維生素D受體在C57BL/6小鼠十二指腸中的定位表達分析

程佳，劉少偉，曹婉瑩，楊祎琦，姚望

(陜西理工大學(xué) 維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000)

研究報告

維生素D受體在C57BL/6小鼠十二指腸中的定位表達分析

程佳，劉少偉，曹婉瑩，楊祎琦，姚望

(陜西理工大學(xué) 維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000)

目的 為探討維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)在C57BL/6小鼠十二指腸中的定位與表達，研究維生素D系統(tǒng)與腸道發(fā)育過程的相關(guān)性。方法 利用實時定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、蘇木精伊紅染色、免疫熒光染色、免疫印跡 (Western blotting, WB) 的檢測技術(shù)，對C57BL/6小鼠十二指腸中VDR定位表達做定性與定量的分析。結(jié)果 VDR的mRNA在C57BL/6小鼠十二指腸組織中的表達在其出生的第21 天達到峰值。此外，VDR主要分布在C57BL/6小鼠十二指腸上皮細胞和平滑肌細胞的胞質(zhì)中。對組織樣品的WB檢測顯示，C57BL/6小鼠十二指腸發(fā)育過程中，VDR沒有發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位。結(jié)論 從分子生物學(xué)角度分析了VDR在C57BL/6小鼠十二指腸不同生長發(fā)育階段的表達規(guī)律，為了解和完善VDR在腸道中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

維生素D受體；十二指腸；表達;小鼠

自1928年發(fā)現(xiàn)維生素D以來，生物醫(yī)學(xué)界對維生素D的研究越來越深入，主要是由于它與機體的健康密切相關(guān)[1]。維生素D是所有生物活性物質(zhì)中非常獨特的成員，除可以調(diào)節(jié)機體的鈣、磷代謝外，還具有調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡過程，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種內(nèi)分泌激素的分泌等作用[2]。然而，維生素 D 本身并沒有生理活性，只是活性維生素 D 的前體(prohormone)[3]。機體內(nèi)的維生素D需要經(jīng)過2次羥化作用才能轉(zhuǎn)變?yōu)?,25(OH)2D3。而活性1,25(OH)2D3的功能主要是通過維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)實現(xiàn)的，因此對VDR的研究也已成為近年來研究的熱點[4]。研究已證實 VDR與糖尿病、高血壓、肥胖癥、甲狀旁腺功能亢進、骨質(zhì)疏松癥以及乳腺癌、肺癌等多種癌癥之間的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-9]。

一般情況下，VDR存在的細胞或組織是活性1,25(OH)2D3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要靶標(biāo)。研究顯示，VDR 在肺癌、乳腺癌、肝癌及前列腺癌等癌細胞中有不同程度的表達[10-12]。同時，VDR也高表達于小腸、腎、骨和甲狀旁腺等正常的組織[13,14]。值得注意的是，小鼠從出生到性成熟的發(fā)育過程中，要經(jīng)歷空白期、母乳期和飼喂期3個階段性的飲食變化。而十二指腸作為重要的消化場所，其腸道菌群的組成、蛋白因子的分泌和基因的表達等都會對機體飲食的改變而發(fā)生適應(yīng)性調(diào)整，故推測VDR在小鼠十二指腸中的表達與分布會隨機體的發(fā)育和飲食的改變出現(xiàn)差異。因此，本研究旨在以C57BL/6小鼠十二指腸中VDR表達為研究目標(biāo)，期望從分子生物學(xué)角度闡明VDR在C57BL/6小鼠十二指腸不同發(fā)育階段的表達規(guī)律，明確飲食改變與VDR表達之間的相關(guān)性，完善對VDR的認識，為維生素D藥物的研發(fā)和動物模型給藥階段的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級C57BL/6小鼠，1.5月齡，雌雄各3只，均購于西安交通大學(xué)實驗動物中心【SCXK(陜)2011-008】。TRI Reagent、多聚甲醛、1% Triton X-100、牛血清蛋白 (BSA)、DAPI均購于Sigma公司，VDR抗體、購于Santa Cruz，其他試劑如梯度乙醇、二甲苯、Tween-20、蘇木精染液、1%鹽酸乙醇、伊紅染液、雙氧水、0.01 mol/L檸檬酸緩沖液、甘油、氯仿、異丙醇、定影液、顯影液等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 收集C57BL/6小鼠十二指腸組織樣品

收集清潔級C57BL/6小鼠從出生(0 d)到性成熟(35 d)的十二指腸樣品，每7 d采集一次，每次3個重復(fù)，實驗于西安交通大學(xué)實驗動物中心【SYXK(陜)2012-005】 進行。將實驗材料一部分固定于4%的多聚甲醛溶液中，以備制作組織切片；另一部分經(jīng)液氮迅速脫水后，存放于 -80℃，以用于提取總RNA和總蛋白。

1.2.2 組織包埋和切片

組織經(jīng)4%的多聚甲醛溶液固定，先經(jīng)梯度乙醇逐級脫水，再分別用 100%乙醇/二甲苯(1∶1)和二甲苯處理30 min，二甲苯處理 20 min，二甲苯處理 10 min后，分別用蠟Ⅰ、蠟Ⅱ、蠟Ⅲ浸埋40 min。將包埋好的蠟塊修整后切片，存放備用。

1.2.3 石蠟切片的染色

H&E染色的石蠟切片用二甲苯脫蠟2 次，各 10 min，乙醇溶液浸泡復(fù)水，蘇木精染色 30 min，洗去蘇木精(流水 1 min，1% 鹽酸乙醇 5 s，再水洗 10 s)，進行胞質(zhì)脫色(70% 乙醇，2 min; 80% 乙醇，2 min; 90% 乙醇，2 min)，隨后進行伊紅染色(6 min)，染色后脫水(95%乙醇、100%乙醇、二甲苯，每個溶液浸泡 2 次，每次 5 min)，脫水后蓋上蓋玻片，用中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

免疫熒光染色的石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，分別用3% 雙氧水和1% Triton X-100 浸泡數(shù)分鐘。隨后，用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液加熱進行抗原修復(fù)。自然冷卻后用3% BSA室溫封閉30 min，進行一抗孵育，室溫2 h；二抗孵育，室溫2 h或4℃過夜。最后，用0.1%的DAPI染核，室溫避光30 min，清洗后以50%甘油封片，晾干，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。1.2.4 quantitative PCR (qPCR)

將組織在液氮中速凍后研磨，Trizol法提取各樣本總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qPCR分析。各基因引物序列如表1所示。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：Master mix 10 μL(ABI)，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，滅菌ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序為：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共40個循環(huán)。各基因均以相同的條件進行qPCR，重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)各樣品的CT值計算基因表達量并分析結(jié)果。

表1 各基因qPCR引物信息Tab.1 Primer sequences and parameters of the genes for qPCR

1.2.5 Western blotting (WB)

分離提取各樣品內(nèi)的核質(zhì)蛋白和胞質(zhì)蛋白：將速凍的組織研磨后，放入離心管，加PBS清洗，于4℃，500 r/min，離心5 min；棄去上清液，控干沉淀水分。按比例加入CERI，渦旋混勻，冰內(nèi)靜置10 min。加入預(yù)冷的CERII，渦旋5 s，冰內(nèi)靜置1 min，于4℃，16 000 r/min，離心5 min。分離上清液(胞質(zhì)蛋白)至干凈預(yù)冷的離心管中，編號使用。在沉淀中加入NER，每次渦旋15 s后冰內(nèi)靜置10 min，重復(fù)4次，于4℃，16 000 r/min，離心10 min。分離上清液(核質(zhì)蛋白)至干凈預(yù)冷的離心管中，編號使用。進行WB檢測：SDS-PAGE凝膠電泳用12%分離膠和6%濃縮膠，每孔點樣30 μL，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為120 V。轉(zhuǎn)PVDF膜，電流200 mA，冰浴2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST清洗。一抗1∶500稀釋，室溫孵育2 h，TBST清洗，二抗1∶2000稀釋，室溫孵育2 h，TBST清洗。壓片曝光并進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠十二指腸VDR的qPCR分析

VDR在十二指腸組織中的定量分析結(jié)果如圖1所示。隨著C57BL/6小鼠十二指腸的生長發(fā)育，VDR相對量表達也逐漸發(fā)生變化。0～7 d，C57BL/6小鼠剛出生，VDR相對表達量較少，14 d VDR相對表達量有所增加，到21 d達到最大，說明此時VDR在組織細胞中的表達最多；21 d之后VDR相對表達量又呈現(xiàn)下降趨勢。

為了進一步研究VDR在C57BL/6小鼠十二指腸中的具體作用，后續(xù)實驗分別采用免疫熒光染色和免疫印跡的方法，從定性和定量兩方面明確C57BL/6小鼠十二指腸的發(fā)育與VDR表達之間的相關(guān)性。

注：與對照組相比*P<0.05；與對照組相比**P<0.01。圖1 VDR在C57BL/6小鼠十二指腸組織中的定量分析Note. compared with the control group, *P<0.05; compared with the control group, **P<0.01.Fig.1 Quantitative analysis of VDR in the mouse duodenum tissues

2.2 C57BL/6小鼠十二指腸的H&E 染色

由于細胞核為嗜堿性物質(zhì)，可被蘇木精染成藍色，胞質(zhì)主要為嗜酸性物質(zhì)，可被伊紅染成紅色，從而與細胞核區(qū)分開來；通過鏡檢，核質(zhì)分離明顯，說明同批次的石蠟切片可以用于后續(xù)免疫熒光檢測。

結(jié)果顯示，不同時期的十二指腸組織的細胞形態(tài)有明顯不同(圖2)。剛出生(0 d)C57BL/6小鼠的十二指腸較小，經(jīng)脫水處理后，組織變脆，制成的切片易產(chǎn)生脫片現(xiàn)象，視野下能觀察到的組織較少(圖2 A和B)；隨著C57BL/6小鼠的生長發(fā)育，視野下觀察到的組織密度逐漸增加(圖2 C和D)；待C57BL/6小鼠生長發(fā)育到一定時期，脫片現(xiàn)象逐漸減少，組織形態(tài)完整，視野下觀察到的組織較多(圖2 E和F)。

2.3 C57BL/6小鼠十二指腸VDR的免疫熒光染色

VDR作為抗原，可與特異性強、靈敏度高的一抗(D-6)結(jié)合；一抗與VDR形成復(fù)合物作為另一抗原，可特異地與帶有熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合。能更好地對目標(biāo)蛋白進行定位。同時，DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，與核染色質(zhì)結(jié)合。

C57BL/6小鼠十二指腸的免疫熒光染色如圖3所示。VDR和DAPI著色清晰；低倍鏡下，觀察到各個時期C57BL/6小鼠十二指腸組織完整形態(tài)；高倍鏡下，可確定VDR在C57BL/6小鼠十二指腸中具體定位。其中，發(fā)紅色熒光的是VDR蛋白，主要分布在C57BL/6小鼠十二指腸上皮細胞和平滑肌細胞的胞質(zhì)中。從組織著色的明暗程度分析，VDR在0～14 d的表達趨勢與qPCR一致，即隨著十二指腸的發(fā)育，VDR的表達逐漸增加。但VDR的表達在21 d略有降低，隨后維持在穩(wěn)定水平，這與qPCR的結(jié)果呈負相關(guān)，其原因很有可能是VDR蛋白的翻譯過程滯后于mRNA的產(chǎn)生造成的。

注：紅光：VDR；藍光：DAPI；疊加：Overlay。圖3 C57BL/6小鼠十二指腸的免疫熒光染色Note. Red: VDR. Blue: DAPI. Overlay.Fig.3 Immunofluorescence staining of the mouse duodenal tissues

2.4 C57BL/6小鼠十二指腸VDR蛋白的WB分析

免疫熒光染色的結(jié)果只能定性的反映VDR在C57BL/6小鼠十二指腸各階段的定位與表達，為了進一步明確在十二指腸發(fā)育過程中是否存在VDR的核轉(zhuǎn)位，對收集的各樣品進行了WB檢測，并分析了VDR蛋白在核質(zhì)與胞質(zhì)中的表達情況。結(jié)果顯示，VDR的表達量在C57BL/6小鼠十二指腸的各個發(fā)育階段沒有明顯差別，核質(zhì)中的VDR比胞質(zhì)中的VDR略多，但差異無顯著性(圖4A)。同時，VDR蛋白的總體含量在C57BL/6小鼠十二指腸的各個發(fā)育時期基本保持相同水平(圖4B)。

注：1～5分別代表C57BL/6小鼠十二指腸發(fā)育第7、14、21、28、35天的樣本；β-actin為內(nèi)參；A為WB檢測VDR表達；B為灰度分析。圖4 C57BL/6小鼠十二指腸各階段VDR蛋白的表達Note. 1-5: The samples of mice at 7, 14, 21,28, 35 postnatal days, respectively. β-actin is the control.A: VDR protein expression detected by WB. B: Gray density analysis.Fig.4 Expression of VDR protein in different developmental stages of the mouse duodenum

3 討論

活性維生素D在維持機體鈣磷代謝，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等方面起重要作用，但其許多生物學(xué)功能都是通過VDR介導(dǎo)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的[3]。一般情況下，1,25(OH)2D3信號分子會在靶組織與VDR結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物作用于靶基因的特定DNA序列上，對其下游功能基因的表達產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[2]。因此，VDR存在的細胞或組織是活性維生素D的主要靶標(biāo)。

研究證實，十二指腸是VDR表達的陽性組織，其對維生素D的代謝功能影響以及對小腸吸收鈣磷的平衡有關(guān)鍵作用[15,16]。在比較醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)，針對十二指腸的研究主要為各類動物模型在某些病理情況下，其十二指腸的消化功能、組織病理和關(guān)鍵基因的變化等相關(guān)方面[17,18]。但對于VDR在十二指腸發(fā)育過程中的基礎(chǔ)研究缺乏實驗數(shù)據(jù)。因此，該研究通過一系列分子生物學(xué)的檢測技術(shù)，對C57BL/6小鼠十二指腸VDR的表達進行了定性與定量的分析。qPCR的結(jié)果表明，在C57BL/6小鼠生長發(fā)育過程中，VDR在C57BL/6小鼠十二指腸中的表達呈正態(tài)分布的趨勢(VDR在C57BL/6小鼠出生的第21天達到峰值)。由于十二指腸的獨特生理位置，能同時混合胃液、胰液和膽汁，因此十二指腸的消化功能十分重要[19]。在采樣過程中，C57BL/6小鼠經(jīng)歷了從出生到斷奶以及性成熟的階段，因此推斷VDR的表達變化很可能與C57BL/6小鼠的腸道發(fā)育、飲食結(jié)構(gòu)改變和性激素的分泌有關(guān)。此外，C57BL/6小鼠是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究的常用品系，是廣泛用于模擬人類的某些代謝性或免疫性疾病的動物模型[20]。實驗動物類型的選擇也有可能會對研究結(jié)果造成一定程度的影響。

同時，免疫熒光染色的結(jié)果在一方面驗證了qPCR的結(jié)果，另一方面也證實VDR主要存在于C57BL/6小鼠十二指腸上皮細胞和平滑肌細胞的胞質(zhì)中。組織樣品的WB結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠十二指腸發(fā)育過程中，VDR在胞質(zhì)與核質(zhì)的定位沒有發(fā)生明顯變化，其總體水平在各個發(fā)育時期基本保持相同。但需要強調(diào)的是，出生0 d的C57BL/6小鼠十二指腸組織較小，采樣困難，經(jīng)組織研磨后的剩余量太少，因此WB檢測沒有該時期的條帶。

綜上所述，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)的VDR在C57BL/6小鼠十二指腸中的定位表達趨勢，有助于完善對VDR在小腸中的作用認識，同時為飲食改變與VDR表達之間的相關(guān)性提供理論依據(jù)，也為后期維生素D藥物的研發(fā)和動物模型給藥階段的相關(guān)研究提供參考。

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Location and expression of vitamin D receptor in the duodenum of C57BL/6 mice at different developmental stages

CHENG Jia, LIU Shao-wei, CAO Wan-ying, YANG Yi-qi, YAO Wang

(Vitamin D Research Institute, Shaanxi University of Techndogy,Hanzhong Shaanxi 723000,China)

Objective To investigate the relationship of vitamin D with the intestinal development and study the expression of vitamin D receptor (VDR) in the duodenum of C57BL/6 mice at different developmental stages. Methods Quantitative PCR (qPCR), histology using H&E staining and immunofluorescence staining, and Western blotting (WB) were performed to elucidate the expression of VDR in mice intestine at different growth and developmental stages. Results The peak of VDR mRNA expression reached on 21 d. The pathological result showed that VDR mainly distributed in the cytoplasm of epithelial cells and smooth muscle cells in the mouse duodenum. WB result indicated that there was no nuclear translocation of VDR protein in the mouse duodenum. Conclusions This study demonstrates the regularity of expression of VDR in the mouse duodenum during its development, and contributes to understanding the function of VDR in the intestines.

Vitamin D receptor; Duodenum; Expression; Mouse

CHENG Jia. E-mail: bobos410@126.com

陜西省教育廳項目 (No.14JK1159)；漢中市科技局項目(No.2014ZKC47-07);陜理工博士啟動項目(No.SLGQD13(2)-22)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目 (No.UIRP15068)。

程佳 (1983-)，女，講師，博士研究生，研究方向：維生素D受體的細胞生物學(xué)效應(yīng)。Email： bobos410@126.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0320-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.016

2016-09-13