豬薩佩羅病毒間接免疫熒光方法的建立與初步應(yīng)用

彭旺，唐小明，葛猛，楊濤濤，屈泰龍，余興龍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

豬薩佩羅病毒間接免疫熒光方法的建立與初步應(yīng)用

彭旺1，唐小明2，葛猛1，楊濤濤1，屈泰龍1，余興龍1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

以分離的豬薩佩羅病毒PSV HuN1/2016株感染PK15細(xì)胞，制備抗原板，建立檢測(cè)豬血清中PSV 抗體的間接免疫熒光(IFA)方法。結(jié)果表明：一抗最佳稀釋濃度為1∶300；FITC標(biāo)記的羊抗豬熒光二抗最佳稀釋濃度為1∶300。該方法特異性強(qiáng)，敏感度高，既能將PSV抗體與PRRSV、FMDV、PCV、CSFV抗體區(qū)分開(kāi)，也可以檢測(cè)到中和效價(jià) 0.128的陽(yáng)性血清。用該方法檢測(cè)湖南省部分規(guī)?；i場(chǎng) 208份臨床血清樣品的總陽(yáng)性率為68%，表明PSV在湖南省流行普遍，且其感染主要發(fā)生在保育階段。

豬薩佩羅病毒；間接免疫熒光；抗體檢測(cè)；湖南

豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus, PSV)是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科薩佩羅病毒屬[1]。PSV曾被命名為PEV-8，被歸類為豬腸道病毒A(PEV-A)[2]。因PSV病毒特有的L蛋白和結(jié)構(gòu)高度特異的 2A 基因及 5′端非編碼區(qū)(UTR)能將其與其他的腸道病毒區(qū)分開(kāi)，后來(lái)將其歸類為一個(gè)新的屬[3-4]，2009年，國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)正式將豬腸道病毒A(Porcine enterovirus A)更名為豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus)[1]。薩佩羅病毒屬包含豬薩佩羅病毒(Porcine sapelovirus)、禽薩佩羅病毒(Avian sapelovirus)和猿薩佩羅病毒(Simian sapelovirus)。豬薩佩羅病毒只有一個(gè)血清型，家豬和野豬均可感染[5]，且感染豬只康復(fù)后依然會(huì)繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳染源[6]，因此，該病毒在飼養(yǎng)的豬群中感染率很高[7]。該病毒最早于1960年在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在加拿大、日本、澳大利亞等世界范圍內(nèi)的其他國(guó)家相繼報(bào)道[9-11]。PSV可引起豬腦脊髓灰質(zhì)炎、肺炎、繁殖障礙、心包炎、心肌炎、皮膚損傷、腹瀉等多系統(tǒng)綜合征，同時(shí)也可出現(xiàn)無(wú)明顯特征的亞臨床癥狀[12]。無(wú)論 PSV以何種形式存在，都對(duì)養(yǎng)豬業(yè)具有潛在的危害。

PSV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定、RT-PCR等，但這些方法主要用于檢測(cè)病原，且對(duì)試驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高。目前還沒(méi)有關(guān)于豬薩佩羅病毒血清流行學(xué)方法的報(bào)道，還很難準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)本病在豬群中的流行與感染情況。本研究中以實(shí)驗(yàn)室分離的豬薩佩羅病毒 PSV HuN1/2016株為標(biāo)準(zhǔn)制備細(xì)胞抗原板，建立檢測(cè)豬血清中PSV抗體的間接免疫熒光(IFA)方法，旨在為 PSV的血清流行病學(xué)調(diào)查提供一種高敏感度和高特異性的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

PSV HuN1/2016分離株(GenBank登錄號(hào)為KX354740)、PK15細(xì)胞由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物微生物免疫實(shí)驗(yàn)室分離與保存。

1.2 血清

PSV陰性血清采集于健康生長(zhǎng)的豬。PSV陽(yáng)性血清采集于受 PSV病毒感染的豬。經(jīng)中和試驗(yàn)驗(yàn)證，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV-2)和豬瘟病毒(CSFV)陽(yáng)性而PSV陰性的抗體的由1.1中實(shí)驗(yàn)室制備與保存。臨床血清樣品采自湖南省長(zhǎng)沙、株洲、岳陽(yáng)、邵陽(yáng)等地的6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)。

1.3 主要試劑

羊抗豬IgG熒光二抗(FITC-IgG)為KPL公司產(chǎn)品；多聚甲醛、伊文思藍(lán)和無(wú)熒光甘油均為中國(guó)產(chǎn)品。

1.4 抗原板的制備

將 PK15細(xì)胞于 96孔板培養(yǎng)至單層后接種200TCID50PSV HuN1/2016，以未接毒細(xì)胞為對(duì)照。當(dāng)20%細(xì)胞出現(xiàn)病變后棄去培養(yǎng)液，PBST洗滌后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，-20 ℃保存，備用。

1.5 間接免疫熒光法(IFA)

將已固定的細(xì)胞抗原板用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入10%山羊血清，37 ℃封閉2 h，棄掉封閉液，每孔加入100 μL稀釋的血清，4 ℃孵育12 h。PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入100 μL稀釋的羊抗豬IgG熒光二抗，37 ℃作用30 min。PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入50 μL 0.01%伊文思藍(lán)水溶液，室溫染色20 s，PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加入30 μL無(wú)熒光甘油封底，用熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清和熒光二抗的最佳稀釋度

用0.01 mol/L pH7.4的PBS緩沖液將陽(yáng)性和陰性血清按1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀釋，熒光二抗按 1∶100、1∶200、1∶300、1∶400稀釋。根據(jù)方陣試驗(yàn)確定血清最佳稀釋度為1∶300，熒光二抗最佳稀釋度為1∶300。在熒光顯微鏡下，陽(yáng)性血清孔可見(jiàn)細(xì)胞漿內(nèi)和膜上有綠色熒光染色(圖1-A)，陰性血清孔沒(méi)有非特異性熒光染料附著，且在伊文思藍(lán)染色下呈紅色(圖 1-B)。以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)被檢測(cè)的血清進(jìn)行判定。

圖1 PSV間接免疫熒光法檢測(cè)血清的陰性和陽(yáng)性結(jié)果(20×10)Fig.1 Reaction of antibodies from serum samples against PSV detected by IFA(20×10)

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用PRRSV、FMDV、PCV-2和CSFV抗體進(jìn)行交叉性試驗(yàn)，確定抗原板的特異性。結(jié)果顯示：4種參考陽(yáng)性血清檢測(cè)孔均未見(jiàn)任何特異性熒光，表現(xiàn)為陰性，表明該方法具有很好的特異性。

2.3 敏感度試驗(yàn)結(jié)果

將 PSV 陽(yáng)性血清(中和效價(jià)為 1∶128)依次做1∶10、1∶100、1∶1 000的10倍梯度稀釋，進(jìn)行間接免疫熒光敏感度試驗(yàn)。結(jié)果顯示：當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋到1∶1 000時(shí)，血清檢測(cè)孔仍然有特異性熒光，表明該方法可以檢測(cè)到中和效價(jià)0.128的陽(yáng)性血清。

2.4 對(duì)臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果

用該方法對(duì)湖南省6個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)(記為A、B、C、D、E、F)208份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：有142份樣品為陽(yáng)性，樣品總陽(yáng)性率為68%，表明PSV在湖南省流行普遍。

表1 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results on clinic serum samples detected by IFA

3 結(jié)論與討論

對(duì)PSV的檢測(cè)目前主要以RT-PCR病原檢測(cè)為主，但RT-PCR檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且組織中病毒含量低時(shí)難以檢測(cè)出結(jié)果，檢測(cè)出的感染率可能會(huì)低于實(shí)際感染率。RT-PCR病原檢測(cè)也不適于曾經(jīng)感染病毒但病毒已在豬體內(nèi)消失的情況，而針對(duì)抗體檢測(cè)的免疫熒光方法可有效解決這一問(wèn)題，有利于更加全面和系統(tǒng)地了解PSV的流行情況。

在本試驗(yàn) PSV抗體的間接免疫熒光方法建立過(guò)程中，將參考陽(yáng)性血清稀釋到1 000倍時(shí)仍然能夠檢測(cè)到特異性熒光，但將弱陽(yáng)性血清稀釋400倍時(shí)的檢測(cè)結(jié)果與陰性結(jié)果相差不大，而當(dāng)血清稀釋倍數(shù)小于200倍時(shí)，部分檢測(cè)血清存在一定程度的非特異性熒光干擾，這可能與豬血清的非特異性吸附[13]有關(guān)，因此，臨床大批量檢測(cè)的血清最佳稀釋倍數(shù)為300倍。在減少非特異性熒光干擾試驗(yàn)中，用10%山羊血清作為封閉液比用5%脫脂奶粉封閉液的效果好，推測(cè)這與本試驗(yàn)中使用與熒光二抗羊抗豬來(lái)源同系的非免疫血清封閉有關(guān)。此外，本研究中建立的檢測(cè) PSV抗體的間接免疫熒光方法與PRRSV、FMDV、PCV-2和PRV抗體無(wú)交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。

用建立的檢測(cè)方法檢測(cè)湖南省6個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的208份臨床血清樣品，其中有142份樣品為陽(yáng)性，樣品總陽(yáng)性率為68%。進(jìn)一步分析不同年齡階段豬群的 PSV抗體情況，結(jié)合 1.1中實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA方法檢測(cè)不同日齡豬血清的檢測(cè)結(jié)果，仔豬群的陽(yáng)性率低，保育豬的陽(yáng)性率升高，育肥豬的陽(yáng)性率居高不下，依此可以推測(cè)PSV的感染規(guī)律：哺乳仔豬群因有母源抗體保護(hù)，抗體保護(hù)力較強(qiáng)；斷奶后隨著母源抗體消退，抗體保護(hù)力減弱；保育階段豬群出現(xiàn)PSV感染，育肥階段豬群抗體陽(yáng)性率居高不下，表明PSV抗體在豬體內(nèi)維持的時(shí)間比較長(zhǎng)。

目前關(guān)于PSV血清學(xué)研究的報(bào)道尚少。本研究中建立的適用于快速、大批量檢測(cè)豬血清中PSV抗體的間接免疫熒光檢測(cè)方法，可為PSV血清流行病學(xué)研究提供參考。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Establishing the indirect immunofluorescence assay for antibody detection from Porcine sapelovirus

PENG Wang1, TANG Xiao ming2, GE Meng1, YANG Taotao1, QU Tailong1, YU Xinglong1*
(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Animal Disease Control Center of Hunan Province, Changsha 410007, China)

Indirect immunofluorescence assay (IFA) for detecting antibody of Porcine sapelovirus (PSV) from porcine serum was established by employed the strain PSV HuN1 cultured in PK-15 cells as antigen coating in plate. The primary antibody and fluorescent secondary antibody in the test were diluted to 300 times. The results showed that the approach not only had high specificity and sensitivity which could discriminate PSV from other porcine virus antigens(such as PRRSV, FMDV, PCV, and CSFV), but also could detect positive serum sample with concentration low to 0.128 SN titer. The fact detected by the established method that 68% samples out of 208 serums from commercial farms scattered in Hunan province were positive indicated that the PSV was widely prevalent in the region, and the infection was mainly occurred in the weaning period.

Porcine sapelovirus; indirect immunofluorescence assay; antibody detection; Hunan province

S858.28

A

1007-1032(2017)04-0423-04

2017-02-20

2017-03-11

彭旺(1991—)，男，湖南衡陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物病原分子學(xué)與免疫學(xué)研究，xuyi2030@163.com；*通信作者，余興龍，博士，教授，主要從事動(dòng)物病原分子學(xué)與免疫學(xué)研究，xlyu999@126.com