綿羊Lpin3基因多態(tài)性及其與尾型和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)研究

焦小麗，景炅婕，喬利英，李留安，陳明明,田川堯，康翠翠，劉文忠*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

綿羊Lpin3基因多態(tài)性及其與尾型和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)研究

焦小麗1,2，景炅婕1，喬利英1，李留安2，陳明明2,田川堯2，康翠翠2，劉文忠1*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384）

為探究Lpin3基因變異對(duì)綿羊肉用性狀的影響，選擇廣靈大尾羊和小尾寒羊兩品種脂尾型綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用DNA直接測(cè)序法檢測(cè)Lpin3基因5'非編碼區(qū)部分序列的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并分析SNPs與尾型和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)。結(jié)果檢測(cè)到Lpin3基因5'非編碼區(qū)起始密碼子上游約1 200 bp的DNA序列13個(gè)SNPs，其中-334～-332 ins TAA顯著降低了小尾寒羊的尾寬（P＜0.05），提高了小尾寒羊的屠宰性狀（P＞0.05），在小尾寒羊中的突變頻率顯著高于廣靈大尾羊（P＜0.05），對(duì)廣靈大尾羊各性狀無顯著影響（P＞0.05）。盡管不顯著，小尾寒羊中-443 T＞C與-334～-332 ins TAA具有相似的遺傳效應(yīng)。該研究可為綿羊Lpin3基因功能及肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

綿羊；Lpin3基因；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)研究

Lipin3是脂素（Lipins）家族蛋白（Lipin1，Lipin2，Lipin3）中研究最少的一個(gè)成員[1-2]，被Lpin3基因編碼。在脂質(zhì)代謝中，Lipins具有Mg2+依賴的磷脂酸磷酸酶（Phosphatidate Phosphatase，PAP）活性，催化磷脂酸生成甘油二酯[1]，并具有轉(zhuǎn)錄共激活核受體PPARα的雙重功能[3]。盡管Lipins成員間有相似的功能活性，但Lipin3的PAP酶活性和表達(dá)水平低于Lipin1和Lipin2[1]，Lipin3與Lipin1在脂肪組織中可互作補(bǔ)償，共同維持適宜的PAP酶活性[4]，此外Lipins成員間可形成同質(zhì)或異質(zhì)寡聚體[5]。人類全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）發(fā)現(xiàn)一個(gè)位點(diǎn)與空腹血糖水平相關(guān)，Lpin3可能是候選基因[6]。豬的Lpin3基因一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀顯著關(guān)聯(lián)[7]?；贚ipin3蛋白在脂質(zhì)代謝中的雙重活性以及功能機(jī)制的研究較為缺乏，本實(shí)驗(yàn)選擇脂尾有顯著差異的廣靈大尾羊和小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用DNA雙向直接測(cè)序法，檢測(cè)Lpin3基因5'非編碼區(qū)部分序列的單核苷酸多態(tài)性（SNPs），分析SNPs與綿羊尾型和屠宰性狀的關(guān)聯(lián)以及品種間的遺傳差異。兩品種脂尾型綿羊中，廣靈大尾羊?yàn)殚L(zhǎng)脂尾型綿羊，而小尾寒羊?yàn)槎讨残途d羊[8]。選擇尾型差異顯著的綿羊探析脂質(zhì)代謝調(diào)控基因Lpin3的遺傳變異，有助于揭示其在脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)制，為綿羊肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 2、4、6、8、10、12月齡廣靈大尾羊和小尾寒羊公、母各4只，共96只。取綿羊頸靜脈血液樣品20 mL，加4 mL ACD抗凝后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。血樣采集完畢，空腹稱重并測(cè)量尾長(zhǎng)、尾寬，屠宰后對(duì)尾脂重和胴體重進(jìn)行稱量，計(jì)算相對(duì)尾脂重及屠宰率。幼齡小尾寒羊尾部脂肪含量較少，不做記錄。屠宰程序和飼養(yǎng)管理完全按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078-2001和GB/ T 17237-1998）和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY 5148-2002-NY 5151-2002）進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì) 采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。根據(jù)NCBIGenBank中綿羊13號(hào)染色體Lpin3基因序列（登錄號(hào)：NC_019470.1；位置：69446668～69463656），采用Primer3在線軟件（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)5'非編碼區(qū)部分序列的引物。引物序列如下：Forward: 5'-GCGGCAGTCAGAAGGGTAT-3'，Reverse: 5'-CAGCTGCCCCATGTAGTTC-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 212 bp。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司合成。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR總體系為15 μL：1 μL gDNA，1.2 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），1.5 μL 10×Taq Buffer，上、下游引物均為0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.15 μL，最后用滅菌ddH2O補(bǔ)至15 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3 min；35個(gè)循環(huán)，包括94℃變性 20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s；終72℃延伸5 min，最后4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定為特異擴(kuò)增后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化，送蘇州金唯智生物科技有限公司北京分公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用ApE軟件對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，篩查SNPs位點(diǎn)。使用POPGENE軟件計(jì)算SNPs等位基因頻率和基因型頻率。采用卡方檢驗(yàn)比較兩品種間等位基因頻率的差異顯著性。使用Haploview軟件計(jì)算SNPs的期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho），并對(duì)每個(gè)SNP在品種內(nèi)和品種間進(jìn)行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）檢驗(yàn)，對(duì)SNPs構(gòu)建單倍型。使用SPSS17.0軟件中的一般線性模型（GLM）對(duì)基因型（或單倍型）與性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。模型中考慮的非遺傳因素有品種、性別、月齡，遺傳因素為各SNP的基因型或單倍型。GLM如下：

式中，Yijklm：性狀表型值，μ：總體均值，Bi：第i個(gè)品種效應(yīng)（i=1, 2），Sj：第j個(gè)性別效應(yīng)（j=1, 2），Mk：第k個(gè)月齡效應(yīng)（k=2, 4, …, 12），Gl：第l個(gè)基因型或單倍型效應(yīng)，eijklm：殘差效應(yīng)。計(jì)算結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)綿羊基因組DNA的條帶整齊、清晰，DNA完整性好（圖1）。核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA樣品濃度均大于600 ng/μL，OD260/280在1.8～2.0， DNA樣品濃度和純度均較高。檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性條帶，產(chǎn)物長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度相符（圖2）。

圖1 綿羊基因組DNA

圖2 綿羊Lpin3基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 SNP位點(diǎn)檢測(cè) 應(yīng)用ApE軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，檢測(cè)到Lpin3基因5' 非編碼區(qū)13個(gè)SNPs位點(diǎn)，以起始密碼子ATG中堿基A為+1，則上游序列的SNPs位點(diǎn)為SNP1（-815 T＞G）、SNP2（-788 C＞G）、SNP3（-753 G＞A）、SNP4（-725 C＞T）、SNP5（-699 T＞G）、SNP6（-613 A＞G）、SNP7（-604 A＞G）、SNP8（-443 T＞C）、SNP9（-334～ -332 ins TAA）、SNP10（-189 C＞T）、SNP11（-136 G＞A）、SNP12（-95 A＞G）、SNP13（-88 G＞A）。其中，SNP3、SNP4、SNP6、SNP7、SNP8、SNP10～13為轉(zhuǎn)換突變；SNP1、SNP2、SNP5為顛換突變；SNP9為插入突變，部分突變位點(diǎn)如圖3。

圖3 綿羊Lpin3基因部分突變位點(diǎn)圖

2.3 5'非編碼區(qū)品種間的遺傳差異 如表1所示，SNP8在廣靈大尾羊和小尾寒羊中均形成TT和CC 2種基因型，T和C等位基因頻率在兩品種間差異極顯著（P＜0.01）。SNP9插入TAA突變頻率小

尾寒羊顯著高于廣靈大尾羊（P＜0.05）。SNP10、SNP11、SNP13均形成3種基因型，等位基因頻率品種間差異極顯著（P＜0.01）。

表1 綿羊Lpin3基因SNPs的基因型頻率、等位基因頻率、HWE檢驗(yàn)和MAF

遺傳平衡檢驗(yàn)顯示，SNP8在兩品種綿羊中的Ho均為0，而在廣靈大尾羊中He為0.263，小尾寒羊中He為0.439，兩品種綿羊在該突變位點(diǎn)均極顯著偏離遺傳平衡狀態(tài)（P＜0.001）。SNP11和SNP13在廣靈大尾羊中的Ho均為0.267，He均為0.411，廣靈大尾羊在這2個(gè)位點(diǎn)顯著偏離了遺傳平衡狀態(tài)（P＜0.05），小尾寒羊在這2個(gè)位點(diǎn)處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05）。兩品種綿羊在SNP1～7、SNP10、SNP12均處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05）。SNP1～8、SNP10～13最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency, MAF）均大于0.1。

2.4 連鎖不平衡檢驗(yàn) 由于部分SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率在品種間差異顯著，為此分品種對(duì)各SNPs構(gòu)建單倍型。結(jié)果表明，SNP1～7在兩品種綿羊中均構(gòu)成單倍型塊（圖4、5），在廣靈大尾羊中形成9個(gè)理論單倍型，在小尾寒羊中形成7個(gè)理論單倍型，其中GGGCTAA（GLT0.533，STH0.523）與TCATGGG（GLT0.311，STH0.349）為兩品種羊的主要單倍型。SNP10～13只在廣靈大尾羊中形成單倍型塊（圖4），形成6個(gè)理論單倍型，3個(gè)主要單倍型為CGGG（0.378）、CGAG（0.322）和TAGA（0.267）。

圖4 廣靈大尾羊Lpin3基因SNPs連鎖不平衡檢驗(yàn)

圖5 小尾寒羊Lpin3基因SNPs連鎖不平衡檢驗(yàn)

廣靈大尾羊各SNPs構(gòu)成的單倍型塊中（圖4），單倍型塊1中的單倍型GGGCTAA與單倍型塊2中的單倍型CGGG和TAGA發(fā)生重組的可能性較大，單倍型塊1中的單倍型TCATGGG與單倍型塊2中的單倍型CGAG發(fā)生重組的可能性較大。

2.5 SNPs與尾型和屠宰性狀的關(guān)聯(lián) 表2為基于兩品種合并群體SNPs與各性狀的關(guān)聯(lián)分析?？梢奡NP8位點(diǎn)TT和CC間的尾型和屠宰性狀間無顯著差異（P＞0.05），但T突變?yōu)镃提高了宰前體重、胴體重和屠宰率。SNP9插入突變個(gè)體的尾寬（13.93±0.65）顯著低于野生型個(gè)體（15.48±0.32）（P＜0.05），盡管不顯著，該突變也降低了尾長(zhǎng)與絕對(duì)尾脂重，提高了宰前體重和胴體重。由表3可知，SNP8對(duì)兩品種綿羊的尾型和屠宰性狀均無顯著影響（P＞0.05），但該位點(diǎn)降低了小尾寒羊的尾長(zhǎng)和尾寬，卻提高了小尾寒羊的宰前體重與胴體重。SNP9降低了小尾寒羊的尾寬（P＜0.05）以及尾長(zhǎng)（P＞0.05），卻提高了該品種的宰前體重與胴體重（P＞0.05）。SNP10～13對(duì)小尾寒羊尾型和屠宰性狀均無顯著影響（P＞0.05）。

SNP1～7等位基因頻率在兩品種間無顯著差異，單倍型與性狀的關(guān)聯(lián)基于合并群體進(jìn)行分析。由圖4、5可知，兩品種綿羊有4種共有單倍型，即GGGCTAA、TCATGGG、GCGCTAA和TCATT GG。研究表明，常見單倍型一般為頻率大于5%的單倍型[9]。廣靈大尾羊中低頻率單倍型TCATTGG（0.011）不做分析，而小尾寒羊中單倍型GGATTGG（0.047）形成的雙倍型只有1個(gè)個(gè)體。結(jié)合已有研究和樣品數(shù)，兩品種共有的3種單倍型GGGCTAA（H1）、TCATGGG（H2）和GCGC TAA（H3）形成4種雙倍型（H1H1、H1H2、H2H2和H2H3），分析發(fā)現(xiàn)4種雙倍型間的尾型及屠宰性狀無顯著差異（P＞0.05）。SNP10～13在廣靈大尾羊中構(gòu)成單倍型塊，由頻率大于5%的3個(gè)單倍型CGGG（H1）、CGAG（H2）和TAGA（H3）形成6種雙倍型（H1H1、H1H2、H1H3、H2H2、H2H3和H3H3），分析發(fā)現(xiàn)6種雙倍型間的尾型和屠宰性狀也無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

Lpin3基因5'非編碼區(qū)遺傳變異在廣靈大尾羊和小尾寒羊品種間存在顯著差異，SNP8突變位點(diǎn)T和C等位基因頻率在兩品種間差異顯著。SNP9插入TAA突變頻率小尾寒羊顯著高于廣靈大尾羊。SNP10～13只在廣靈大尾羊中形成單倍型塊。基因非編碼區(qū)多態(tài)性反映品種間的差異已有報(bào)道，Lpin1基因-2 484 G＞A等位基因頻率在廣靈大尾羊和小尾寒羊兩品種間存在顯著差異[10]。ANGPTL4基因-577

T＞G在廣靈大尾羊中形成TG和TT 2種基因型，而在小尾寒羊中只形成TT一種基因型，-1 691 C＞G等位基因頻率在廣靈大尾羊和小尾寒羊中差異顯著[11]。豬與牛中發(fā)現(xiàn)位于3' UTR的遺傳變異在品種間存在差異[12-13]。認(rèn)為非編碼區(qū)的遺傳變異可反映品種間的遺傳差異。

表2 綿羊Lpin3基因SNPs對(duì)尾型和屠宰性狀的影響

表3 綿羊Lpin3基因SNP8～13對(duì)尾型和屠宰性狀的影響

目前，關(guān)于Lpin3基因多態(tài)性研究較少。人類全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）發(fā)現(xiàn)Lpin3基因附近的一個(gè)變異位點(diǎn)與健康人群空腹血糖水平有關(guān)[6]。豬Lpin3基因G224A與第6～7肋骨間的背膘厚和眼肌面積顯著關(guān)聯(lián)[7]，本研究中Lpin3基因SNP9（-334～-332 ins TAA）顯著降低小尾寒羊的尾寬，認(rèn)為L(zhǎng)pin3基因與動(dòng)物肉質(zhì)性狀相關(guān)。SNP9影響綿羊尾寬可能與其位于5'非編碼區(qū)，影響Lpin3基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而影響其在脂質(zhì)代謝中PAP酶活性或轉(zhuǎn)錄共激活活性有關(guān)。盡管不顯著，Lpin3基因SNP8與SNP9對(duì)尾型和屠宰性狀表現(xiàn)出不同甚至相反的遺傳效應(yīng)，即降低了尾型，提高了屠宰性狀。研究發(fā)現(xiàn)，Lpin1與Lpin2的基因多態(tài)性與動(dòng)物肌纖維、眼肌面積等肌肉生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)[7,14-15]。Lipin1缺失的脂肪肝營(yíng)養(yǎng)不良（Fatty Liver Dystrophy, FLD）受傷小鼠比野生型受傷小鼠有更小的再生肌纖維橫截面積，Lipin1表達(dá)降低抑制成肌細(xì)胞的分化[16]，表明Lipin1除調(diào)控脂質(zhì)代謝外，還參與調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)。脂肪組織中，Lipin3與Lipin1，而非與Lipin2，協(xié)同互作共同決定最佳的PAP酶活性與甘油三酯沉積[4]，此外Lipins成員間可形成同質(zhì)或異質(zhì)寡聚體[5]。本研究中Lpin3基因變異對(duì)綿羊尾型和屠宰性狀影響不一致甚至相反，推測(cè)是否Lipin3如同Lipin1，除具有Lipins脂質(zhì)代謝已知的功能外，還可調(diào)控肌肉生長(zhǎng)，或與lipin1互作共同調(diào)控肌肉生長(zhǎng)。由于Lipin3功能機(jī)制的研究較少，確切的機(jī)制尚需深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)Lpin2基因遺傳變異效應(yīng)因脂肪沉積、性別差異而異[17-18]。本研究Lpin3基因SNP9（-334～-332 ins TAA）插入TAA突變只顯著影響小尾寒羊的尾寬，而對(duì)廣靈大尾羊脂尾性狀無顯著影響，考慮到兩品種綿羊在脂尾表型上的差異，推測(cè)Lpin3基因遺傳變異效應(yīng)因脂肪表型而異，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

檢測(cè)到綿羊Lpin3基因5'非編碼區(qū)-334～ -332 ins TAA插入突變顯著降低小尾寒羊的尾寬，提高該品種綿羊的屠宰性狀，對(duì)廣靈大尾羊尾型和屠宰性狀無顯著影響。認(rèn)為L(zhǎng)pin3基因與綿羊脂質(zhì)代謝和肉質(zhì)性狀有關(guān)。

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Polymorphisms of Lpin3 Gene and the Associations with Tail Type and Slaughter Traits of Sheep

JIAO Xiao-li1,2, JING Jiong-jie1, QIAO Li-ying1, LI Liu-an2, CHEN Ming-ming2, TIAN Chuan-yao2, KANG Cui-cui2, LIU Wen-zhong1*

The purpose othis study was to evaluate the eects ogenetic variations oLpin3 gene on the meat quality traits osheep. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) oLpin3 gene partial 5' non-coding region in two breeds oat-tailed sheep such as Guangling Large Tailed and Small Tailed Han were detected using direct DNA sequencing, and the associations between SNPs and tail type and slaughter traits were analyzed. The results showed that 13 novel SNPs were discovered in 5' non-coding region about 1 200 bp upstream sequencerom start codon ATG oLpin3 gene, among the insertion mutation o-334～-332 ins TAA signicantly decreased the tail width (P＜0.05), while increased the slaughter traits (P＞0.05) in Small Tailed Han sheep. Meanwhile, mutationrequency o-334～-332 ins TAA in Small Tailed Han sheep was signicantly higher than that in Guangling Large Tailed sheep (P＜0.05). The insertion mutation didn’t signicantly aect the examined traits in Guangling Large Tailed sheep (P＞0.05). In spite othe non-signicant dierence, -443 T＞C had the similar genetic eects as those o-334～-332 ins TAA in Small Tailed Han sheep. This study would provide the theoretical basisor the geneunction oLpin3 as well as the marker-assisted selection (MAS) othe meat quality traits in sheep.

Sheep; Lpin3 gene; Single nucleotide polymorphisms; Association study

S826.2

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-07-018

2016-12-12；

2017-01-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372292）；天津農(nóng)學(xué)院科技發(fā)展基金（2013N01）；天津市高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(TD12-5019)

焦小麗（1974-），女，山西壺關(guān)人，講師，博士，主要從事動(dòng)物分子遺傳育種的研究，E-mail: jxlwjh@126.com

*通訊作者：劉文忠，男，教授，E-mail: tglwzyc@163.com