發(fā)酵型核桃乳生產(chǎn)專用乳桿菌的選育

趙娟娟，吳榮榮，程書梅

（1.衡水學院生命科學系，河北衡水053000；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001）

發(fā)酵型核桃乳生產(chǎn)專用乳桿菌的選育

趙娟娟1，吳榮榮1，程書梅2

（1.衡水學院生命科學系，河北衡水053000；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001）

從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、酸菜中分離到14株乳桿菌，經(jīng)核桃乳發(fā)酵產(chǎn)酸特性初篩，確定菌株L5、L7、L8及L12適合核桃乳發(fā)酵。通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和16S rRNA基因序列分析，確定4株菌分別為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。將上述菌株與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發(fā)酵實驗，感官評分分別為78分、95分、83分和82分；4個發(fā)酵核桃乳中9種氨基酸含量均有不同程度提高，其中菌株L7發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸含量增幅最大，由0.67%增至1.60%。因此副干酪乳桿菌L7更適合發(fā)酵型核桃乳的生產(chǎn)。

發(fā)酵型核桃乳；乳桿菌；分離；鑒定

核桃仁營養(yǎng)成分豐富，其中主要成分是脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物，此外還含有豐富的膳食纖維、維生素及礦物質(zhì)元素。核桃乳是以核桃仁為原料經(jīng)浸泡、磨漿、過濾、均質(zhì)、殺菌后制成的植物蛋白飲品[1-2]。

核桃乳在乳酸菌的發(fā)酵過程中，能使其中的蛋白質(zhì)分解，且礦物質(zhì)、肽、氨基酸、B族維生素等物質(zhì)含量增加，可提高腸胃的消化吸收率[3-5]；同時乳酸菌的產(chǎn)香、產(chǎn)酸特性，使得發(fā)酵型核桃乳的風味更加濃厚，形成適口、風味獨特的飲品，增加了產(chǎn)品的腸道保健功能[6-8]。

本研究從不同來源的植物材料中，分離適合核桃乳發(fā)酵的乳桿菌，并對菌株進行形態(tài)和16S rRNA基因序列，確定其分類地位，最后進行核桃乳發(fā)酵實驗，確定最佳乳桿菌菌株。以期為發(fā)酵核桃乳的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）SA：從發(fā)酵面包中分離得到，保存于衡水學院微生物實驗室。

乳桿菌：從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、酸菜等食品中分離。

MRS培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，三水醋酸鈉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，瓊脂粉15.0g/L。pH6.2，分裝后121℃高壓滅菌15～20 min，固體培養(yǎng)基需加入瓊脂1.3%～1.5%。

番茄汁瓊脂（tomato juice agar，TJA）培養(yǎng)基：番茄汁50.0g/L，酵母膏5.0g/L，牛肉膏10.0g/L，葡萄糖2.0g/L，乳糖20.0g/L，乙酸鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L。pH6.6～7.0，121℃滅菌15 min，固體培養(yǎng)基需加入瓊脂1.3%～1.5%。

1.2 儀器與設備

TakaraThermalCyclerDiceTP600聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：日本TaKaRa公司；Mupid電泳儀：美國Major Science公司；ImageMaster VDS電泳成像裝置：安發(fā)瑪西亞生物技術公司；ABIPRISM3730XLDNASequencer脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）測序儀：美國應用生物系統(tǒng)公司；DM3000顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌的分離純化

上述植物源產(chǎn)品過濾后吸取1 mL（面包為1 g），用無菌生理鹽水10倍稀釋至10-5、10-6和10-7。取0.1 mL稀釋后樣品均勻涂布在MRS培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，劃線法分離純化獲得菌株。經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)物后轉(zhuǎn)入固體斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4℃冰箱中保存[9-11]。

1.3.2 乳桿菌的形態(tài)特征

將分離的菌種接種在MRS培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，觀察菌落的形態(tài)。菌株進行革蘭氏染色后用油鏡觀察菌株的形態(tài)[12-13]。

1.3.3 乳桿菌的16S rRNA基因序列分析

將乳桿菌的培養(yǎng)液使用TakaraMiniBEStBacteriaGenomic DNA ExtractionKitVer.2.0（Code No.DV810A）試劑盒進行基因組DNA的提取，取1μL進行瓊脂糖凝膠電泳。以基因組DNA為模版，使用Takara16SrRNABacterialIdentificationPCR Kit（CodeNo.D310）擴增，以特異性引物，乳桿菌L1目的片段，取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳。使用TakaraAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0（CodeNo.DV805A）切膠回收目的片段，取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。回收產(chǎn)物在寶生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在GeneBank中利用Blast程序進行比對。

1.3.4 核桃乳的發(fā)酵工藝流程

1.3.5 測定方法

發(fā)酵核桃乳感官評價：以色澤、香氣、滋味及形態(tài)作為核桃乳感官評分指標，邀請10人進行試飲評判。評分結(jié)果取其平均值計算[14-15]，滿分100分，感官評分標準見表1。

表1 發(fā)酵核桃乳感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut milk

氨基酸含量采用氨基酸自動分析儀進行檢測。酸度測定：取乳樣10 mL，加入20 mL蒸餾水和2～3滴酚酞試劑，用標定過的0.1004mol/LNaOH溶液進行滴定，酸度用吉爾涅爾度（°T）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌的分離及形態(tài)特征

共采集樣品4份，從中分離得到乳桿菌14株，分別命名為L1～L14，乳桿菌形態(tài)特征見表2。代表菌株L7的細胞及菌落形態(tài)特征見圖1。

表2 乳桿菌形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics ofLactobacillus

圖1 菌株L7的菌體（A）和菌落形態(tài)（B）Fig.1 Mycelial(A)and colony morphology(B)of strain L7

由表2可知，來自發(fā)酵面包的乳桿菌6株，占總分離菌株的43%；來自白芥絲的乳桿菌2株，占總數(shù)的14%；來自泡菜的乳桿菌4株，占總數(shù)的29%；來自酸菜的乳桿菌2株，占總數(shù)的14%。分離后的乳桿菌主要以細長桿狀占優(yōu)勢。

由圖1可知，分離得到的乳桿菌，細胞形態(tài)為桿狀，以單個或鏈狀存在，在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，形成乳白色圓形菌落，且表面光滑，邊緣整齊，無褶皺，直徑約1 mm。

2.2 乳桿菌的初篩

將乳桿菌L1～L14分別與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發(fā)酵實驗，產(chǎn)品酸度的檢測結(jié)果見表3。

表3 不同菌株發(fā)酵核桃乳酸度測定結(jié)果Table 3 Determination results of acidity in walnut milk fermented by different strains

由表3可知，經(jīng)過菌株L5、L7、L8、L12制備的發(fā)酵核桃乳酸度為40～45°T，感官評價結(jié)果表明，由上述菌株制備的核桃乳酸甜適口，可作為后續(xù)研究的菌株。

2.3 乳桿菌序列分析結(jié)果

將4個菌株的16S rRNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株L5、L7、L8和L12的16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of strains L5,L7,L8 and L12

由圖2可知，菌株L5與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）CP005485.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結(jié)合菌體形態(tài)特征，菌株L5鑒定為鼠李糖乳桿菌；L7與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）CP007122.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結(jié)合菌體形態(tài)特征，菌株L7鑒定為副干酪乳桿菌；L8與食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）KJ095645.1的16S rRNA基因的相似性達到99%，結(jié)合菌體形態(tài)特征，菌株L8鑒定為食竇魏斯氏菌；L12與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）CP006690.1的16S rRNA基因的相似性達到100%，結(jié)合菌體形態(tài)特征，菌株L12鑒定為干酪乳桿菌。

2.4 發(fā)酵核桃乳感官評價結(jié)果

將乳桿菌L5、L7、L8、L12與嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發(fā)酵實驗，得到發(fā)酵核桃乳。分別為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4，感官評定結(jié)果見表4。

表4 不同菌株發(fā)酵核桃乳感官評分結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of walnut milk fermented by different strains

由表4可知，樣品2的感官評分結(jié)果最高，白色微顯灰色，具有核桃香氣，酸甜適口，乳酸味濃厚且柔和，均勻一致。

2.5 發(fā)酵核桃乳氨基酸含量

將乳桿菌L5、L7、L8、L12與嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發(fā)酵實驗，分別為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4，氨基酸含量檢測結(jié)果見表5。

表5 不同菌株發(fā)酵核桃乳氨基酸含量檢測結(jié)果Table 5 Determination results of amino acid contents in walnut milk fermented by different strains %

由表5可知，發(fā)酵型核桃乳與未發(fā)酵的對照相比，總的氨基酸含量均有不同程度的提高，菌株L7發(fā)酵后產(chǎn)品氨基酸含量增幅最大，由0.67%提高至1.60%，其中賴氨酸含量提高了5倍，亮氨酸含量提高了1.5倍。賴氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重點考慮了這兩種，綜合感官評價分數(shù)，最終選擇了菌株L7。

3 結(jié)論

本研究從特定植物來源的材料中分離得到了L5、L7、L8、L12四株乳桿菌。通過菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和16S rRNA基因序列分析，分別鑒定為鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、食竇魏斯氏菌、干酪乳桿菌。將上述菌株與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA進行核桃乳發(fā)酵特性試驗，結(jié)果表明，采用菌株L7與實驗室保存的嗜熱鏈球菌SA發(fā)酵得到的發(fā)酵核桃乳感官評價最佳，且具有較高的營養(yǎng)價值，適合用在核桃乳的發(fā)酵生產(chǎn)中。

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Screening ofLactobacillusused for fermented walnut milk

ZHAO Juanjuan1,WU Rongrong1,CHENG Shumei2
(1.Department of Life Science,Hengshui University,Hengshui 053000,China; 2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

14 strains ofLactobacilluswere isolated from fermented bread,white mustard silk,pickles and Chinese sauerkraut.After preliminary screening based on acid-producing characteristics in walnut milk fermentation,4 strains(strains L5,L7,L8 and L12)which were suitable for walnut milk fermentation were determined.By colonial morphology,mycelial morphology and 16S rRNA gene sequence analysis,4 strains were identified asLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus paracasei,Weissella cibariaandLactobacillus casei,respectively.The identified strains and laboratory preservedStreptococcus thermophilusSA were tested for the fermentation of walnut milk.The sensory evaluation score of fermented walnut milk were 78,95,83 and 82,respectively.9 kinds of amino acids contents in 4 fermented walnut milks were increased in different degrees,in which the increasing amplitude of amino acid content in the product fermented by strain L7 was the highest and increased from 0.67%to 1.60%.L.paracaseiL7 was more suitable for the production of fermented walnut milk.

fermented walnut milk;Lactobacillus;isolation;identification

TS201.1

0254-5071（2017）06-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.022

2017-02-21

趙娟娟（1982-），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術。