不同配方飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型建立的影響

何曉東，鄶一賀，黎冰林，鄧慧君，李江超，喬梁，王麗京*

(1. 廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 51006； 2. 澳大利亞悉尼大學(xué)肝病研究中心)

研究報(bào)告

不同配方飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型建立的影響

何曉東1，鄶一賀1，黎冰林1，鄧慧君1，李江超1，喬梁2，王麗京1*

(1. 廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 51006； 2. 澳大利亞悉尼大學(xué)肝病研究中心)

目的 建立二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型并使用兩種不同配方飼料：SPF級小鼠大鼠全價(jià)配合飼料和AIN93-G配方合成飼料分別喂養(yǎng)，探討不同飼料喂養(yǎng)對構(gòu)建DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的影響。方法 14日齡雄性C57BL/6小鼠腹腔一次性注射DEN溶液，給藥量25 mg/kg體重，建立小鼠肝癌模型。小鼠離乳后分為兩組，一組以常規(guī)SPF級大小鼠全價(jià)配合飼料喂養(yǎng)，另一組以AIN-93G配方合成飼料喂養(yǎng)。模型小鼠生長至9月齡時(shí)處死，取肝臟組織稱重，觀察并記錄肝癌生長情況。結(jié)果 全價(jià)飼料組小鼠肝臟全部產(chǎn)生腫瘤，AIN-93G組小鼠體重和肝臟重量明顯低于全價(jià)飼料組小鼠，肝癌發(fā)生率、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量和大小也明顯低于全價(jià)飼料組小鼠。結(jié)論 全價(jià)飼料喂養(yǎng)的小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型造模成功，而AIN-93G飼料喂養(yǎng)的小鼠誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展受到抑制，同時(shí)小鼠體重明顯下降，提示了飲食因素在動(dòng)物疾病模型建立中起到的關(guān)鍵作用。

飼料；二乙基亞硝胺；肝癌；小鼠

在生命科學(xué)領(lǐng)域常常利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立研究模型，以模擬人類疾病發(fā)生發(fā)展的過程。各類疾病動(dòng)物模型被廣泛用來研究人類疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、藥物篩選以及治療評價(jià)等[1]。選用適合的造模方法和嚴(yán)格規(guī)范的操作是建立動(dòng)物疾病模型的關(guān)鍵。然而，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自身質(zhì)量是成功建立動(dòng)物疾病模型的先決條件。影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的因素是多方面的，如遺傳、環(huán)境、飲水、飼料等。其中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料質(zhì)量是與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量密切相關(guān)的重要條件，也是保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的基礎(chǔ)[2]。不同飼料對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長和繁殖性能、生化指標(biāo)均有不同程度的影響[3，4]，但飼料因素在腫瘤模型建立過程中的作用還未見報(bào)道。本研究在建立DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型過程中，使用了兩種不同配方飼料分別喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠：商品化的SPF級大小鼠全價(jià)配合維持飼料和AIN-93G配方合成飼料，探討使用不同配方飼料喂養(yǎng)對建立DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級C57BL/6小鼠雌雄各8只，6～8周齡，體重18～22 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2013-0002】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行【SYXK(粵)2012-0125】，并按照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 試劑

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN) 購自美國Sigma公司，產(chǎn)品編號：N0756，濃度為0.95 g/mL。AIN93-G配方合成飼料(AIN93-G飼料)原料及配比為：酪蛋白，200 g/kg；蔗糖100 g/kg；豆油，70 g/kg；纖維素，50 g/Kg；玉米淀粉，397.5 g/kg；麥芽糖糊精，132 g/kg；DL-蛋氨酸，3.0 g/Kg；混合礦物質(zhì)93-G，35 g/kg；混合維生素93-G，10 g/kg；氯化膽堿，2.5 g/kg。SPF級小鼠大鼠全價(jià)配合飼料(全價(jià)飼料)主要原料為：玉米、面粉、麩皮、秘魯魚粉、豆粕、磷酸氫鈣、石粉、植物油、鹽、賴氨酸、蛋氨酸、維生素和復(fù)合礦物質(zhì)等。全價(jià)飼料為商品化飼料，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，AIN93-G飼料委托廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心以SPF級飼料生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)繁育

將6～8周齡C57小鼠按雄性和雌性1∶1比例合籠配種，每天密切觀察配種小鼠狀態(tài)，準(zhǔn)確記錄子代小鼠出生日期。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，以全價(jià)飼料喂養(yǎng)；飲用水、墊料經(jīng)高溫高壓滅菌，每周更換一次墊料。

1.2.2 DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌

子代小鼠成長到14日齡時(shí)，從中選擇發(fā)育正常的雄性幼鼠，稱重；DEN原液以1∶600比例用無菌生理鹽水稀釋，每只雄性幼鼠用胰島素注射器通過腹腔一次性注射DEN溶液，給藥量為25 mg/kg體重，實(shí)際注射DEN劑量(1∶600)按以下公式計(jì)算：小鼠體重克數(shù) × 16=每只小鼠注射DEN(1∶600) 微升數(shù)(μL)。給藥后的小鼠放回原籠內(nèi)繼續(xù)接受哺乳至離乳。

1.2.3 分籠分組喂養(yǎng)

子代小鼠成長至21日齡后需離乳，雌雄幼鼠分籠，此時(shí)將相同年齡并接受過DEN注射的雄性幼鼠分為2組，每組8只，一組繼續(xù)以全價(jià)飼料喂養(yǎng)，另一組以AIN93-G飼料喂養(yǎng)，每周各添加兩次飼料，每次約100～150 g。其他飼養(yǎng)條件不變。

1.2.4 肝臟組織取材和HE染色

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)至9月齡，稱體重；脫臼法處死小鼠，剝離肝臟組織，稱重，觀察腫瘤生長狀況并拍照。將肝臟組織于4%多聚甲醛固定液中固定過夜，常規(guī)脫水及石蠟包埋。4 μm切片，蘇木素伊紅染色。于4倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism5進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AIN-93G飼料與全價(jià)飼料主要營養(yǎng)成分比較

通過對比，AIN93-G飼料實(shí)測各主要營養(yǎng)成分含量基本等于或接近配方理論含量；AIN93-G飼料的蛋白質(zhì)、賴氨酸含量(實(shí)測)與全價(jià)飼料相當(dāng)，脂肪含量(實(shí)測)略高于全價(jià)配合飼料；AIN93-G飼料鈣、磷、鈉、鐵、碘、錳等微量元素含量(實(shí)測)略低于全價(jià)飼料含量，鋅含量基本持平；維生素含量中，全價(jià)飼料中維生素A(實(shí)測)，K，B1，B2(理論)含量較高，AIN93-G飼料中維生素D含量較高，維生素B6(實(shí)測)持平。此外，全價(jià)飼料有更高的葉酸含量。

表1 兩種飼料營養(yǎng)成分的比較Tab.1 Comparison of nutritional components between the two kind of diets

2.2 AIN-93G飼料對DEN誘導(dǎo)肝癌小鼠體重的影響

兩組小鼠于3周齡(0.75月齡)時(shí)分籠，此時(shí)兩組小鼠體重差異無顯著性(P> 0.05)；兩組小鼠分別以全價(jià)飼料和AIN93-G飼料喂養(yǎng)至9月齡，取材前稱重，此時(shí)AIN-93G組小鼠體重明顯低于全價(jià)飼料組，差異有顯著性(P< 0.001)(圖1)。

注：全價(jià)飼料組與AIN-93G飼料組體重相比較，***P<0.001。圖1 AIN-93G飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠體重的影響Note. Compared with the body weight of AIN-93G diet group, ***P<0.001.Fig.1 Effect of AIN-93G diet on the body weight of DEN-treated mice

2.3 AIN-93G配方飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝重量的影響

分別取兩組小鼠肝組織稱重，結(jié)果顯示AIN93-G飼料組小鼠肝重量明顯低于全價(jià)飼料組，差異有顯著性(P< 0.01)(圖2A)；通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，AIN93-G飼料組小鼠肝重比(肝臟重量/體重 × 100%)也明顯低于全價(jià)飼料組，差異有顯著性(P< 0.05)(圖2B)

2.4 AIN-93G配方飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌的影響

AIN-93G飼料喂養(yǎng)DEN誘導(dǎo)的小鼠，肝腫瘤結(jié)節(jié)體積，數(shù)量均小于全價(jià)飼料組，HE染色顯示，AIN-93G飼料組腫瘤區(qū)域面積也小于全價(jià)飼料組(圖3A)。AIN-93G飼料同時(shí)影響了DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生率，全價(jià)飼料組小鼠在9月齡時(shí)全部產(chǎn)生肝癌，而AIN-93G飼料組小鼠肝癌發(fā)生率僅為37.5%(圖3B)。

注： A. 全價(jià)飼料組與AIN-93G飼料組肝重量相比較， **P<0.01；B. 全價(jià)飼料組與AIN-93G飼料組肝體重比相比較，* P<0.05。圖2 AIN-93G飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝重的影響Note. A. Compared with the liver weight in the AIN-93G diet group, **P<0.01; B. Compared with the liver weight ratio in the AIN-93G diet group,*P<0.05.Fig.2 Effect of AIN-93G diet on liver weight in the DEN-treated mice

注：A. 不同飼料喂養(yǎng)DEN誘導(dǎo)小鼠的肝外觀和HE染色(×4)；B. 不同飼料喂養(yǎng)DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌的發(fā)生率。圖3 AIN-93G飼料對DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌的影響Note: A.Liver appearance and HE staining histology of DEN-induced mice with different diet；B. Incidence of DEN-induced HCC in mice with different dietFig.3 Effect of AIN-93G diet on liver cancer formation in the DEN-treated mice

3 討論

本研究在建立DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型過程中，意外發(fā)現(xiàn)使用不同配方的飼料喂養(yǎng)模型小鼠，小鼠的荷瘤情況發(fā)生很大差異。采用常規(guī)全價(jià)飼料喂養(yǎng)的小鼠，在9月齡時(shí)，按照預(yù)期成功產(chǎn)生了肝癌，肝表面肉眼可見多個(gè)大小不一的白色結(jié)節(jié)，經(jīng)HE染色后分析病理結(jié)構(gòu)，確定其為肝細(xì)胞癌。而由AIN93-G飼料喂養(yǎng)的模型小鼠，部分肝表面未見腫瘤結(jié)節(jié)，部分生長腫瘤的小鼠，與對照組相比，結(jié)節(jié)數(shù)量少，體積較小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AIN93-G飼料喂養(yǎng)的小鼠，并沒有全部產(chǎn)生肝癌，產(chǎn)生肝癌的個(gè)體中，腫瘤發(fā)展程度也明顯低于對照組，提示AIN-93G飼料喂養(yǎng)的小鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展受到了抑制。

DEN是一種N-亞硝基有機(jī)化合物，具有較強(qiáng)的肝毒性，導(dǎo)致肝細(xì)胞DNA損傷突變從而誘發(fā)肝癌，與人類肝癌發(fā)病過程相近[5]，因此常被用作建立大小鼠肝癌模型的誘導(dǎo)劑[6，7]。在非常幼小的小鼠中，DEN是完全的致癌劑，但在更成熟的個(gè)體中，需要額外給予促癌劑，通過多種機(jī)制共同作用才能形成肝癌[8]。在多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道中，通常選用14～15日齡雄性小鼠腹腔一次性注射DEN來建立小鼠肝癌模型[9-11]。本研究中采用14日齡雄性小鼠腹腔注射DEN，給藥量25 mg/kg體重，常規(guī)全價(jià)飼料喂養(yǎng)的個(gè)體，9月齡時(shí)100%產(chǎn)生肝癌，與以往報(bào)道結(jié)果一致[12]。

AIN-93G飼料配方由美國營養(yǎng)科學(xué)學(xué)會(huì)(American Society of Nutritional Sciences, ASNS)研制開發(fā)，是AIN-76A飼料配方的改良型，該配方經(jīng)過深入研究，能夠維持生長期嚙齒類動(dòng)物的長期健康[13]。本實(shí)驗(yàn)AIN-93G飼料委托廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心根據(jù)該配方合成，經(jīng)測定其主要營養(yǎng)成分基本等于或接近配方理論數(shù)據(jù)。但在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)此AIN-93G飼料喂養(yǎng)的小鼠，在肝癌生長受到抑制的同時(shí)，小鼠體重明顯下降，肝重量也明顯低于對照組，在一定程度上說明該飼料對小鼠的營養(yǎng)健康或免疫產(chǎn)生影響。另一方面，通過對比兩種飼料營養(yǎng)成分的差異，初步推測AIN-93G飼料中某些成份不利于誘導(dǎo)腫瘤的形成，其中各種微量元素含量普遍低于全價(jià)飼料，然而是否微量元素或其他某種未測得成分在其中扮演了具體角色，需要進(jìn)行更深入的研究。

現(xiàn)在還無法證明，是否由于原材料和加工等因素，使得AIN-93G合成飼料質(zhì)地硬度不同于全價(jià)飼料，造成小鼠采食量產(chǎn)生差異[14，15]，進(jìn)而造成小鼠營養(yǎng)攝入不足。由于原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)初衷僅為造模，并沒有考慮飲食因素，因此暫時(shí)缺少采食量數(shù)據(jù)；接下來實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步測定飼料硬度，并記錄詳細(xì)采食量，以排除是否由于采食量減少造成營養(yǎng)攝入不足導(dǎo)致了小鼠體重下降。

本研究的結(jié)果證明了在建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型過程中，環(huán)境因素，尤其是飲食因素起到了關(guān)鍵性作用。適宜的生活環(huán)境，合理的飲食是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。本研究中并未證實(shí)除體重和肝重減輕外，小鼠肝功能是否還有其他變化；小鼠體重的下降與肝癌生長受到抑制是否有直接關(guān)系，以及這一現(xiàn)象的原因和意義有待更深入的探討。

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Effect of different formula diets on mouse model with DEN-induced hepatocellular carcinoma

HE Xiao-dong1, GUI Yi-he1, LI Bing-lin1, DENG Hui-jun1, LI Jiang-chao1, QIAO-Liang2, WANG Li-jing1*

(1. Vascular Biology Research Institute, School of Basic Courses,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China； 2. Storr Liver Centre, The Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney,Westmead NSW 2145 Australia)

Objective To establish a mouse model of diethylnitrosamine(DEN)-induced hepatocellular carcinoma (HCC), and to explore the effects of two different diet formulas on the establishment of DEN-induced HCC model. Methods SPF C57BL/6 mice (8 males and 8 females) were injected intraperitoneally with 25 mg/kg DEN at day 14 to establish a HCC model. The mice were divided into two groups after weaning. One group was fed with the SPF class rodents cereal-based diet, another group was fed with AIN-93G formula diet. The mice were sacrificed at the age of 9 months. The livers were weighed and the growth of liver cancer was observed and recorded. Results All the mice in the cereal-based diet group developed HCC as expected. The body weight and liver mass of the mice in the AIN-93G diet group were significantly lower than that of the cereal-based diet group. The incidence of HCC, and the number and size of tumor nodules were also significantly lower in the AIN-93G diet group than that in the cereal-based diet group. Conclusions DEN-induced HCC model has been successfully established in mice fed with cereal-based diet, while mice fed with AIN93-G diet prevented the development of DEN-induced HCC, and their body weight was decreased significantly, suggesting that dietary factors play a key role in establishment of animal disease models.

Diet; Diethylnitrosamine; Hepatocellular carcinoma; Mice

WANG Li-jing. E-mail: wanglijing62@163.com

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(編號：B2014207)。

何曉東(1983-)，男，助理研究員。研究方向：基因工程小鼠疾病模型。E-mail: hexiaodong1234567@163.com

王麗京(1962-)，女，教授。研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。E-mail: wanglijing62@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0306-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.013

2016-10-14