[10]。IMPDHⅠ結(jié)構(gòu)性表達(dá)于所有細(xì)胞，而IMPDHⅡ表達(dá)于部分細(xì)胞，與細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[9, 11]。

目前關(guān)于IMPDH基因的研究主要集中在小鼠、豬、斑馬魚等動(dòng)物[4,6,12]，在牦牛上還未見報(bào)道。IMPDH在物種進(jìn)化中相對(duì)保守，但也存在種間差異性。因此，本研究以牦牛卵巢組織為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)克隆得到IMPDH基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)牦牛IMPDH基因特征進(jìn)行分析，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)IMPDH基因在不同發(fā)育階段的牦牛卵巢組織中的表達(dá)差異，利用熒光定量qRT-PCR分析IMPDH基因在成年空懷牦牛卵巢組織不同活動(dòng)期的表達(dá)。研究結(jié)果為探討IMPDH基因在牦牛卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育和排卵機(jī)制中的生物學(xué)作用提供重要的理論依據(jù)，為建立有效可靠的分子遺傳標(biāo)記等奠定基礎(chǔ)，對(duì)改善牦牛的遺傳資源和繁殖技術(shù)具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

TRIZOL試劑購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Ferments公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自天根公司； pMD-20T載體和2×SYBR Green premix購(gòu)自TAKARA公司；感受態(tài)DH5ɑ和DNA片段回收純化試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；熒光定量PCR儀、普通PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

牦牛組織樣品均采集于四川成都青白江區(qū)屠宰場(chǎng)，試驗(yàn)動(dòng)物為健康的空懷期成年母牦牛，屠宰后以牙齒和年輪為依據(jù)，分別采集2歲、3歲和6歲的卵巢組織。此外，以胎牛臂長(zhǎng)為依據(jù)，分別采集3月齡、6月齡和9月齡的胎牛卵巢組織。所有樣品經(jīng)過(guò)PBS清洗后迅速放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存，備用。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol試劑盒提取卵巢組織樣本的總RNA。并用RNase-free的DNaseⅠ處理，以去除DNA污染。RNA的質(zhì)量和含量通過(guò)Nanodrop ND-1000檢測(cè)吸光度A260 nm/A280 nm進(jìn)行判定，完整性通過(guò)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。取2 μL(1 g/L)RNA，0.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL oligo(dT)18，2 μL Buffer，及ddH2O加至10 μL，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 牦牛IMPDH基因的克隆與測(cè)序

以牦牛卵巢組織cDNA為模板，引物為IMPDH-p(表1)，擴(kuò)增體系為25 μL，預(yù)期擴(kuò)增片段為1 623 bp。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen的凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，取適量純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD-20T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，至少挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆送往生工生物工程上海(股份)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 牦牛IMPDH基因生物信息學(xué)分析

采用ORF Finder在線程序確定牦牛IMPDH基因開放閱讀框；利用MEGA和DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列同源性分析、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；NCBI預(yù)測(cè)基因生物功能結(jié)構(gòu)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)；利用在線軟件ExPASy分析根據(jù)基因序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量等理化性質(zhì)；利用Interpro在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)；應(yīng)用Hopfield和SWISSMODEL軟件分別預(yù)測(cè)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)IMPDH基因在不同發(fā)育階段牦牛卵巢組織中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)IMPDH基因在不同發(fā)育階段牦牛胎兒卵巢及成年卵巢組織中的表達(dá)情況。取不同時(shí)期胎兒卵巢(3月齡、6月齡和9月齡)和不同年齡的成年空懷卵泡期牦牛卵巢(2、3和6周歲)組織?？俁NA的提取及反轉(zhuǎn)錄同“1.3”，IMPDH和GAPDH基因PCR擴(kuò)增體系為25 μL，反應(yīng)條件：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，IMPDH-q和GAPDH-q上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。25 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.7 qRT-PCR定量分析IMPDH基因在卵巢活動(dòng)中的表達(dá)

以IMPDH為研究對(duì)象，以管家基因GAPDH為內(nèi)參分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用SYBR Green Ⅱ熒光定量qRT-PCR分析成年空懷母牛卵巢活動(dòng)中的IMPDH基因mRNA相對(duì)表達(dá)豐度。所有反應(yīng)均重復(fù)3次，20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green premix，上、下游引物各0.8 μL (10 pmol/mL)，模板2 μL 以及ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為95 μC 30 s；95 μL 10 s；55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。65～95 ℃每隔 0.5 ℃讀板1次，繪制擴(kuò)增和熔解曲線。分析各基因的熔解曲線并電泳鑒定PCR產(chǎn)物。結(jié)果采用2-△△Ct 法進(jìn)行相對(duì)定量分析目的基因mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件Table 1 Primer sequences and PCR reaction conditions

注：p代表RT-PCR，q代表qRT-PCR；F為正義鏈引物，R為反義鏈引物。

Note: p and q represent RT-PCR and qRT-PCR, respectively; F and R represent forward and reverse primer, respectively.

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

所有組別的試驗(yàn)都至少重復(fù)3次。采用SPSS 19.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。mRNA相對(duì)表達(dá)豐度等采用ANOVA方差分析和Tukey’s LSD檢驗(yàn)，所有結(jié)果當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著。數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean ± SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛IMPDH基因序列特征

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的片段(圖1)。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證得到1 623 bp的牦牛IMPDH基因序列，其中ORF為1 545 bp，編碼514個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)軟件比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，牦牛IMPDH基因與野牦牛(XM_005909361.2)有7個(gè)堿基的差異，依次為第35位T→C、第46位C→T、第898位A→C、第1064位G→T、第1283位T→C、第1532位G→A和第1538位T→G，最終導(dǎo)致7個(gè)氨基酸發(fā)生突變。牦牛IMPDH的理論等電點(diǎn)分別為5.69，分子質(zhì)量約為55.7 ku。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 DNA marker DL2000; 1.空白對(duì)照組 Negative control; 2～4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR amplification product

圖1 牦牛卵巢組織中IMPDH基因的RT-PCR結(jié)果
Fig.1 RT-PCR amplification ofIMPDHgene from yak ovary

2.2IMPDH基因結(jié)構(gòu)與功能分析

研究結(jié)果顯示，牦牛IMPDH基因與野牦牛具有很高的同源性(99.4%)，其次為黃牛(99.0%) (表2)。進(jìn)化樹顯示，牦牛IMPDH基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守，DNAMAN和MEGA軟件分析結(jié)果顯示，牦牛基因與野牦牛和黃牛的親緣關(guān)系最為接近，位于同一進(jìn)化分枝，與原雞、斑馬魚等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。ExPASy軟件對(duì)牦牛IMPDH的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示最小親水指數(shù)-2.833，最大親水指數(shù)2.722，該基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，IMPDH編碼的蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，牦牛IMPDH中存在41.83%α-螺旋，12.45%β-折疊，28.99% 無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)(圖3)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)(圖4)。

表2 牦牛和其他物種間IMPDH基因序列同源性分析Table 2 Homologous of nucleotide of yak IMPDH gene with other species

圖2 牦牛IMPDH進(jìn)化樹分析Fig.2 Yak IMPDH evolutionary tree analysis

圖中藍(lán)色線代表α-螺旋 Blue lines representα-helix，綠色線代表β-折疊 Green lines representβ-sheet，紫色線代表無(wú)規(guī)則卷曲 Purple lines represent random coil，紅色線代表延伸鏈 Red lines represent extended strand

圖3 牦牛IMPDH氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
Fig.3 Predicted secondary structure of amino acid sequence of yak IMPDH

圖4 牦牛IMPDH氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted tertiary structure of amino acid sequence of yak IMPDH

2.3IMPDH基因的時(shí)序表達(dá)譜

實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，IMPDH基因在牦牛卵巢組織的表達(dá)豐度隨牦牛胎齡和年齡的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，成年后空懷的牦牛表達(dá)顯著高于胎兒期(圖5)，但是3歲和6歲牦牛間差異不顯著。2.4IMPDH基因在牦牛卵巢活動(dòng)中的表達(dá)

為進(jìn)一步研究IMPDH基因在卵巢活動(dòng)中的表達(dá)情況，以GAPDH為參照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。熒光定量的擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖6。結(jié)果表明，IMPDH在牦牛卵泡期卵巢中表達(dá)量顯著高于排卵后的紅體形成期及黃體形成期(P<0.05)，其中在牦牛紅體形成期的卵巢組織中表達(dá)量最低，與卵泡期卵巢組織中IMPDH的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。

1～3泳道依次為3月齡、6月齡和9月齡胎牛, 4～6泳道依次為2歲、3歲和6歲成年牛卵巢組織 Line 1-3 represents ovaries of 3-month, 6-month and 9-month yak fetal, line 4-6 represents the ovaries of 2-year, 3-year and 6-year of adult yak, respectively

圖5 RT-PCR檢測(cè)不同發(fā)育階段牦牛卵巢IMPDHmRNA表達(dá)量
Fig.5 RT-PCR analysis of yakIMPDHmRNA expression in yak fetal and adults ovaries of different developmental stages

A.擴(kuò)增曲線，B.熔解曲線，C.表達(dá)水平柱狀圖，不同字母(a-c)表示差異顯著(P<0.05) A, B and C represent amplification curve, melting curve and histogram of expression, respectively; different letters show significant difference (P<0.05)

圖6 牦牛IMPDH基因的qRT-PCR結(jié)果
Fig.6 qRT-PCR results ofIMPDHgene from yak ovary

3 討 論

IMPDH是生物體內(nèi)嘌呤核苷酸的從頭生物合成途徑的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是癌癥抑制劑的靶點(diǎn)[13]，其在進(jìn)化進(jìn)程中相對(duì)保守。目前已報(bào)道的IMPDH有兩種亞型，其中Ⅱ型最先是從腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)出來(lái)的，通過(guò)對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的分析,其后又分別在大鼠、三毛滴蟲、肺炎鏈球菌和疏螺旋體中分離出來(lái)[9,14]。IMPDH通常以四聚體形式存在，是GTP經(jīng)典合成途徑的限速酶；這一反應(yīng)依賴于NAD+的參加，對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響十分重要[15]。IMPDH限制鳥嘌呤核苷酸的生物合成，且可阻斷細(xì)胞功能，如DNA復(fù)制、RNA合成、和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些效應(yīng)伴有細(xì)胞周期中斷、細(xì)胞分化和凋亡的誘導(dǎo)等[16]。IMPDH蛋白氨基酸序列存在較大的差異，但在哺乳動(dòng)物中保守性較高[17]，如人和鼠的同源性可達(dá)89%，但在細(xì)菌之間卻存在較小的同源性僅為23%，本試驗(yàn)亦證實(shí)這種差異性。

IMPDH參與繁殖調(diào)控、卵泡發(fā)育及胚胎著床等生物學(xué)過(guò)程。IMPDH的研究主要集中在植物[18]、細(xì)菌[19]和癌癥細(xì)胞上[20]，關(guān)于IMPDH在哺乳動(dòng)物卵巢組織中的資料報(bào)道較少。本研究以牦牛為研究對(duì)象，結(jié)果顯示IMPDH在哺乳動(dòng)物卵巢組織中表達(dá)，且在卵泡期表達(dá)量最高，表明IMPDH對(duì)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，可能與卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵有關(guān)。雌性動(dòng)物的繁殖能力主要取決于卵巢組織及其卵泡的協(xié)同發(fā)育。卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育與成熟是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。成年雌性動(dòng)物的每一個(gè)發(fā)情周期都需經(jīng)歷卵泡發(fā)育、紅體及黃體的形成與退化的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程由垂體、下丘腦、卵巢以及體細(xì)胞共同產(chǎn)生的許多生長(zhǎng)因子和激素共同參與，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。IMPDH通過(guò)從頭合成途徑對(duì)卵細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟起重要作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢功能參與排卵、早期胚胎發(fā)育和胚泡著床等過(guò)程[21]。因此研究牦牛繁殖活動(dòng)中IMPDH基因的表達(dá)，對(duì)研究其在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要意義。

IMPDH對(duì)卵巢的排卵及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯具有重要作用。哺乳動(dòng)物卵巢組織上存在數(shù)百萬(wàn)個(gè)各級(jí)卵泡，但在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，只有少量卵泡可以發(fā)育成熟并排卵，其余大部分卵泡都將閉鎖退化。多數(shù)動(dòng)物胎兒的原始卵泡、初級(jí)卵泡閉鎖主要是由卵母細(xì)胞內(nèi)cGMP水平引起的[4]。cGMP是由是由卵丘細(xì)胞以及卵泡壁顆粒細(xì)胞兩者共同產(chǎn)生[22]。主要是通過(guò)卵泡壁顆粒細(xì)胞的利鈉尿肽受體2(NPR2)將GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，從而抑制PDE3A的活性，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯[4,22]。而GTP又是由從肌苷一磷酸(IMP)在IMPDH酶作用下，經(jīng)一系列的生物合成反應(yīng)產(chǎn)生的。IMP是從嘌呤代謝途徑和HPRT補(bǔ)救途徑，最終將次黃嘌呤轉(zhuǎn)化而來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵母細(xì)胞復(fù)合體中的IMP的主要來(lái)源是從頭合成途徑[21]。IMPDH在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯中起相當(dāng)重要作用，前期研究發(fā)現(xiàn)使用IMPDH抑制劑咪唑立賓和霉酚酸能誘導(dǎo)小鼠性早熟以及恢復(fù)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂[23-24]?？赡苁怯捎谶@些抑制劑擾亂減數(shù)分裂進(jìn)展和排卵的協(xié)調(diào)作用，從而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量和生殖力[24]。這些結(jié)果表明，IMPDH具有維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的功能，推測(cè)是通過(guò)調(diào)控鳥苷酸環(huán)化酶的活性影響cGMP的產(chǎn)生。因此，有關(guān)IMPDH調(diào)控卵巢及其卵母細(xì)胞維持減數(shù)分裂阻滯作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究中，通過(guò)初步分析IMPDH基因在牦牛卵巢生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及繁殖周期中的表達(dá)情況，為研究IMPDH在卵泡發(fā)育和排卵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。前期大量研究表明IMPDH是一種與雌性哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程密切相關(guān)的生物酶[7]。本研究結(jié)果表明，IMPDH參與牦牛卵巢的發(fā)育，并在卵巢活動(dòng)過(guò)程中有明顯的表達(dá)規(guī)律，初步推測(cè)IMPDH在牦牛排卵、胚胎發(fā)育、胚胎著床及著床后的發(fā)育過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。此外，可能與牦牛的低繁殖率與自然流產(chǎn)之間存在密切的關(guān)系[25]。然而，其作用機(jī)理目前尚不完全清楚，有必要進(jìn)行深入的研究。是否由于IMPDH基因調(diào)控卵巢的發(fā)育和卵泡的形成，而間接性的調(diào)控牦牛繁殖性能還有待進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié) 論

本研究利用RT-PCR成功克隆牦牛IMPDH基因CDS序列，并發(fā)現(xiàn)該基因在卵巢組織中呈規(guī)律性表達(dá)。由此表明，IMPDH基因參與牦牛卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育及發(fā)情周期中卵巢的活動(dòng)，為解析牦牛卵巢組織的生長(zhǎng)發(fā)育及性激素分泌等重要生殖活動(dòng)的分子機(jī)理提供新的依據(jù)，為研究IMPDH在卵泡發(fā)育與排卵中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

Reference：

[1] WIENER G,HAN J L,LONG R J.The Yak [M].2nd edition.FAO Regional Office for Asia and the Pacific,2003.

[2] QIU Q,ZHANG G J,MA T,etal.The yak genome and adaptation to life at high altitude [J].NatureGenetics,2012,44(8):946-949.

[3] XIONG X R,LI J,FU M,etal.Oocyte extract improves epigenetic reprogramming of yak fibroblast cells and cloned embryo development [J].Theriogenology,2013,79(3):462-469.

[4] ZHANG M J,SU Y Q,SUGIURA K,etal.Granulosa cell ligand NPPC and its receptor NPR2 maintain meiotic arrest in mouse oocytes [J].Science,2010,330(6002):366-369.

[5] BURKS D J,DE MORA,J F,SCHUBERT M,etal.IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis [J].Nature,2000,407(6802):377-482.

[6] DAS D,NATH P,PAL S,etal.Expression of two insulin receptor subtypes,insra and insrb,in zebrafish(Daniorerio) ovary and involvement of insulin action in ovarian function [J].GeneralandComparativeEndocrinology,2016,239(27):21-31.

[7] WIGGLESWORTH K,LEE K B,O’BRIEN M J,etal.Bidirectional communication between oocytes and ovarian follicular somatic cells is required for meiotic arrest of mammalian oocytes [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(39): E3723-E3729.

[8] ASADA A,NISHIDA A,SHIOYA M,etal.NUDT15 R139C-related thiopurine leukocytopenia is mediated by 6-thioguanine nucleotide-independent mechanism in Japanese patients with inflammatory bowel disease [J].JournalofGastroenterology,2016,51(1):22-29.

[9] SARA B,HELGE R,STEIN B.Real-time PCR determination of IMPDHl and IMPDH2 expression in blood cells [J].ClinicalChemistry,2007,53(6):1023-1029.

[10] JAIN J,ALMQUIST S J,FORD P J,etal.Regulation of inosine monophosphate typeⅠ and typeⅡ isoforms in human lymphocytes [J].BiochemicalPharmacology,2004,67(4):767-776.

[11] LOONEY R J,ANOLIK J,SANZ I.B cells as therapeutic targets for rheumatic diseases [J].CurrentOpinioninRheumatology,2004,16(3):180-185.

[12] ZHOU J M,ZHANG X H,HE K W,etal.Characterization and proteome analysis of Inosine 5-monophosphate dehydrogenase in epidemic streptococcus suis serotype 2 [J].CurrentMicrobiology,2014,68(5):663-669.

[13] BAIRAGYA H R,MUKHOPADHYAY B P,SEKAR K.An insight to the dynamics of conserved water molecular triad in IMPDH Ⅱ (human):recognition of cofactor and substrate to catalytic Arg 322 [J].JournalofBiomolecularStructure&Dynamics,2009,27(2):149-158.

[14] GOLDSTEIN B M,COLBY T D.IMP dehydrogenase:structural aspects of inhibitor binding [J].CurrentMedicinalChemistry,1999,6(6):519-536.

[15] COLBY T D.VANDERVEEN K,STRICKLER M D,etal.Crystal structure of human type Ⅱ inosine monophosphate dehydrogenase:implication of ligand binding and drug design [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1999,96(7):3531-3536.

[16] PITALUGA A N，MOREIRA M E C,TRAUB-CSEK Y M.A putative role for inosine 5′ monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inLeishmaniaamazonensisprogrammed cell death [J].ExperimentalParasitology,2015,149:32-38.

[17] COLLART F R,HUBERMAN E.Cloning and sequence analysis of the human and Chinese hamster inosine-5-monophosphate dehydrogenase cDNAs [J].JournalofBiologicalChemistry,1988,263(30):15769-15772.

[18] 周晨陽(yáng).肌苷-5′-單磷酸脫氫酶基因的克隆及與茶葉中咖啡因含量的關(guān)聯(lián)分析[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2012.

ZHOU C Y.Molecular cloning of inosine-5′-monophosphate dehydrogenase gene and association analysis of the gene with caffeine content in tea plant [D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2012(in Chinese with English abstract).

[19] 張雪寒,何孔旺,周俊明,等.豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶缺失株的構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(5):1789-1796.

ZHANG X H,HE K W,ZHOU J M,etal.Construction and identification ofStreptococcussuistype 2 deficient in IMPDH expression [J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(5):1789-1796(in Chinese with English abstract).

[20] KIM H R,ROE J S,LEE J E,etal.A p53-inducible microRNA-34a downregulates Ras signaling by targeting IMPDH [J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,2012,418(4):682-688.

[21] DOWNS S M.High performance liquid chromatography analysis of hypoxanthine metabolism in mouse oocyte-cumulus cell complexes:Effects of purine metabolic perturbants [J].BiologyofReproduction,1994,50(6):1403-1412.

[22] ROBINSON J W,ZHANG M J,SHUHAIBAR L C,etal.Luteinizing hormone reduces the activity of the NPR2 guanylyl cyclase in mouse ovarian follicles,contributing to the cyclic GMP decrease that promotes resumption of meiosis in oocytes [J].DevelopmentalBiology,2012,366(2):308-316.

[23] Pedro M,Mattia G,Tomas T,etal.Recent advances on the enantioselective synthesis of C-nucleosides inhibitors of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) [J].CurrentTopicsinMedicinalChemistry,2014,14(10):1212-1224.

[24] DOWNS S M.Induction of meiotic maturation in vivo in the mouse by IMP dehydrogenase inhibitors:effects on the developmental capacity of ova [J].MolecularReproduction&Development,1994,38(3):293-302.

[25] FULWILER A L,BOITZ J M,GILROY C,etal.IMP dehydrogenase deficiency in Leishmania donovani causes a restrictive growth phenotype in promastigotes but is not essential for infection in mice [J].Molecular&BiochemicalParasitology, 2011,180(2):123-126.

(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Cloning, Bioinformatics Analysis and Differential Expression ofIMPDHGene in Yak Ovary at Different Stages

XIONG Xianrong1, LAN Daoliang2, HU Jiajia1, LI Jian1and ZI Xiangdong1

(1.College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau Research, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

The aim of this study is to obtain the information about sequence structure and bioinformatics analysis of yakIMPDHgene, analysis of sequential expression in ovarian tissue. It could provide information for further study of mechanism of ovarian development and ovulation. Yak IMPDH cDNA was cloned using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), the sequences characteristics were analyzed, andIMPDHgene expression in ovary were examined by real time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) at different stages of development and reproductive cycle. The study obtained a complete cDNA sequences of 1 623 bp ofIMPDHgene of yak with a deduced protein, which were consisted of 514 amino acids that are highly homologous with other species．The sequence similarity of IMPDH between yak and wild yak was 99.4%, this indicated thatIMPDHgene was conservative during evolution. The result of RT-PCR indicated that the expression of yak IMPDH increased with the increase of age. TheIMPDHgene in ovarian follicular phase was the strongest expression at other stages, and significantly higher than that of the red body phase.These results suggested thatIMPDHgene was probably related to the ovarian development, and there was a significantly expressed pattern during ovarian activity. These indicated that IMPDH played an important role during the reproductive cycle, and made a foundation for the further study of the function ofIMPDHgene in yak.

Yak;Cloning;IMPDH; Sequence analysis; Differential expression

2016-07-28 Returned 2016-09-26

The Sichuan Provincial Science and Technology Program(No.2014NZ0114);the Fundamental Research Funds for the Central Universities of Southwest Minzu University(No.2016NZYQN38).

XIONG Xianrong, male,master student.Research area:breeding and embryo engineering of yak.E-mail:xianrongxiong@163.com

LI Jian, male, professor. Research area: animal reproductive endocrine and embryo engineering.E-mail:jianli_1967@163.com

日期：2017-06-05

2016-07-28

2016-09-26

四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0114)；西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2016NZYQN38)。 第一作者：熊顯榮，男，碩士，從事牦牛繁殖與胚胎工程研究。E-mail: xianrongxiong@163.com 通信作者：李 鍵，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生殖內(nèi)分泌和胚胎工程研究。E-mail: jianli_1967@163.com

S829.9

A

1004-1389(2017)06-0812-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1714.004.html