去卵巢對骨質(zhì)疏松大鼠皮膚衰老的影響

祁珊珊

(陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西 漢中 723000)

研究報告

去卵巢對骨質(zhì)疏松大鼠皮膚衰老的影響

祁珊珊

(陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西 漢中 723000)

目的 用去卵巢大鼠構(gòu)建的骨質(zhì)疏松癥模型是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病的最適模型，然而大鼠卵巢去除后對皮膚的影響如何，這方面的研究甚少。本研究旨在觀察去卵巢對大鼠皮膚衰老指標(biāo)的影響。方法 3月齡健康SD雌性大鼠20只，隨機分為假手術(shù)組(Sham組)和去卵巢組(OVX組)，卵巢去除后3個月，測定血清雌二醇，以及皮膚組織中與衰老相關(guān)的生化指標(biāo)如過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、脂褐質(zhì)(LF)含量，并觀察皮膚組織病理學(xué)變化, 用計算機圖像分析系統(tǒng)定量分析。結(jié)果 OVX組大鼠血清雌二醇水平顯著降低；組織病理學(xué)觀察顯示OVX組表皮、真皮厚度較Sham組顯著變薄(P<0.01)，皮膚膠原纖維減少，排列疏松；與Sham組相比，OVX組大鼠皮膚CAT、GSH-Px和SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量較Sham組明顯增加(P<0.01)，皮膚組織中HYP含量明顯減少，LF含量顯著增多(P<0.01)。結(jié)論 3月齡大鼠卵巢去除后3個月可導(dǎo)致皮膚衰老，可能是研究絕經(jīng)后皮膚衰老的適宜模型。

大鼠；去卵巢；骨質(zhì)疏松；皮膚；衰老

用去卵巢大鼠構(gòu)建的骨質(zhì)疏松癥模型是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病的最適模型[1]，我們先前的研究表明，3月齡SD大鼠卵巢去除后3個月不僅呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，而且還伴有生殖系統(tǒng)(子宮、陰道)結(jié)構(gòu)和功能的損傷[2，3]，然而大鼠卵巢去除后對皮膚的影響如何，這方面的研究甚少。大鼠卵巢去除后會導(dǎo)致體內(nèi)雌激素的驟降，很多研究表明，雌激素參與了許多生理和病理過程(如骨的生成以及其他內(nèi)分泌疾病)[4]，人類皮膚老化與體內(nèi)性激素水平降低有關(guān)[5]。但是目前的研究均集中于D-半乳糖誘導(dǎo)的皮膚衰老模型，該模型對于研究更年期和絕經(jīng)后人群的皮膚衰老并不適合[6]，因此，本實驗在前期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型的基礎(chǔ)上，研究了大鼠卵巢切除對皮膚形態(tài)和功能的影響，旨在為抗絕經(jīng)后皮膚衰老藥物的開發(fā)提供可靠的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性12周齡未孕SD大鼠20只，體重(245± 33)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK(軍)2012-0007】。實驗操作在陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所動物房進行【SYXK(陜)2015-006】，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，動物房溫度 22～26℃，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進行試驗。實驗過程中所有的操作均符合動物福利的要求。

1.2 試劑與儀器

大鼠雌二醇(E2)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、脂褐質(zhì)(LF)測定試劑盒均購自南京建成生物工程公司。儀器主要有酶標(biāo)儀(Biotek)，石蠟組織切片機(Leica RM2235)，計算機圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)。

1.3 卵巢去除手術(shù)

將20只SD大鼠分為假手術(shù)組(sham組)和去卵巢組(OVX組)，其中sham組10只，OVX組10只。OVX組大鼠參考我們先前報道的方法實施卵巢去除手術(shù)[7]。Sham組大鼠實施假手術(shù)，術(shù)后一周對OVX組大鼠進行陰道涂片，連續(xù)5 d，去卵巢組不出現(xiàn)動情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 血液和皮膚組織樣本采集

去除卵巢后3個月，所有大鼠CO2麻醉后眼眶靜脈采血，離心收集血清檢測血清雌二醇(E2)含量。取背部正中皮膚約1.0 cm ×1.0 cm大小，放入3.7%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，進行皮膚組織切片，H&E染色和組織形態(tài)計量學(xué)觀察及定量分析(應(yīng)用Image-Pro Plus顯微測量系統(tǒng)，進行皮膚組織形態(tài)計量學(xué)相關(guān)靜態(tài)參數(shù)的測定，共測量3個參數(shù)，即表皮、真皮厚度和膠原纖維面積/μm2)。另取背部皮膚1.5 cm ×1.5 cm大小皮膚組織用于生化指標(biāo)測定。

1.5 血清E2檢測

按照大鼠血清雌二醇(E2)ELISA檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.6 皮膚生化指標(biāo)的測定

采血結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，取1.5 cm × 1.5 cm背部脫毛皮膚，PBS中漂洗，濾紙拭干，剪碎，加入冷的生理鹽水和少量蛋白裂解液，用組織勻漿機進行勻漿，將制備好的 10% 勻漿置于冷凍離心機3000 r/min 離心15 min，取適量離心好的勻漿上清夜，按試劑盒說明測定并計算皮膚組織中過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(HYP)、脂褐質(zhì)(LF)含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素組間方差分析和比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清 E2檢測結(jié)果

大鼠血清 E2檢測結(jié)表明，大鼠卵巢去除前兩組大鼠血清E2差異無顯著性(P>0.05)，分別是(21.53±3.12)ng/L和(20.46±2.98)ng/L；卵巢去除后3個月，OVX組大鼠血清E2較Sham組顯著降低(P<0.01)，Sham組和OVX組血清E2分別是(20.68±3.48)ng/L和(5.73±0.54)ng/L。

2.2 皮膚組織病理學(xué)形態(tài)觀察及定量分析

組織學(xué)觀察顯示，Sham組大鼠背部皮膚表皮層次清晰，結(jié)構(gòu)完整，表皮突可見，膠原纖維排列緊密；OVX組表皮及真皮萎縮，表皮突消失，細(xì)胞層數(shù)減少，真皮變薄，膠原纖維斷裂，分布不均勻，局部區(qū)域膠原纖維缺失，基底膜分界不清，皮下結(jié)構(gòu)疏松(如圖1所示)。顯微形態(tài)計量學(xué)分析結(jié)果顯示，兩組大鼠皮膚表皮厚度、真皮厚度及膠原纖維面積均差異顯著(如表1所示)。

注：A.Sham組背部皮膚(HE ×40)； B. OVX組背部皮膚(HE ×40)； C. Sham組背部皮膚(HE ×200)； B. OVX組背部皮膚(HE ×200)。圖1 各實驗組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)Note. A. Back skin in the sham group,HE staining, ×40; B.Back skin in the OVX group,HE staining, ×40; C.Back skin in the sham group,HE staining, ×200; D.Back skin in the OVX group, HE stanng, ×200.Fig.1 Histological structure of the rat skin in each group

組別Groups表皮厚度/μmEpidermisthickness真皮厚度/μmDermisthickness膠原纖維面積/μm2AreaofelasticfibersSham29.43±3.78**561.35±24.34**798.71±35.20**OVX21.51±2.39400.56±17.86563.42±29.14

注:與OVX組相比:*P<0.05，**P<0.01。

Note.*P<0.05,**P<0.01 vs.the OVX group.

2.3 皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA、HYP、LF含量

如表2所示，大鼠去除卵巢后3個月，與Sham組相比，OVX組大鼠皮膚組織過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著降低(P<0.01)；丙二醛(MDA)含量較Sham組明顯增加(P<0.01)；與Sham組比較，OVX大鼠皮膚組織中羥脯氨酸(HYP) 含量明顯減少(P<0.01)，脂褐質(zhì)(LF) 含量明顯增多(P<0.01)。

表2 皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA、HYP、LF含量(x± s，n=10)Tab.2 The activity of CAT, GSH-Px, SOD, and the content of MDA, HYP and LF in the rat skin

表2 皮膚組織CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA、HYP、LF含量(x± s，n=10)Tab.2 The activity of CAT, GSH-Px, SOD, and the content of MDA, HYP and LF in the rat skin

組別GroupsCATU/mLGSH-PxU/mLSODU/mLMDAnmol/mLHYPμg/mgLFμg/gSham50.01±5.2931.43±4.0889.85±7.908.12±1.1545.67±5.364.56±0.56OVX33.67±4.2123.33±2.7962.45±5.7815.78±2.1722.56±3.127.43±1.21

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少和骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，骨的脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。在骨質(zhì)疏松癥研究中，去卵巢大鼠是美國食品與藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的的研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的適合模型[1]。

我們先前的研究通過骨組織形態(tài)計量學(xué)、血鈣、血清ALP等證實3月齡大鼠去卵巢后3個月呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，且伴隨生殖系統(tǒng)(子宮、陰道)的萎縮[3]。表皮、真皮厚度以及膠原纖維的排列和數(shù)量均是皮膚衰老的形態(tài)學(xué)指癥[8，9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠隨著體內(nèi)雌激素水平的驟降，使其皮膚形態(tài)也發(fā)生明顯變化，卵巢去除后3個月大鼠真皮萎縮，表皮突消失，細(xì)胞層數(shù)減少，真皮變薄，膠原纖維斷裂，分布不均勻，局部區(qū)域膠原纖維缺失，基底膜分界不清，皮下結(jié)構(gòu)疏松，形態(tài)計量數(shù)據(jù)顯示與Sham組相比，OVX組大鼠皮膚表皮、真皮厚度減小，且膠原纖維的面積也顯著減少(P<0.05)。這些皮膚的組織形態(tài)學(xué)變化表明，大鼠卵巢去除后3個月皮膚發(fā)生衰老病變。

羥脯氨酸(HYP)是皮膚膠原蛋白和彈性蛋白中的一種主要且相對恒定的氨基酸，可穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，增加纖維韌性，使皮膚光滑、有彈性，利用HYP在膠原蛋白中含量最高這一特點，通過測定皮膚HYP的含量，可了解皮膚膠原蛋白分解代謝情況，研究表明皮膚組織中HYP含量會隨著皮膚的衰老而降低[10，11]。此外，研究證實脂褐質(zhì)(LF)在皮膚成纖維細(xì)胞沉積會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，脂褐質(zhì)的含量與皮膚衰老和老化程度呈顯著正相關(guān)，因此，皮膚組織中HYP和LF 的含量是評價皮膚衰老的可靠指標(biāo)[12，13]。同時，生物體內(nèi)抗氧化酶 (CAT、GSH-Px、SOD等) 活性降低會造成自由基堆積，過多的自由基會使成纖維細(xì)胞羥化酶損傷并出現(xiàn)羥化功能障礙，導(dǎo)致羥脯氨酸生成減少，從而破壞膠原蛋白和彈性蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，使皮膚的柔韌性和彈性下降而出現(xiàn)衰老[14]。脂質(zhì)過氧化損傷的產(chǎn)物丙二醛(MDA)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，形成脂褐質(zhì)(LF)[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去除卵巢后3個月，皮膚組織CAT、GSH-Px和SOD活性顯著降低，MDA含量較Sham組明顯增加。羥脯氨酸(HYP) 含量明顯減少，脂褐質(zhì)(LF) 含量明顯增多。上述指癥均表明卵巢去除3個月后大鼠皮膚發(fā)生了明顯衰老。

去卵巢大鼠構(gòu)建的骨質(zhì)疏松模型是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的最適模型，絕經(jīng)后由于卵巢雌激素的缺失，使得骨密度、骨結(jié)構(gòu)和骨生化指標(biāo)發(fā)生明顯變化，本實驗研究發(fā)現(xiàn)雌激素不僅調(diào)控骨生成，而且是導(dǎo)致皮膚衰老的關(guān)鍵因素。正常皮膚成纖維細(xì)胞表達ER，研究發(fā)現(xiàn)雌激素可直接調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖，提高其活性，增加膠原含量[16]。Brincat等[17，18]的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素會對更年期以及絕經(jīng)后婦女皮膚厚度產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，可能的機制是雌激素可促進成纖維細(xì)胞的膠原合成，促進TGF-β1、VEGE和EGF等細(xì)胞因子分泌，對成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成起促進作用。目前，有關(guān)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的研究很多，但是對其皮膚衰老的實驗研究甚少，本文將為絕經(jīng)后皮膚衰老相關(guān)研究提供可靠的實驗?zāi)Ｐ?，因此，去卵巢大鼠不僅是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的最適模型，也是研究和開發(fā)抗絕經(jīng)后皮膚衰老藥物以及相關(guān)研究的良好模型。

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Effect of ovariectomy on the skin aging in rats with osteoporosis

QI Shan-shan

(Vitamin D Research Institute, Shaanxi Sci-tech University, Hanzhong Shaanxi 723000,China)

Objective Ovariectomized rats are the most suitable model for the study of postmenopausal osteoporosis. However, the effect of ovariectomy on rat skin is little studied. The aim of this study was to observe the effect of ovariectomy on the skin aging indexes in rats. Methods 20 healthy 3-month-old female SD rats were randomly divided into sham group and ovariectomized (OVX) group. Serum estradiol was detected at 3 months after ovariectomy, the skin aging-related biochemical indexes such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) activity and the content of malondialdehyde (MDA), hydroxyproline (HYP) and lipofuscin (LF) were also detected. The structure of skin tissue was observed and detected using a pathological image analysis system. Results The serum E2of OVX rats was significantly lower than that in the sham group, the thickness of epidermis and dermis of OVX group was significantly thinner than that of the sham group (P<0.01), the amount of collagen fibers was decreased and their arrangement was very loose. Compared with the sham group, the activity of CAT, GSH-Px and SOD in the OVX group was significantly decreased (P<0.01), and the content of MDA was significantly increased (P<0.01). The content of HYP in skin tissue was significantly decreased, and LF content was significantly increased (P< 0.01) in the OVX group. Conclusions Skin aging can be induced at 3 months after ovariectomy in 3-month old rats, which may be a good model for the study of skin aging in postmenopausal women.

Rats; Ovariectomy; Osteoporosis; Skin; Aging

QI Shan-shan. E-mail:qishanshan101@126.com

陜西省科技創(chuàng)新團隊項目(2012KCT-29)；陜西省科協(xié)青年人才托舉項目(20160128)；秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心培育項目(QBXT-Z(P)-15-18)；陜西理工大學(xué)博士后項目(SLGBH16-03)。

祁珊珊(1984-)，女，講師，博士，主要從事維生素D生理與應(yīng)用研究。E-mail: qishanshan101@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0325-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.017

2016-11-23