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    口服補液的微生物限度檢查方法學(xué)驗證

    2017-07-18 12:07:01戴宇婷倪兆武侯晉芳
    中國藥物經(jīng)濟學(xué) 2017年2期
    關(guān)鍵詞:方法

    戴宇婷 倪兆武 侯晉芳

    口服補液的微生物限度檢查方法學(xué)驗證

    戴宇婷 倪兆武 侯晉芳

    目的建立醫(yī)院制劑口服補液的微生物限度檢查方法,確保該方法所得結(jié)果可靠準確。方法根據(jù)2015年版《中國藥典》四部(通則1105、1106)對口服補液的微生物限度檢查法進行方法學(xué)驗證。結(jié)果微生物計數(shù)法(需氧菌計數(shù)及霉菌酵母菌計數(shù)):采用常規(guī)法進行微生物計數(shù)的檢查時原液有抑菌作用,1:10稀釋后5種實驗菌的回收率均達到要求;采用薄膜過濾法進行實驗5種實驗菌回收率均達到要求??刂凭臋z查法:可以采用常規(guī)法進行。結(jié)論對本品進行微生物限度檢查時,應(yīng)充分考慮采用一定的方法,消除其抑菌性后再依法檢查。

    醫(yī)院制劑;口服補液;微生物限度檢查;方法學(xué)驗證

    口服補液是該地區(qū)醫(yī)院常用醫(yī)院制劑,用于嘔吐、腹瀉等引起的輕中度脫水,可補充體內(nèi)電解質(zhì)及水分。微生物限度檢查作為控制藥品質(zhì)量的一項重要指標,由于不同藥品對微生物的抑制作用差別較大,為了保證方法的可靠性,使實驗結(jié)果與藥品中所含微生物的真實值盡可能接近,按照《中國藥典》2015年版規(guī)定對口服補液的微生物限度檢查方法進行驗證。本實驗參考相關(guān)研究[1-5],選擇適當?shù)臋z查方法,以建立適合口服補液的微生物限度檢查方法,保證結(jié)果可靠準確。本研究根據(jù)《中國藥典》2015年版規(guī)定的檢查方法,加入5種標準菌株(銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌、白色念珠菌)于制劑中,驗證各試驗菌的回收率,建立本品的微生物計數(shù)方法。加入大腸埃希菌進行檢出實驗,從而建立本品的控制菌檢查方法。

    1 儀器與材料

    1.1 樣品、培養(yǎng)基及試藥口服補液(批號:20160310、20160603),由昭通市第一人民醫(yī)院提供;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 TSB(批號:1601132)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA(批號:151223)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB(批號:151102)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 SDA(批號:1512292)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號:1512163)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號:160111)、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:1512292),以上均為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品,并進行過培養(yǎng)基適用性檢查;其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

    1.2 儀器與設(shè)備LRH-250F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),Htysteritest-601集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司),HH-S24恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠),YJ-1450 DA超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠),BHC-1300ⅡA2生物安全柜(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),GZX- 9246MBE鼓風(fēng)電熱干燥箱、YXQ-LS-75G壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司),全自動微生物鑒定系統(tǒng) Vitek2 Compact(法國梅里埃公司)。

    1.3 試驗菌株大腸埃希菌[CCMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],以上均由中國食品藥品檢定研究院提供,且菌株傳代次數(shù)均不超過5代。

    2 方法及結(jié)果

    2.1 菌液的制備分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB中,35 ℃培養(yǎng)24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)至SDB中,25 ℃培養(yǎng) 3d;接種黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種于SDA上,25 ℃培養(yǎng)5 d,加入無菌0.9%氯化鈉溶液5 ml,將孢子洗脫到無菌0.9%氯化鈉溶液中制成孢子懸液,轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)。取上述培養(yǎng)物,用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1毫升含菌或孢子數(shù)<100 CFU的菌或孢子懸液,備用。

    2.2 供試品的制備原液供試液:分別取2個最小包裝的樣品,混合均勻即锝。1:10供試液:取上述原液供試液10 ml,加無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,混合均勻即锝。

    2.3 微生物計數(shù)法

    2.3.1 傾注法回收率測定 ①實驗組:取上述原液供試液 1 ml分別與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和白色念珠菌試驗菌懸液1 ml,注入平皿中。傾注TSA,每株試驗菌平行制備2個平板。待凝固后,35 ℃培養(yǎng)3 d,逐日觀察結(jié)果,分別計數(shù)前3種菌的平板;35 ℃培養(yǎng)5 d,逐日觀察結(jié)果,計數(shù)白色念珠菌和黑曲霉的平板。取上述原液供試液1 ml、白色念珠菌和黑曲霉試驗菌懸液各1 ml,分別注入平皿中,傾注SDA,每株試驗菌平行制備2個平板。待凝固后,25 ℃培養(yǎng)5 d,逐日觀察結(jié)果并計數(shù)。取上述1:10供試液照上述方法操作。

    ②供試品對照組:以稀釋液代替菌液,分別取上述制備好的原液供試液和1:10供試液,同實驗組操作,測定供試品本底菌數(shù)。

    ③菌液對照組:取不含中和劑及滅活劑的稀釋液(無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)替代供試液,按實驗組操加入試驗菌液,進行微生物回收試驗。測定每一菌株試驗菌1 ml中所含的菌數(shù)。

    ④結(jié)果:回收率計算方法:實驗組菌回收率(%)=(實驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液對照組菌落數(shù)×100%。本品采用常規(guī)法檢查,在TSA培養(yǎng)基中:原液供試品對銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白色念珠菌的人工染菌回收率均<50%,對金黃色葡萄球菌的人工染菌回收率在0.5~2.0范圍內(nèi);1:10供試品對5種菌的人工染菌回收率均在0.5~2.0范圍內(nèi)。在SDA培養(yǎng)基中:原液供試品對白色念珠菌的人工染菌回收率在 0.5~2.0范圍內(nèi),對黑曲霉的人工染菌回收率<50%;1:10供試品對兩種菌的人工染菌回收率均在 0.5~2.0范圍內(nèi)。因此,本品原液需氧菌和霉菌及酵母菌的計數(shù)均未達到要求,需要消除其抑菌活性或重新選擇適當?shù)姆椒ㄔ龠M行驗證。但1:10的細菌和霉菌及酵母菌的計數(shù)結(jié)果符合要求。結(jié)果見表1-4。

    表1 常規(guī)法驗證原液回收率結(jié)果(TSA)

    表2 常規(guī)法驗證1:10供試液回收率結(jié)果(TSA)

    表3 常規(guī)法驗證原液回收率結(jié)果(SDA)

    表4 常規(guī)法驗證1:10供試液回收率結(jié)果(SDA)

    2.3.2 薄膜過濾法 稀釋液和沖洗液均為無菌 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液以下簡稱緩沖液。

    ①實驗組:加入50 ml緩沖液過濾潤濕濾膜,取原液供試液1 ml加入50 ml稀釋液中,經(jīng)薄膜過濾,用緩沖液沖洗,100 ml/次,反復(fù)3次,分別在最后一次沖洗液中加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白色念珠菌菌液各1 ml,抽濾。取膜置TSA平板上,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌35 ℃培養(yǎng)3 d,黑曲霉和白色念珠菌35 ℃培養(yǎng)5 d;另制備白色念珠菌和黑曲霉各1張濾膜,置SDA平板上,25 ℃培養(yǎng)5 d;逐日觀察結(jié)果。

    ②供試品對照組:取制備好的供試液,同實驗組操作,最后一次沖洗液中以稀釋液代替菌液加入,逐日觀察結(jié)果。測定供試品本底菌數(shù)。

    ③菌液對照組:取不含中和劑及滅活劑的緩沖液代替供試液,按實驗組操作,加入菌液,逐日觀察結(jié)果。測定每1毫升各實驗菌所含菌數(shù)。

    ④結(jié)果:按傾注法回收率測定所述的計算公式,代入實驗結(jié)果計算。本品采用薄膜過濾法進行測定,需氧菌總數(shù):銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白色念珠菌的回收率均在0.5~2.0范圍內(nèi);霉菌和酵母總數(shù):黑曲霉和白色念珠菌的回收率均在 0.5~2.0范圍內(nèi)。因此,本品的微生物計數(shù)方法可以采用薄膜過濾法(沖洗 3次,100 ml/次)。結(jié)果見表5-6。

    2.4 控制菌檢查方法大腸埃希菌:①實驗組:取1:10供試液10 ml(相當于1 ml)及1 ml的大腸埃希菌菌液,接種至100 ml的TSB中,混勻,于35 ℃培養(yǎng)18 h。取TSB培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42 ℃培養(yǎng)24 h。再劃線接種至麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,35 ℃培養(yǎng)18 h,記錄結(jié)果,并進行生化鑒定。②供試品對照組:取1:10的供試液10 ml,以稀釋液1 ml代替菌液,同實驗組操作方法。③菌液對照組:取10 ml不含中和劑及滅活劑的稀釋液替代供試液,加入1 ml的大腸埃希菌菌液按實驗組操作方法。④陰性對照組:以稀釋劑代替供試液,接種至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,余同實驗組操作方法。

    表5 薄膜過濾法驗證回收率結(jié)果(TSA)

    表6 薄膜過濾法驗證回收率結(jié)果(SDA)

    結(jié)果:上述供試品對照組和陰性對照組均未檢出大腸埃希菌,而實驗組和菌液對照組檢出試驗菌,說明該方法成立。

    3 討論

    依據(jù)2015年版《中國藥典》的規(guī)定,為了確認所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查,必須對相應(yīng)檢驗方法進行方法學(xué)驗證??诜a液為復(fù)方制劑,含有多種成分,其中任何一種成分具有抑制微生物生長繁殖作用均可影響微生物限度檢查的結(jié)果。為保證微生物限度檢查實驗結(jié)果真實可靠,以控制該醫(yī)院制劑的質(zhì)量,本研究對該產(chǎn)品的微生物計算法和控制菌檢查法進行了方法驗證。

    筆者不能直接判定口服補液對需氧菌、霉菌和酵母菌以及控制菌大腸埃希菌的抑菌程度,因此考察了不同稀釋級的常規(guī)法。2015版藥典中微生物計數(shù)法的計數(shù)方法新增了最可能數(shù)法(Most-Probable-Number Method,簡稱MPN法),可能是更適合于某些微生物污染量很小的供試品方法,用于微生物計數(shù)時MPN法的精確度比較差。MPN法的準確度和精密度不及平皿計數(shù)法和薄膜過濾法,而且霉菌計數(shù)也不能使用該方法,僅在沒有適宜計數(shù)方法對供試品需氧菌總數(shù)進行實驗的情況下方能使用。因此,本研究未對MPN法進行方法驗證。

    [1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京, 2010:附錄107-116.

    [2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351-382.

    [3] 嚴曉明,劉萌,朱燕.四種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法學(xué)驗證[J].中國藥事,2015,29(5):485-491.

    [4] 張國慶,程龍,杜建紅,等.稀戊二醛溶液的微生物限度檢查方法的建立及方法學(xué)驗證[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014,31(8):977-981.

    [5] 孫鶯,郭朝暉,宋京都.8種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].中國藥事,2014,28(8):839-842.

    10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.006

    昭通市食品藥品檢驗所,云南昭通 657000

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