玻璃扯旗魚性別特征及其幼魚性別分化的組織學(xué)初探

彭亞，楊青，鄧植文，董思遠(yuǎn)，劉志偉*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

玻璃扯旗魚性別特征及其幼魚性別分化的組織學(xué)初探

彭亞1,2，楊青1，鄧植文2，董思遠(yuǎn)2，劉志偉2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

應(yīng)用形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)及組織學(xué)方法對(duì)玻璃扯旗魚的性別特征及其幼魚性別分化基本過(guò)程進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：在6月齡玻璃扯旗雌魚卵巢中能觀察到各時(shí)相的卵母細(xì)胞，在雄魚精小管管腔內(nèi)有大量精子；4月齡以上玻璃扯旗雌魚的腹部隆起，并有淡黃色顆粒狀組織，而雄魚無(wú)類似結(jié)構(gòu)；100日齡以上雌魚的臀鰭有鉤狀小齒，但2月齡前的幼魚無(wú)該組織。5～50日齡幼魚性腺發(fā)育狀態(tài)顯示：10日齡以下幼魚的體內(nèi)無(wú)分化明顯的生殖腺；15日齡幼魚體內(nèi)有生殖包囊，且15日齡之前僅在腹腔一側(cè)可觀察到性腺組織，而25日齡幼魚的腹腔兩側(cè)均有對(duì)稱分布的類卵巢結(jié)構(gòu)；至 30日齡時(shí)，部分幼魚可觀察到有棒狀精巢，性腺開始分化。本研究中探明了玻璃扯旗魚性別分化及性腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)，該結(jié)果可為進(jìn)一步研究其分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

玻璃扯旗魚；性腺發(fā)育；性別分化；性別特征

目前，魚類性腺發(fā)育及性別分化的研究多集中在性腺周期性變化、化學(xué)或物理因素對(duì)性腺發(fā)育及性別分化的影響以及成魚性逆轉(zhuǎn)等方面[1-3]。關(guān)于鯉科魚類，如斑馬魚、墨西哥脂鯉、鯉魚、青海湖裸鯉等的性腺發(fā)育研究均已有報(bào)道[4-7]。基于對(duì)模式動(dòng)物斑馬魚的研究，人們對(duì)生殖干細(xì)胞的分化、遷移及其分子調(diào)控機(jī)制已有了比較深入的了解[8-10]。由于斑馬魚生長(zhǎng)超過(guò)2周后就變得不透明，這使得性腺發(fā)育、性別分化及其分子調(diào)控機(jī)制等方面的研究開展困難。

黃扯旗魚(Pristella maxillaris)屬脊椎動(dòng)物門輻鰭亞綱脂鯉目脂鯉科細(xì)鋸脂鯉屬，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河下游的巴西和委內(nèi)瑞拉、圭亞那等地，最早于1908年由EIGENMANN發(fā)現(xiàn)并鑒定出來(lái)，別名紅尾玻璃魚、細(xì)鋸脂鯉魚等。 該魚體型側(cè)扁，腹部較圓，眼大，尾鰭深叉形，背鰭和臀鰭上各有一塊黑色斑點(diǎn)[11]。玻璃扯旗魚是黃扯旗魚的白化突變體。

玻璃扯旗魚通體透明，骨骼和內(nèi)臟清晰可見，其透明度遠(yuǎn)高于白化斑馬魚，可在循環(huán)水養(yǎng)殖條件下常年穩(wěn)定繁殖，且產(chǎn)卵周期約為 9 d，世代間隔相差不大，這使得玻璃扯旗魚在魚類成體組織、器官發(fā)育及致病機(jī)制研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)，且其在脊椎動(dòng)物發(fā)育研究中與斑馬魚具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，所以可將其作為一種較理想的模式動(dòng)物進(jìn)行活體動(dòng)物功能分析，如脊椎動(dòng)物的器官發(fā)育及疾病發(fā)生機(jī)制研究等。

性別分化及鑒定是親魚雌雄分養(yǎng)、培育及繁殖的基礎(chǔ)。在魚類的人工養(yǎng)殖工作中，精準(zhǔn)判定魚體的性別極為重要[12]。性腺發(fā)育研究是魚類學(xué)和發(fā)育生物學(xué)相關(guān)研究的重要部分，包括幼魚生殖干細(xì)胞的發(fā)生、遷移、定位以及后續(xù)性腺發(fā)育過(guò)程、性別分化機(jī)制、雌雄魚體性狀差異、性腺退化以及性逆轉(zhuǎn)等[13-16]。

目前，關(guān)于玻璃扯旗魚性別分化及其性腺發(fā)育的研究尚少。筆者對(duì)玻璃扯旗魚不同發(fā)育時(shí)期的體型及臀鰭特征等進(jìn)行分析，旨在找到鑒定其性別的簡(jiǎn)易方法，并探明玻璃扯旗魚性腺發(fā)育及性別分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

玻璃扯旗魚為上海海洋大學(xué)神經(jīng)發(fā)育研究室自繁自養(yǎng)；麻醉劑和多聚甲醛購(gòu)自 Sigma；石蠟和中性樹膠購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；無(wú)水乙醇和二甲苯購(gòu)自國(guó)藥(上海)集團(tuán)；蘇木精和伊紅染色液購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玻璃扯旗魚的麻醉及性腺組織收集

向系統(tǒng)水中加入適量的0.03% MS222(E10505)麻醉劑，待魚麻醉后將其沿腹部剪開，置于 4%的多聚甲醛中固定，待其性腺組織固定完全后，在1×PBS中取出性腺。

1.2.2 玻璃扯旗魚的形態(tài)學(xué)觀察及魚體性狀數(shù)據(jù)收集

將不同時(shí)期的魚麻醉后，用體式顯微鏡(Leica，M205FA)對(duì)整魚、性腺和臀鰭進(jìn)行觀察并拍照，測(cè)定其體長(zhǎng)、體寬、體高及體質(zhì)量等數(shù)據(jù)。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色(H.E.染色)

將未成熟幼魚的整魚及成魚性腺組織進(jìn)行石蠟包埋，參照王晶等[17]和鄭偉等[18]建立的方法，稍作修改。將樣品用 4%多聚甲醛固定 12～24 h，用1×PBS溶液洗滌3次，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋后，將蠟塊組織連續(xù)切片(厚度6 μm)，用于染色。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，H.E.染色，再脫水、透明，并用中性樹膠封片。在顯微鏡(Olympus，BX53)下對(duì)組織切片進(jìn)行觀察并照相，用Photoshop 5.0軟件處理圖像。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用t-檢驗(yàn)法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 玻璃扯旗魚成熟性腺的特征

肉眼觀察結(jié)果：玻璃扯旗魚成體透明，肌肉骨骼清晰可見，可直接觀察到其內(nèi)臟(圖1-A，F(xiàn))。在部分4月齡的雌魚腹部近尾處可見透明至黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)，黃色顆粒所占區(qū)域隨生長(zhǎng)時(shí)間的推移逐漸增多，至5月齡時(shí)雌魚腹部后上半部基本充滿了黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)，6月齡時(shí)雌魚卵巢完全發(fā)育成熟(圖1-B)。雄魚的黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)部位呈透明狀態(tài)，至5～6月齡時(shí)發(fā)育成乳白色的精巢，且肉眼可見(圖1-G)。解剖6月齡的成魚，可獲得完整的卵巢和精巢組織(圖1-C，H)。雌魚的卵巢呈橢球形，卵巢周圍包裹著卵細(xì)胞和透明的脂肪組織，肝臟覆蓋卵巢前半部，膽囊位于卵巢雙葉中間(結(jié)果未顯示)。石蠟切片結(jié)果顯示，卵巢外圍為肉眼可見顆粒狀卵子，內(nèi)部為各時(shí)相的卵母細(xì)胞，包括初級(jí)生長(zhǎng)期(Ⅰ期)、皮質(zhì)泡期(Ⅱ期)、卵黃增生期(Ⅲ期)、卵母細(xì)胞成熟期(Ⅳ期)以及成熟卵期(Ⅴ期)的卵母細(xì)胞(圖1-D)。另外，還觀察到核仁、放射膜、油滴、卵黃顆粒、卵黃核以及濾泡膜等組織學(xué)結(jié)構(gòu)(圖 1-E)。雄魚精巢為長(zhǎng)囊形(圖1-I)，呈乳白色，外圍被透明的脂肪組織包被，多為成對(duì)出現(xiàn)，頭部相連。H.E.染色為深紫色，精小管管腔前端可見初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞，管腔內(nèi)充滿大量精子(圖1-J)。

圖1 玻璃扯旗魚的成熟性腺Fig.1 Gonads of adult pristella maxillaries

2.2 不同日齡玻璃扯旗魚的性別鑒定結(jié)果

觀察結(jié)果(表1)表明：雌性成魚的體寬明顯大于雄魚的，6月齡雌魚的體寬、體長(zhǎng)比值顯著高于雄魚的，且二者的差異極顯著(P＜0.01)，而二者體高、體長(zhǎng)比值間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4月齡時(shí)，雌魚的體高、體長(zhǎng)比值顯著高于雄魚的(P＜0.05)，但二者的體寬、體長(zhǎng)比值間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 玻璃扯旗魚雌雄體型的參數(shù)比Table 1 Comparison on body parameters between female and male Pristella maxillaris

隨機(jī)取出6月齡成魚22條，根據(jù)體型進(jìn)行初步判定，其中 10條為雄魚， 12條為雌魚。對(duì)這22條魚進(jìn)行解剖的結(jié)果表明，被初步判定為雄魚的10條魚的體內(nèi)均能取出精巢，而被初步判定為雌魚的12條中有9條能取出完整卵巢，另外3條魚的卵巢發(fā)生了退化。小于4月齡的玻璃扯旗魚僅在腹部可觀察到透明組織，其體寬、體長(zhǎng)及體高等形態(tài)特征也無(wú)差別，因此無(wú)法判斷其性別。對(duì) 50～110日齡魚進(jìn)行解剖的結(jié)果顯示：110日齡時(shí)，24條魚中的9條有精巢，12條有卵巢，3條不能區(qū)分性別；90日齡時(shí)，24條魚中的10條有精巢，13條有卵巢，1條不能區(qū)分性別；70日齡時(shí)，25條魚中的8條有精巢，9條有卵巢，8條不能區(qū)分性別；50日齡時(shí)，20條魚的性腺分布位置均為透明球狀組織，無(wú)精巢或卵巢存在，均無(wú)法區(qū)分性別。

2.3 玻璃扯旗成魚的性別特征

在顯微鏡下觀察 6月齡玻璃扯旗魚的臀鰭，發(fā)現(xiàn)雄魚的臀鰭有小齒狀結(jié)構(gòu)(圖2-A，B，C，D)，而雌魚的臀鰭無(wú)小齒狀結(jié)構(gòu)(圖 2-E，F(xiàn)，G，H)。144條5月齡成魚中，67條的臀鰭具有小齒，77條無(wú)小齒，且能根據(jù)該小齒狀結(jié)構(gòu)鑒別性別。100日齡的玻璃扯旗魚難以通過(guò)體型辨別雌雄，在顯微鏡下觀察42條魚的臀鰭，其中14條魚的臀鰭鰭條小結(jié)間有小齒，但數(shù)量明顯比成年雄魚的少，同時(shí)可觀察到鉤狀小齒的生長(zhǎng)過(guò)程(圖2-C，圖3-A，B)。進(jìn)一步的解剖結(jié)果表明，臀鰭有小齒的14條魚均為雄魚，通過(guò)切片能觀察到其典型的精巢組織(圖3-C)；臀鰭上無(wú)小齒的28條魚均為雌魚(圖3-D，E)。卵巢結(jié)構(gòu)石蠟切片中僅能觀察到Ⅰ期至Ⅲ期時(shí)相的卵母細(xì)胞，未見到Ⅳ期和Ⅴ期時(shí)相的卵母細(xì)胞，表明100日齡雌魚的卵巢發(fā)育未成熟(圖3-F，G)。隨機(jī)選取22條90日齡魚、27條70日齡魚和50日齡魚進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)90日齡只有4條、27日齡僅有1條臀鰭上有類小齒結(jié)構(gòu)(圖3-H、I)，而50日齡魚均未觀察到有小齒結(jié)構(gòu)(圖 3-J、K)，表明這一特征只適用于鑒定100日齡之后玻璃扯旗魚的性別。

圖2 玻璃扯旗成魚的性別特征Fig.2 Sex characteristics of adult Pristella maxillaris

圖3 玻璃扯旗魚幼魚的臀鰭及性腺Fig.3 Anal fin and gonads of larval Pristella maxillaris

2.4 玻璃扯旗幼魚性腺發(fā)育的組織學(xué)特點(diǎn)

用石蠟切片法分析2月齡前玻璃扯旗魚性腺發(fā)育的結(jié)果表明，5～10日齡幼魚中未觀察到明顯分化的生殖腺；15日齡幼魚只有一側(cè)有性腺，其生殖細(xì)胞明顯比周圍的體細(xì)胞大(圖4-A，B，C)，石蠟切片的縱切結(jié)果顯示其性腺組織位置與成魚的一致(圖4-G)，且觀察到由卵原細(xì)胞分裂所形成的“生殖包囊”(圖4-H)；25日齡時(shí)，腹腔兩側(cè)可觀察到對(duì)稱分布的類似卵巢結(jié)構(gòu)(圖4-D)； 在15～25日齡的切片中未觀察到類似精巢(睪丸)的結(jié)構(gòu)，所有幼魚性腺均為未分化狀態(tài)；30日齡時(shí)有精巢，部分幼魚的性腺組織從較為膨大的類卵巢結(jié)構(gòu)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的棒狀精巢結(jié)構(gòu)(圖4-I)，其余則繼續(xù)發(fā)育為卵巢，此時(shí)玻璃扯旗魚已開始性別分化；隨著時(shí)間推移，卵巢體積不斷增大，各級(jí)卵母細(xì)胞數(shù)量不斷增多(圖4-E，F(xiàn))，至3月齡時(shí)其雌雄性別比接近1∶1。

圖4 5～50日齡玻璃扯旗幼魚性別分化的組織學(xué)特征Fig.4 Histological characteristics of sex differentiation during 5～50 dpf in pristella maxillaries

3 結(jié)論與討論

對(duì)青鱂、斑馬魚及贛昌鯽進(jìn)行研究的結(jié)果表明，發(fā)育早期的雌、雄個(gè)體性腺并非雙葉，此時(shí)生殖腺僅出現(xiàn)于體腔一側(cè)[17,19-20]。本研究中玻璃扯旗魚的性腺發(fā)育初期也具有類似現(xiàn)象。在斑馬魚性腺發(fā)育的早期，所有個(gè)體均有未分化的卵巢樣結(jié)構(gòu)生殖腺，即表現(xiàn)出幼年雌雄同體現(xiàn)象[21]。玻璃扯旗魚的性腺組織在發(fā)育初期也是典型的“類卵巢”結(jié)構(gòu)，屬幼年雌雄同體。根據(jù)體型及相關(guān)參數(shù)可判斷6月齡及以上玻璃扯旗魚的性別，而無(wú)法判斷4月齡前玻璃扯旗魚的性別。對(duì)于4月齡前的玻璃扯旗魚，盡管不能根據(jù)形態(tài)明確區(qū)分性別，但通過(guò)解剖可獲得70日齡至4月齡的玻璃扯旗魚的性腺結(jié)構(gòu)，表明此時(shí)性別分化過(guò)程已基本完成，而 50日齡幼魚僅能觀察到透明結(jié)構(gòu)而無(wú)法判斷性別，該結(jié)果提示性別分化的關(guān)鍵時(shí)期發(fā)生在70日齡之前。

從解剖水平看，70日齡至4月齡玻璃扯旗魚的性別分化已基本完成，但這一時(shí)期是否可以通過(guò)形態(tài)指標(biāo)來(lái)區(qū)分其性別還有待探討。墨西哥脂鯉成年雄魚臀鰭上均存在小齒狀結(jié)構(gòu)，其小齒數(shù)量為7～78個(gè)，而雌魚的臀鰭沒有該結(jié)構(gòu)，由此推斷，雄魚臀鰭的這種小齒在交配時(shí)可鉤住雌魚，從而減小精子的稀釋，提高受精率[22]。類似的結(jié)構(gòu)在其他脂鯉科魚類及青鳉中也有報(bào)道[23-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，6月齡玻璃扯旗雄魚、部分100日齡甚至70日齡的幼魚臀鰭上也有類似小齒狀結(jié)構(gòu)。解剖帶小齒的 100日齡魚，通過(guò)組織切片可觀察到精巢結(jié)構(gòu)，推測(cè)這一結(jié)構(gòu)可能與玻璃扯旗魚性別分化密切相關(guān)，但該結(jié)構(gòu)何時(shí)開始發(fā)育、何時(shí)發(fā)育成熟以及該結(jié)構(gòu)是否與性別分化相關(guān)等仍有待研究。

對(duì)玻璃扯旗魚的研究還處于初級(jí)階段，其早期性腺發(fā)育及性別分化研究還有待完善：2～4月齡玻璃扯旗魚的性腺?gòu)念w粒狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成精巢或卵巢組織的比率不太穩(wěn)定，這可能由同一批魚的生長(zhǎng)差異所致，后續(xù)研究中應(yīng)同時(shí)綜合年齡、體長(zhǎng)以及飼養(yǎng)環(huán)境等多種因素來(lái)了解其性腺發(fā)育及性別分化的全過(guò)程；玻璃扯旗魚性母細(xì)胞發(fā)育成類卵巢的過(guò)程也還需探究，后續(xù)可通過(guò)研究一系列性腺相關(guān)基因，如vasa、dnd來(lái)了解該過(guò)程。

玻璃扯旗魚臀鰭上的小齒狀結(jié)構(gòu)能作為判別成魚性別的第二性征，可為該魚的繁殖及人工授精等提供技術(shù)支撐；對(duì)幼魚性腺組織學(xué)特征的研究結(jié)果可為后期研究性別分化的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Sexual characteristics of Pristella maxillaris and histological exploration on sex differentiation in its juveniles

PENG Ya1,2，YANG Qing1，DENG Zhiwen2，DONG Siyuan2，LIU Zhiwei2*
(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Analysis on sex differentiation and gonadal development of Pristella maxillaris was conducted in the study by morphological, anatomical and histological methods. The results showed that different stages of oocytes could be observed at 6-month-old female fish, and a large number of sperm filled in seminiferous tubules of male testis. The sexual characteristics emerged with appearance of yellow granular structure in abdomen or the uplifted abdomen when fishes were over 4-month-old. Hook-shaped teeth were also observed in the anal fins of fishes over 100- day-old age,however, they could not be observed when fishes were in less two months. Based on the analysis from the gonads in 5 to 50 day-old fishes, it showed that there was no differentiated gonads in both sides of dorsal abdominal cavity at 10 days post-fertilization (dpf); later, there was germline cysts found in the abdominal cavity at 15 dpf, and the gonadal tissue was only spotted at one side of the abdominal cavity before 15 days. The ovary-like structure (‘juvenile ovary’)symmetrically appeared at 25 dpf and the baculiform testis appeared at 30 dpf. All these facts could provide a further study reference for sex differentiation, gonadal development and their regulative mechanism.

Pristella maxillaris; gonadal development; sex differentiation; sex characteristics

S917；Q953+.4

A

1007-1032(2017)04-0427-06

2017-02-25

2017-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572591，31101050 )；上海市教委創(chuàng)新項(xiàng)目(13YZ094)

彭亞(1990—)，男，湖南岳陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事魚類生殖及性別分化研究，pengya182@163.com；*通信作者，劉志偉，博士，主要從事動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究，zwliu@shou.edu.cn