腫瘤壞死因子α突變型斑馬魚在海分枝桿菌感染中的應(yīng)用研究

謝玲玲，王風(fēng)華，王德成，趙超，彭剛，牛辰

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院，上海 200032； 3. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002

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·論著·

腫瘤壞死因子α突變型斑馬魚在海分枝桿菌感染中的應(yīng)用研究

謝玲玲1，王風(fēng)華2，王德成3，趙超1，彭剛2，牛辰1

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院，上海 200032； 3. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，宜昌 443002

腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)作為重要的炎性細(xì)胞因子，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、感染性休克等疾病的發(fā)病中起重要作用。為探究TNF-α在宿主抵抗海分枝桿菌感染中的作用，本研究采用成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9〕技術(shù)，使野生型斑馬魚TNF-α基因發(fā)生突變，成功構(gòu)建并篩選出含有移碼突變的TNF-α突變型(TNF-α-/-)斑馬魚。利用原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TNF-α-/-斑馬魚中TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著降低。與野生型斑馬魚相比，海分枝桿菌在TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)擴(kuò)散和增殖更顯著。結(jié)果提示，本研究成功構(gòu)建TNF-α-/-斑馬魚，有助于深入探究TNF-α在斑馬魚抵抗海分枝桿菌感染中的作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9；腫瘤壞死因子α；突變型斑馬魚；原位雜交；細(xì)菌感染

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)最早由 Carswell等在接種卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)的小鼠中注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)后，于血清中發(fā)現(xiàn)的一種能殺傷某些腫瘤細(xì)胞或使體內(nèi)腫瘤組織發(fā)生出血壞死的因子[1]。由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF命名為TNF-α，其在細(xì)胞生長調(diào)控、細(xì)胞分化、炎癥、病毒復(fù)制、腫瘤、自身免疫疾病等方面發(fā)揮重要作用，可對抗病毒、細(xì)菌、真菌引起的感染[2-6]。病原菌感染宿主后，免疫識別系統(tǒng)通過巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)及NOD2激活TNF-α，繼而發(fā)揮以下作用：吞噬細(xì)胞分泌TNF-α并激活其他細(xì)胞因子；γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)和TNF-α可作為協(xié)同劑誘導(dǎo)產(chǎn)生NO，參與細(xì)胞凋亡；同時TNF-α可參與細(xì)胞自噬[7]。TNF-α也是宿主抗結(jié)核免疫中最早被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵因子之一。缺失TNF-α或相關(guān)受體的小鼠對結(jié)核分枝桿菌的易感性增加[8]。斑馬魚具有體型小、易養(yǎng)殖、飼養(yǎng)成本低、便于開展大規(guī)模研究的優(yōu)點(diǎn)，且其胚胎透明，便于活體實(shí)時觀察。斑馬魚作為海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum，M.marinum)的天然宿主，具有先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[9]，且體內(nèi)存在典型的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、T和B細(xì)胞等[10]。斑馬魚可在適應(yīng)性免疫還未發(fā)揮作用的早期發(fā)育階段被感染，因此可利用其具有光學(xué)透明性的胚胎展示巨噬細(xì)胞的存在和活動[11]。經(jīng)尾靜脈或后腦室注射熒光細(xì)菌至受精后32～48 h的斑馬魚胚胎，可清楚觀察斑馬魚早期發(fā)病癥狀[12]。在一定時間內(nèi)，巨噬細(xì)胞到達(dá)感染部位并吞噬細(xì)菌，然后遷移至更深的組織，形成有組織的肉芽腫狀集合體[7]。海分枝桿菌可在被感染斑馬魚的巨噬細(xì)胞中增殖，并造成慢性肉芽腫感染[9-10]；其感染成年斑馬魚后可產(chǎn)生結(jié)核樣疾病，可見類似典型人類結(jié)核病的干酪性肉芽腫[11]。近年來，斑馬魚-海分枝桿菌模型作為結(jié)核病的研究模型得到廣泛認(rèn)可。隨著基因組注釋和技術(shù)的發(fā)展，包括突變體誘變[13]、嗎啉環(huán)寡核苷酸、mRNA過量表達(dá)、轉(zhuǎn)基因斑馬魚[14]、鋅指核糖核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)基因敲除[15]等技術(shù)在內(nèi)的相關(guān)遺傳操作手段日臻完善，斑馬魚作為脊椎模式動物在全世界范圍內(nèi)得到了更廣泛的應(yīng)用。2013年Hruscha等[16]采用Cas9 mRNA和基因特異的引導(dǎo)RNA(guide RNA，gRNA)，實(shí)現(xiàn)了斑馬魚基因組特定基因位點(diǎn)缺失或插入的靶向突變Cas9對基因讀碼框序列破壞的高效性，使在短時間內(nèi)建立穩(wěn)定可遺傳的突變斑馬魚品系成為可能[17]。

本研究旨在采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建 TNF-α-/-斑馬魚，利用海分枝桿菌這一模式菌感染斑馬魚幼魚模型，研究TNF-α基因在被感染斑馬魚體內(nèi)的作用，從而為研究TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在抵御細(xì)菌感染中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 海分枝桿菌M菌株(ATCC BAA-535TM)由多倫多大學(xué)劉軍教授饋贈，最早由Lalita Ramakrishnan博士分離。pTEC15質(zhì)粒由英國劍橋大學(xué)Lalita Ramakrishnan教授惠贈[18]，其帶有Wasabi基因編碼的綠色熒光蛋白。本研究將pTEC15質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入海分枝桿菌野生菌株，獲得帶有綠色熒光標(biāo)記的海分枝桿菌。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 AB品系野生型斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心，自行繁育后代，飼養(yǎng)于28 ℃循環(huán)水系統(tǒng)中。

1.1.3 儀器和試劑 主要儀器包括Zeiss Axiovert 200M倒置顯微鏡(Carl Zeiss)、FemtoJet?顯微注射系統(tǒng)(Eppendorf)、2720 Thermal Cycler常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(Applied Biosystems)。主要試劑有PrimeSTAR酶(TaKaRa)、TaKaRa PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa)、三卡因、PTU(Sigma-Aldrich)、TRIzol(Life Technology)。堿性裂解液：5 g NaOH與0.2 mL 10 mol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)定容至1 L去離子水中。裂解中和液：6.3 g Tris-HCl定容至 1 L去離子水中。地高辛標(biāo)記核糖核酸混合物、偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(cat#11093274910)、蛋白酶K(cat#18501)、NBT/BCIP檢測試劑盒(cat#11184920)、甲酰胺(cat#11184320001)購自Roche，多聚甲醛(cat#18501 )購自Ted Pella，T7轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Ambion，酵母tRNA(R6625)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(A3924)、肝素(H3393)、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購自Sigma，RNA純化試劑盒購自Thermo。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫公布的斑馬魚TNF-α基因序列(GenBank accession number: NM_212859)，利用Primer-BLAST進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。斑馬魚TNF-α基因Cas9 mRNA上游引物：5′-CATTTTGGCTGTGGGCCTTT-3′，下游引物5′- GAACCGCCACAGTAAACCAG-3′。斑馬魚TNF-α基因gRNA：上游引物5′-ATAGGCAA-TCAACAAGATGGAAGGT-3′，下游引物5′- TAAAACCTTCCATCTTGTTGATTGCC-3′。斑馬魚TNF-α基因測序引物：上游引物5′-GGCGTTTTTGGATGTTGAAG-3′，下游引物5′-AGATCGCATTTCACAAGGCAA-3′。斑馬魚原位雜交探針上游引物：5′-CCATCGATATGAA-GCTTGAGAGTCG-3′，下游引物：5′-TATTATG-TGCAACTGGGGATCCCG-3′。引物合成及DNA測序均由華大基因(上海)完成。

1.2 方法

1.2.1 海分枝桿菌的培養(yǎng) 海分枝桿菌劃線于M7H10-10% OADC (DIFCO)平皿，30 ℃避光密封培養(yǎng)10 d，挑取單個菌落接種于M7H9-10% OADC液體培養(yǎng)基，30 ℃避光旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(100 r/min)。OADC配制方法：0.6 g油酸(Sigma)、0.6 mL 6 mol/L NaOH、50 g BSA組分V(Fisher)、20 g葡萄糖、8.5 g NaCl、30 mg觸酶，溶于1 L預(yù)冷去離子水中，0.2 μm濾器無菌過濾，避光保存于4℃。

1.2.2 斑馬魚的養(yǎng)殖 斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃循環(huán)水系統(tǒng)中，自行繁育。受精后5 d(5 days post fertilization，5 dpf)，斑馬魚胚胎可于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，密度不超過50個胚胎/培養(yǎng)皿(90 mm)，無需喂食。從5～15 dpf每天喂食輪蟲2～3次。1個月大的斑馬魚可放入水循環(huán)系統(tǒng)，每天喂食豐年蝦2～3次。從孵育到養(yǎng)殖保證水環(huán)境潔凈。

1.2.3 TNF-α-/-突變魚系的構(gòu)建和篩選 按已有文獻(xiàn)[19]，采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TNF-α突變斑馬魚品系。首先，針對TNF-α基因的外顯子DNA序列，利用BLAST軟件在 Ensembl 網(wǎng)站上查找Cas9作用的靶位點(diǎn)，并驗(yàn)證其為斑馬魚基因組中的單一位點(diǎn)。依據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成Cas9 mRNA和gRNA引物，體外合成Cas9 mRNA和gRNA。將Cas9 mRNA(800 ng/μL)和gRNA(30 ng/μL)按1∶1混合，注射到野生型斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中。2～4 d后，取20個左右魚卵，提取基因組DNA，測序鑒定突變發(fā)生率。將同批次注射的F0胚胎養(yǎng)至性成熟后，與野生型斑馬魚外交，對所產(chǎn)胚胎進(jìn)行基因組測序，挑選有效突變的母本大量外交，獲得更多F1代。對其中攜帶同種突變的斑馬魚進(jìn)行分組，篩選出的突變類型至少各保留兩雄兩雌，對理想的突變類型進(jìn)行保種。在測序篩選F1代時保留有效突變的雜合個體，在測序篩選F2代時保留有效突變的純合個體。經(jīng)9個月，成功獲得可產(chǎn)卵的TNF-α-/-純合突變斑馬魚品系。

1.2.4 斑馬魚TNF-α基因測序 用堿裂法提取基因組DNA：將成魚置于0.016%三卡因麻醉液中，待魚麻醉后用消毒的解剖剪剪下尾部尖端少量組織，置于1.5 mL 離心管中，盡量不留液體。在樣品管內(nèi)加入50 μL堿性裂解液，95 ℃孵育30 min，加入50 μL裂解中和液，振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min。DNA擴(kuò)增：取上清液2 μL作為50 μL PCR體系的反應(yīng)模板，利用TNF-α測序引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因(上海)測序，測序結(jié)果用4Peaks軟件分析。

1.2.5 地高辛標(biāo)記的TNF-α反義RNA探針制備 收集14 dpf野生型斑馬魚幼魚15條，置于1.5 mL EP管中，TRIzol法提取總RNA[20]。以抽提的斑馬魚總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，獲得cDNA，以其為模板用原位雜交引物擴(kuò)增TNF-α基因，使DNA片段囊括堿基缺失位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收。將回收產(chǎn)物片段及pBluescript?KS質(zhì)粒分別用ClaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，經(jīng)電泳切膠回收后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物由華大基因(上海)測序驗(yàn)證。將TNF-α-pBluescript?KS重組質(zhì)粒作為模板，用SmaⅠ線性化，T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，最終獲得地高辛標(biāo)記的TNF-α反義RNA探針。用RNA純化回收試劑盒純化探針，最終濃度為113 ng/μL。

1.2.6 斑馬魚全胚胎原位雜交 選擇48 hpf的斑馬魚，用1 mL注射器針頭進(jìn)行截尾，多聚甲醛固定截尾2 h后的全胚胎魚，作為全胚胎原位雜交的實(shí)驗(yàn)對象。按標(biāo)準(zhǔn)原位雜交流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[21]。經(jīng)脫水、預(yù)雜交，加入制備好的地高辛標(biāo)記的TNF-α反義RNA探針雜交液，雜交過夜。洗脫完全后，將堿性磷酸酶偶聯(lián)抗地高辛抗體以1∶7 000的比例稀釋入封閉液，取800～1 000 μL加入胚胎魚中，4 ℃搖床過夜。最后加入NBT/BCIP溶液顯色，染色2 d后，可于顯微鏡下觀察到藍(lán)色的陽性雜交信號。

1.2.7 海分枝桿菌感染及細(xì)菌增殖檢測 檢測方法參照文獻(xiàn)[18]。收集TNF-α-/-和野生型斑馬魚的受精卵，待發(fā)育至28～30 h，用5號鑷子在體視鏡下?lián)荛_卵黃膜，幫助斑馬魚幼魚孵出。斑馬魚浸泡于0.016%三卡因中進(jìn)行麻醉。將0.5 μL高濃度酚紅溶液(0.2 g/mL)加至10 μL海分枝桿菌的熒光單細(xì)菌懸液中(約2×108CFU/mL)[22]。用上樣管吸取3 μL混勻細(xì)菌，加入直徑1 mm的厚壁注射毛細(xì)針里。將上好樣品的毛細(xì)針插入持針器中固定，用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。通過調(diào)節(jié)針尖大小、注射時間及壓力，調(diào)節(jié)注射劑量，一般注射劑量為1 nL，并鋪板計(jì)數(shù)。根據(jù)需要選擇不同的初始感染量，感染樣本以30條左右斑馬魚為一組。定期更換培養(yǎng)液，保證胚胎的存活率。注射感染后第1、3、5天，于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)細(xì)菌的擴(kuò)散和增殖情況并拍照。收集熒光照片，用ImageJ軟件分析并統(tǒng)計(jì)熒光光密度(optical density，OD)[23]。

2 結(jié)果

2.1 基因測序驗(yàn)證TNF-α基因突變

剪取適量2月齡TNF-α-/-和野生型斑馬魚尾鰭，堿裂法提取基因組。對TNF-α基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，用4Peaks軟件比對分析基因序列。斑馬魚TNF-α基因有4個外顯子、3個內(nèi)含子。DNA全長5 488 bp，cDNA長1 048 bp。測序分析結(jié)果證明，基因缺失位點(diǎn)在第2個外顯子的最后5個堿基及第3個內(nèi)含子的第1個堿基(圖1)。保留該突變類型并繁育，最終從121條雜合母本產(chǎn)出的后代中篩選出20條純合TNF-α-/-斑馬魚。

A: The schematic of TNF-α gene, including four exons (red rectangle) and three introns (blue line). The black box indicates the location of deletion sites of TNF-α-/-. B: The sequences of wild-type (WT) and TNF-α-/-. The green bases represent the target sites, the underlined bases represent the exon, and the others are intron. The deletion is labeled in the red box, which includes the last five bases of the second exon and the first base of the third intron.

圖1 TNF-α-/-和野生型斑馬魚基因測序結(jié)果及堿基缺失位置示意圖

Fig.1 The schematic of gene sequences of TNF-α-/-zebrafish and wild-type zebrafish, and the location of deletion sites

2.2 TNF-α-/-斑馬魚中TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著降低

利用帶標(biāo)簽的反義RNA探針可檢測斑馬魚組織內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的原始分布及相對表達(dá)水平[24-25]。本研究通過原位雜交方法檢測損傷后的TNF-α-/-和野生型斑馬魚中TNF-α mRNA的表達(dá)量。對TNF-α-/-和野生型斑馬魚(48 hpf)進(jìn)行尾鰭損傷實(shí)驗(yàn)，觀察2 h后原位雜交染色情況(圖2)，發(fā)現(xiàn)在尾部損傷處TNF-α-/-斑馬魚較野生型斑馬魚TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著降低。

TNF-α mRNA expression (blue shadow) was detected byinsituhybridization using TNF-α anti-sense probe, at 2 hpf amputated fins from 48 hpf wild-type zebrafish (A) and TNF-α-/-zebrafish (B). Compared with wild-type zebrafish, less blue area was observed in the tail of wounded TNF-α-/-zebrafish.

圖2 尾部損傷后TNF-α-/-和野生型斑馬魚的原位雜交結(jié)果

Fig.2 Theinsituhybridization results of wounded TNF-α-/-zebrafish and wild-type zebrafish

2.3 TNF-α基因突變降低斑馬魚成魚存活率

隨機(jī)收集24 hpf的TNF-α-/-和野生型斑馬魚胚胎各200個，比較兩組胚胎的死亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，TNF-α-/-和野生型斑馬魚的胚胎孵育率均在正常范圍內(nèi)，TNF-α-/-斑馬魚孵育率為93.75%，野生型斑馬魚為93.05%(圖3)。結(jié)果表明，TNF-α基因突變不影響斑馬魚受精卵的孵化率。

The embryo survival rate of TNF-α-/-zebrafish was the same as wild-type zebrafish. Incubation rate of TNF-α-/-zebrafish was 93.75%, and wild-type zebrafish 93.05%.

圖3 TNF-α-/-和野生型斑馬魚的胚胎存活率

Fig.3 The embryo survival rate of wild-type zebrafish and TNF-α-/-zebrafish

進(jìn)一步收集發(fā)育至2～3月齡的TNF-α+/-雜合突變斑馬魚的自交后代121條，進(jìn)行基因型鑒定。其中有20條純合突變個體，占16.5%；38條野生純合個體，占31.4%。結(jié)果提示，發(fā)育過程中TNF-α-/-斑馬魚的存活率較野生型斑馬魚低。

2.4 TNF-α突變導(dǎo)致斑馬魚抑制海分枝桿菌體內(nèi)增殖的能力減弱

為檢測TNF-α基因突變是否影響斑馬魚抵抗細(xì)菌感染的能力，用海分枝桿菌分別感染孵育后30 h的TNF-α-/-和野生型斑馬魚(斑馬魚成魚既有天然免疫又有適應(yīng)性免疫，而實(shí)驗(yàn)期斑馬魚幼魚只有天然免疫[26])，每組25條左右。圖4A為熒光定量分析細(xì)菌感染TNF-α-/-和野生型斑馬魚魚體1、3、5 d后的擴(kuò)散及增殖情況。初始感染菌量為每條魚130 CFU。結(jié)果顯示，感染后第1、3天，海分枝桿菌在TNF-α-/-與野生型斑馬魚體內(nèi)增殖差異不明顯。感染后第5天，海分枝桿菌在TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)的增殖速率顯著高于野生型斑馬魚(圖4A)。圖4B和4C為分別選擇一條TNF-α-/-和野生型斑馬魚感染海分枝桿菌后第4天的代表圖，箭頭所示為斑馬魚體內(nèi)帶有綠色熒光的細(xì)菌。TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)綠色細(xì)菌擴(kuò)散范圍更廣，巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌后形成的肉芽腫也更明顯。

Zebrafish larvae were infected withM.marinumcarrying pTEC15 containing fluorescent protein Wasabi separately. The bacteria in TNF-α-/-and wild-type zebrafish infected withM.marinumseparately at 1, 3, 5 dpi were quantified (A).OD= lg255/PixelValue.****P≤0.000 1 (calculated by Kruskal-Wallis test and Dunn’s multiple comparison test). Representative fluorescent images of infected larvae of TNF-α-/-zebrafish (B) and wild-type zebrafish (C) at 4 dpi were shown (the head and tail of the same fish). The arrow points to the formation of initial granuloma with fluorescentM.marinuminside. The bacteria in TNF-α-/-zebrafish spread faster, diffused more deeply.

圖4 海分枝桿菌在TNF-α-/-和野生型斑馬魚體內(nèi)的擴(kuò)散和增殖

Fig.4 Bacteria in TNF-α-/-and wild-type zebrafish infected withM.marinum

3 討論

本研究利用 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對斑馬魚TNF-α基因進(jìn)行突變，獲得了在TNF-α基因第2個外顯子最后5個堿基及第3個內(nèi)含子首個堿基缺失的TNF-α-/-斑馬魚，并通過基因測序驗(yàn)證了TNF-α基因的具體突變位點(diǎn)；此外，利用原位雜交技術(shù)，證明了TNF-α-/-與野生型斑馬魚TNF-α基因表達(dá)水平存在差異。

在篩選純合TNF-α-/-斑馬魚過程中，TNF-α基因突變不影響斑馬魚胚胎孵化的能力。但在斑馬魚個體從胚胎發(fā)育至成魚的生命過程中，隨著幼魚的生長發(fā)育，TNF-α-/-斑馬魚存活率低于野生型斑馬魚。由此推測，飼養(yǎng)斑馬魚的水環(huán)境中存在微生物，而斑馬魚TNF-α基因突變可能影響了宿主的抗菌免疫，導(dǎo)致在長期生長過程中TNF-α-/-斑馬魚存活率下降。

TNF-α在抵抗多種細(xì)胞內(nèi)病原體(包括致病性分枝桿菌)的免疫過程中起關(guān)鍵作用。通過海分枝桿菌感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染后第4天TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)肉芽腫形成和聚集更明顯，第5天TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)細(xì)菌擴(kuò)散范圍更廣。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在肉芽腫的形成和維持中發(fā)揮重要作用[27]。在TNF-α活性缺乏的小鼠體內(nèi)，肉芽腫形成存在缺陷，各種組織中的肉芽腫數(shù)目減少[28]，體積較小[29]，且缺乏細(xì)胞組織特征性結(jié)構(gòu)[30]。肉芽腫結(jié)構(gòu)的維持取決于多種因素，包括細(xì)胞活力、細(xì)胞黏附蛋白水平、趨化因子梯度和趨化因子受體表達(dá)，TNF-α可通過調(diào)節(jié)這些因素而在維持肉芽腫結(jié)構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。小鼠模型中，TNF-α可導(dǎo)致感染的巨噬細(xì)胞和其他CD11b+T細(xì)胞分泌的趨化因子減少，從而影響細(xì)胞遷移進(jìn)入和離開肉芽腫的能力[31]。

本研究顯示，在海分枝桿菌感染TNF-α-/-和野生型斑馬魚后第1天，兩者體內(nèi)細(xì)菌增殖差異不明顯，直至感染后第5天出現(xiàn)顯著差異，提示TNF-α基因可能通過影響肉芽腫結(jié)構(gòu)的維持以控制斑馬魚體內(nèi)海分枝桿菌的增殖，與Clay等利用斑馬魚胚胎的活體成像追蹤海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的運(yùn)動所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[32]。他們的數(shù)據(jù)顯示，在細(xì)菌感染后第4天用RNA干擾技術(shù)阻斷TNF信號通路的斑馬魚胚胎中，形成活動期肉芽腫的比例為60%，顯著高于對照組的35%。他們認(rèn)為TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并非作用于肉芽腫的最初形成，而是將未感染的巨噬細(xì)胞募集至初始感染位置，并聚集未感染和感染的巨噬細(xì)胞形成肉芽腫。因此，TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)巨噬細(xì)胞在肉芽腫內(nèi)的存活，可能是限制分枝桿菌擴(kuò)散的主要機(jī)制，從而控制感染的進(jìn)一步傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，海分枝桿菌在TNF-α-/-斑馬魚體內(nèi)擴(kuò)散范圍更廣，巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌后形成的肉芽腫更明顯。這可能是由于TNF-α基因突變影響了TNF-α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致肉芽腫巨噬細(xì)胞干酪樣壞死，釋放活細(xì)菌，然后擴(kuò)散到相鄰細(xì)胞。

借助TNF-α-/-斑馬魚模型，利用其可視化、光學(xué)透明的胚胎，可在適應(yīng)性免疫未發(fā)生時觀察TNF-α基因?qū)π律庋磕[中病原菌生長的控制及對巨噬細(xì)胞功能的影響。相較于其他結(jié)核病動物模型，斑馬魚模型的優(yōu)勢之一是利用其光學(xué)透明的胚胎可在早期發(fā)病階段實(shí)時追蹤細(xì)菌在宿主體內(nèi)的感染過程，確定細(xì)菌與宿主發(fā)生相互作用的具體階段[23]。相較于通過改變mRNA剪接或抑制蛋白翻譯來瞬時阻斷斑馬魚基因功能的方法[32]，CRISPR技術(shù)突變斑馬魚TNF-α基因而建立的基因修飾作用是可遺傳的，這將大大提升實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和精確性，并為大規(guī)模、大批次通過斑馬魚模型研究TNF-α基因的功能提供了便利。

本研究利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建了TNF-α-/-斑馬魚，發(fā)現(xiàn)TNF-α基因突變影響斑馬魚抗菌免疫，顯著削弱了宿主對抗分枝桿菌感染的能力。這一模型的建立和特征刻畫，有助于進(jìn)一步研究TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在斑馬魚生長發(fā)育、生命活動及宿主抵抗海分枝桿菌感染中的作用。

[1] O’Malley WE, Achinstein B, Shear MJ. Action of bacterial polysaccharide on tumors. II. Damage of sarcoma 37 by serum of mice treated with Serratia marcescens polysaccharide, and induced tolerance [J]. Nutr Rev, 1988, 46(11): 389-391.

[2] Kinoshita S, Biswas G, Kono T, Hikima J, Sakai M. Presence of two tumor necrosis factor (TNF)-alpha homologs on different chromosomes of zebrafish (Danio rerio) and medaka (Oryzias latipes) [J]. Mar Genomics, 2014, 13: 1-9.

[3] Old LJ. Tumor necrosis factor (TNF) [J]. Science, 1985, 230(4726): 630-632.

[4] Igaki T, Kanda H, Okano H, Xu T, Miura M. Eiger and Wengen: the Drosophila orthologs of TNF/TNFR [J]. Adv Exp Med Biol, 2011, 691: 45-50.

[5] Walsh MC, Choi Y. Biology of the RANKL-RANK-OPG system in immunity, bone, and beyond [J]. Front Immunol, 2014, 5: 511.

[6] Aggarwal BB, Shishodia S, Ashikawa K, Bharti AC. The role of TNF and its family members in inflammation and cancer: lessons from gene deletion [J]. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2002, 1(4): 327-341.

[7] Harris J, Master SS, De Haro SA, Delgado M, Roberts EA, Hope JC, Keane J, Deretic V. Th1-Th2 polarisation and autophagy in the control of intracellular mycobacteria by macrophages [J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 128(1-3): 37-43.

[8] Prados-Rosales R, Baena A, Martinez LR, Luque-Garcia J, Kalscheuer R, Veeraraghavan U, Camara C, Nosanchuk JD, Besra GS, Chen B, Jimenez J, Glatman-Freedman A, Jacobs WR Jr, Porcelli SA, Casadevall A. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice [J]. J Clin Invest, 2011, 121(4): 1471-1483.

[9] Capuano SV 3rd, Croix DA, Pawar S, Zinovik A, Myers A, Lin PL, Bissel S, Fuhrman C, Klein E, Flynn JL. Experimental Mycobacterium tuberculosis infection of cynomolgus macaques closely resembles the various manifestations of human M. tuberculosis infection [J]. Infect Immun, 2003, 71(10): 5831-5844.

[10] Volkman HE, Clay H, Beery D, Chang JC, Sherman DR, Ramakrishnan L. Tuberculous granuloma formation is enhanced by a mycobacterium virulence determinant [J]. PLoS Biol, 2004, 2(11): e367.

[11] Stange EF. Chronic inflammatory bowel disease—new therapies: tumor necrosis factor-antibodies and cytokines [J]. Z Gastroenterol, 2002, 40(Suppl 1): S90-S91.

[12] Tobin DM, Ramakrishnan L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis [J]. Cell Microbiol, 2008, 10(5): 1027-1039.

[13] Meng X, Noyes MB, Zhu LJ, Lawson ND, Wolfe SA. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases [J]. Nat Biotechnol, 2008, 26(6): 695-701.

[14] Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF, Meng X, Paschon DE, Leung E, Hinkley SJ, Dulay GP, Hua KL, Ankoudinova I, Cost GJ, Urnov FD, Zhang HS, Holmes MC, Zhang L, Gregory PD, Rebar EJ. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing [J]. Nat Biotechnol, 2011, 29(2): 143-148.

[15] Zhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription [J]. Nat Biotechnol, 2011, 29(2): 149-153.

[16] Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, Heinrich V, Hecht J, Haass C, Schmid B. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish [J]. Development, 2013, 140(24): 4982-4987.

[17] Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system [J]. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 227-229.

[18] Takaki K, Davis JM, Winglee K, Ramakrishnan L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum infection in zebrafish [J]. Nat Protoc, 2013, 8(6): 1114-1124.

[19] Yu C, Zhang Y, Yao S, Wei Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish [J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98282.

[20] Lan CC, Tang R, Un San Leong I, Love DR. Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) of zebrafish transcripts: optimization of RNA extraction, quality control considerations, and data analysis [J]. Cold Spring Harb Protoc, 2009. doi: 10.1101/pdb.prot5314.

[21] Jowett T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish [J]. Methods, 2001, 23(4): 345-358.

[22] Clay H, Davis JM, Beery D, Huttenlocher A, Lyons SE, Ramakrishnan L. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish [J]. Cell Host Microbe, 2007, 2(1): 29-39.

[23] Lesley R, Ramakrishnan L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish [J]. Curr Opin Microbiol, 2008, 11(3): 277-283.

[24] Hollway GE, Maule J, Gautier P, Evans TM, Keenan DG, Lohs C, Fischer D, Wicking C, Currie PD. Scube2 mediates Hedgehog signalling in the zebrafish embryo [J]. Dev Biol, 2006, 294(1): 104-118.

[25] Yang Q, Hu J, Ye D, Zhao C, Song S, Gong W, Tan Z, Song P. Identification and expression analysis of two zebrafish E2F5 genes during oogenesis and development [J]. Mol Biol Rep, 2010, 37(4): 1773-1780.

[26] Davis JM, Ramakrishnan L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection [J]. Cell, 2009, 136(1): 37-49.

[27] Miller EA, Ernst JD. Illuminating the black box of TNF action in tuberculous granulomas [J]. Immunity, 2008, 29(2): 175-177.

[28] Kindler V, Sappino AP, Grau GE, Piguet PF, Vassalli P. The inducing role of tumor necrosis factor in the development of bactericidal granulomas during BCG infection [J]. Cell, 1989, 56(5): 731-740.

[29] Zganiacz A, Santosuosso M, Wang J, Yang T, Chen L, Anzulovic M, Alexander S, Gicquel B, Wan Y, Bramson J, Inman M, Xing Z. TNF-alpha is a critical negative regulator of type 1 immune activation during intracellular bacterial infection [J]. J Clin Invest, 2004, 113(3): 401-413.

[30] Flynn JL, Goldstein MM, Chan J, Triebold KJ, Pfeffer K, Lowenstein CJ, Schreiber R, Mak TW, Bloom BR. Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice [J]. Immunity, 1995, 2(6): 561-572.

[31] Algood HM, Lin PL, Yankura D, Jones A, Chan J, Flynn JL. TNF influences chemokine expression of macrophages in vitro and that of CD11b+cells in vivo during Mycobacterium tuberculosis infection [J]. J Immunol, 2004, 172(11): 6846-6857.

[32] Clay H, Volkman HE, Ramakrishnan L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death [J]. Immunity, 2008, 29(2): 283-294.

s. NIU Chen, E-mail: chniu@fudan.edu.cn; PENG Gang, E-mail: gangpeng@fudan.edu.cn

Application of tumor necrosis factor α mutant zebrafish inMycobacteriummarinuminfection

XIE Lingling1, WANG Fenghua2, WANG Decheng3, ZHAO Chao1, PENG Gang2, NIU Chen1

1. Key Laboratory of Medical Molecular Virology, Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Institutes of Brain Science, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China

Tumor necrosis factor α(TNF-α) is an important inflammatory cytokine implicated in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, septic shock and other diseases. In order to investigate the functional role of host TNF-α inMycobacteriummarinum(M.marinum) infection, clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) technology was utilized to mutate the TNF-α gene in wild type (WT) zebrafish. A zebrafish containing a frame-shift mutation was successfully constructed, isolated, and named as TNF-α-/-. It was found that the expression of TNF-α mRNA was significantly reduced in TNF-α-/-zebrafish byinsituhybridization (ISH). The proliferation ofM.marinumin TNF-α-/-zebrafish was significantly elevated compared to WT zebrafish. The construction of TNF-α-/-zebrafish will allow further in-depth study on the function of TNF-α in mycobacterial infection and related immune regulation.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9; Tumor necrosis factor α; Mutant zebrafish;Insituhybridization; Bacterial infection

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計(jì)劃項(xiàng)目(14140902900)

牛辰，彭剛

2016-12-02)