Roux-en-Y胃旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠肝及外周胰島素敏感性的影響

劉紅媛，馬南希，馬瑞，何冰

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110004)

研究報告

Roux-en-Y胃旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠肝及外周胰島素敏感性的影響

劉紅媛，馬南希，馬瑞，何冰*

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110004)

目的 觀察RYGB術(shù)后不同時間2型糖尿病大鼠肝及外周組織胰島素敏感性的變化并初步探討可能機(jī)制。方法 RYGB組(n=21)及RYGB假手術(shù)組(n=7)，采用清醒狀態(tài)擴(kuò)展高胰島素-正血糖鉗夾術(shù)，評估RYGB術(shù)后2、4、8周肝及外周組織胰島素敏感性。檢測肝及腓腸肌內(nèi)TG水平。結(jié)果 RYGB術(shù)降低體重，減少體內(nèi)脂肪，改善脂代謝。術(shù)后2周肝胰島素敏感性指數(shù)顯著提高，肝TG含量明顯下降(P<0.05)。術(shù)后4周 M值顯著提高，肌肉TG含量明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 RYGB術(shù)后肝胰島素敏感性的提高早于外周組織，肝及外周組織胰島素抵抗持續(xù)改善有助于2型糖尿病的長期緩解。RYGB術(shù)減少肝及骨骼肌脂肪沉積可能是術(shù)后胰島素敏感性上調(diào)的重要機(jī)制之一。

2型糖尿??；肥胖；胰島素抵抗；Roux；胰胃旁路術(shù)

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5～6周齡雄性SD大鼠，SPF級，體重180～200 g，由北京華阜生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心SPF級環(huán)境【SYXK(遼)2010-0008】，溫度范圍20～24℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替，自由飲食及飲水。實驗過程按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷，并通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗倫理審查(編號2015PS137K)。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)，優(yōu)泌林R (humulin R，美國禮來)，[6-3H]葡萄糖由上海淶昂生物科技有限公司提供，組織甘油三酯檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，大鼠胰島素及C-肽測定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。拜安捷2血糖儀(德國拜耳)，HAWK400微量泵(深圳好克有限公司)，MacroMR小動物核磁共振成像儀(上海紐邁科技有限公司)，日立7180型全自動生化分析儀檢測血脂水平。

1.3 動物分組及手術(shù)

高脂喂養(yǎng)(40%脂肪，13%蛋白質(zhì)，47%碳水化合物)大鼠6周后皮下注射STZ(按體重30 mg/kg)，繼續(xù)高脂肪喂養(yǎng)。每周記錄血糖水平，空腹血糖大于16.7 mmol/L并持續(xù)4周的大鼠被認(rèn)定為糖尿病[5，6]。

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法抽取21只設(shè)為RYGB手術(shù)組，7只設(shè)為RYGB假手術(shù)組。RYGB手術(shù)組大鼠用10%水合氯醛(按體重0.35 mL/kg)腹腔麻醉，2%安爾碘消毒，沿腹中線切開腹部。在賁門下方以弧形切斷胃近端形成20%小胃囊，遠(yuǎn)端殘胃用6-0縫合線縫合關(guān)閉。在距Treitz韌帶遠(yuǎn)端約15 cm處進(jìn)行空腸離斷術(shù)，遠(yuǎn)端空腸和小胃囊吻合，在距吻合口10 cm處行近端及遠(yuǎn)端空腸端側(cè)吻合。術(shù)后用無菌慶大霉素生理鹽水沖洗進(jìn)行腹腔消毒。RYGB假手術(shù)組大鼠在與RYGB手術(shù)組大鼠相同部位，分別進(jìn)行胃及空腸離斷并原位端端吻合[7]。術(shù)后每周記錄大鼠體重和空腹血糖水平。實驗結(jié)束，取肝及腓腸肌組織。

利用“一行”圓，涂出“幾倍”，延伸至總量中“部分量”間的比較，豐富倍的內(nèi)涵；且答案多元，讓學(xué)生進(jìn)一步感受“標(biāo)準(zhǔn)量”的重要性，不同的學(xué)生積累不同的活動經(jīng)驗。讓學(xué)生體驗到有序思考的思想及解題策略。

1.4 清醒狀態(tài)擴(kuò)展高胰島素—正血糖鉗夾實驗

大鼠禁食12 h，用10%水合氯醛(按體重0.35 mL/kg)腹腔麻醉，將聚乙烯導(dǎo)管2根，每根一端接有一段3 cm長的硅膠管(內(nèi)徑0.05 cm)分別植入右頸內(nèi)靜脈用于輸液和左頸動脈用于采血，靜脈導(dǎo)管置于右心房水平，動脈導(dǎo)管置于主動脈弓水平，2根導(dǎo)管均經(jīng)皮下頸背部引出。大鼠術(shù)后恢復(fù)3 d，進(jìn)行清醒狀態(tài)擴(kuò)展高胰島素正血糖鉗夾實驗[8]。

大鼠禁食12 h，輸注優(yōu)泌林R [11 mU/(kg.min)] 和20%葡萄糖，每5 min抽取動脈血測血糖1次，根據(jù)血糖調(diào)整葡萄糖輸注速度，維持血糖(5.0±0.5) mmol/L。輸注[6-3H]葡萄糖20 μCi后,繼續(xù)輸注(4 μCi/min)，評估內(nèi)生葡萄糖生成率及外源葡萄糖利用率。穩(wěn)態(tài)在實驗開始后60 min達(dá)到，維持30 min，記錄穩(wěn)態(tài)下3～4次葡萄糖輸注率(GIR)，取均值。所有實驗組大鼠在實驗最后30 min，每10 min采動脈血一次，備測葡萄糖、胰島素、C-肽和[6-3H]葡萄糖活性。

1.5 肝及外周組織胰島素敏感性計算

在基礎(chǔ)胰島素輸注條件下，肝葡萄糖生成(HGP)以示蹤劑輸注速率/示蹤劑特異活性來計算。肝胰島素敏感性用肝胰島素敏感性指數(shù)(HISI)評估，即HGP和空腹胰島素乘積的倒數(shù)，外周組織胰島素敏感性以鉗夾最后30 min葡萄糖輸注率的平均值計算[9]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RYGB手術(shù)對血糖的影響

如圖1所示，RYGB假手術(shù)組大鼠術(shù)后空腹血糖維持在15～20 mmol/L,RYGB術(shù)后1周大鼠空腹血糖較假手術(shù)組大鼠降低45%(P<0.05)，RYGB術(shù)后2周大鼠空腹血糖恢復(fù)至正常水平。RYGB手術(shù)可以有效降低2型糖尿病大鼠血糖。

2.2 RYGB手術(shù)對體重的影響

RYGB手術(shù)組大鼠與RYGB假手術(shù)組大鼠術(shù)前體重沒有差異，RYGB術(shù)后2周大鼠體重較RYGB假手術(shù)組大鼠顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。RYGB手術(shù)組大鼠體重持續(xù)下降至術(shù)后4周，4周后大鼠體重達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài)，見圖2A。如圖2B，C所示，RYGB手術(shù)對體重的影響主要是其降低了體內(nèi)脂肪的含量，而對瘦體質(zhì)量無影響。

2.3 RYGB手術(shù)對胰島素、C-肽及血脂的影響

RYGB假手術(shù)組大鼠血漿胰島素和C肽水平顯著高于RYGB 2周, RYGB 4周及RYGB 8周組大鼠(表1，P<0.05)。與RYGB假手術(shù)組大鼠相比，RYGB術(shù)后2周,大鼠血漿游離脂肪酸濃度下降30%，甘油三酯濃度下降24%，總膽固醇濃度降低13%(表1，P<0.05)。RYGB手術(shù)改善高胰島素血癥，降低血脂水平。

圖1 兩組大鼠術(shù)后每周空腹血糖水平(與RYGB假手術(shù)組比，*P<0.05)Fig.1 The fasting glucose level in each study group was assessed before and every week after surgery,sampled from the tail vein using a portable glucometer(*P<0.05, vs. the RYGB sham group)

圖2 兩組大鼠體重及體質(zhì)構(gòu)成(與RYGB假手術(shù)組比，*P<0.05)Fig.2 Comparison of the rat body weight and body composition in each study group. The rat weight (A), fat composition (B), and lean mass (C) were recorded before and every week after surgery (*P<0.05, vs. the RYGB sham group)

組別Groups胰島素μU/mLInsulinC-肽nmol/LC-peptide游離脂肪酸mmol/LFreefattyacids甘油三酯mg/dLTriglyceride總膽固醇mg/dLTotalcholesterolRYGB假手術(shù)組RYGBsham27.11±3.550.49±0.070.62±0.2088.30±9.21100.84±9.25RYGB2周組RYGB2w20.55±2.79*0.35±0.05*0.44±0.16*69.77±8.37*88.18±9.43*RYGB4周組RYGB4w16.48±2.05*0.29±0.08*0.34±0.11*54.90±6.89*72.05±8.42*RYGB8周組RYGB8w14.93±2.40*0.26±0.09*0.30±0.15*46.78±5.30*64.71±6.43*

注：與RYGB假手術(shù)組相比，*P<0.05。

Note.*P<0.05, vs. the RYGB sham group.

2.4 RYGB手術(shù)對外周組織及肝胰島素敏感性的影響

外周組織胰島素敏感性用鉗夾最后30 min葡萄糖輸注率的平均值(M值)評估，主要為肌肉組織對葡萄糖的利用率[9]。與RYGB假手術(shù)組大鼠相比，RYGB術(shù)后2周大鼠M值有增加趨勢。RYGB 2周組：M值(10.0±3.1) mg/(kg·min)；RYGB假手術(shù)組：M值(8.5±2.0)mg/(kg·min)，但是差異無顯著性(P>0.05)。RYGB術(shù)后4周，大鼠M值較RYGB假手術(shù)組大鼠增加近1倍(圖3A，P<0.05)。肝胰島素敏感性用HISI評估，為HGP和空腹胰島素乘積的倒數(shù)[9]。RYGB術(shù)后2周，大鼠HISI已經(jīng)較RYGB假手術(shù)組大鼠顯著增加(圖3B，P<0.05)。RYGB手術(shù)減輕胰島素抵抗，術(shù)后肝胰島素敏感性的改善早于外周組織胰島素敏感性的改善。

2.5 RYGB手術(shù)對肝及肌肉組織甘油三酯含量的影響

RYGB術(shù)后2周大鼠肝甘油三酯(triglyceride, TG)含量較RYGB假手術(shù)組大鼠降低27%(圖4A，P<0.05)。RYGB術(shù)后2周，兩組大鼠肌肉組織TG含量差異無顯著性(圖4B，P>0.05)。RYGB術(shù)后4周大鼠肌肉組織TG含量顯著下降(圖4B，P<0.05)。

Pearson correlation分析結(jié)果顯示，肝胰島素敏感指數(shù)HISI與肝組織甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.537,P<0.05)，而M值與肌肉組織甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.509,P<0.05)。

圖3 RYGB手術(shù)對大鼠肝及外周組織胰島素敏感性影響(與RYGB假手術(shù)組比，*P<0.05)Fig.3 The effects of RYGB surgery on hepatic and peripheral tissue insulin sensitivity.(A) M-value and (B) HISI in each study group. (*P<0.05, vs. the RYGB sham group)

圖4 肝及肌肉組織甘油三酯含量(與RYGB假手術(shù)組比，*P<0.05)Fig.4 Triglyceride content in the liver and muscle tissues in each rat group (A) Triglyceride in the liver. (B) Triglyceride in the muscle(*P<0.05 vs. RYGB sham group)

3 討論

1967年Mason 首次提出采用Roux-en-Y胃旁路術(shù)治療嚴(yán)重肥胖癥，1980年初，人們發(fā)現(xiàn)肥胖合并2型糖尿病患者，RYGB術(shù)后短時間內(nèi)血糖完全恢復(fù)，而且正常血糖可以長久維持。RYGB手術(shù)能夠有效控制肥胖2型糖尿病患者血糖，這一結(jié)論被后續(xù)多個大型臨床研究證實[2]。我們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠RYGB術(shù)后血糖明顯下降，術(shù)后1周空腹血糖降低45%，術(shù)后2周空腹血糖完全恢復(fù)正常。RYGB術(shù)后部分胃腸激素分泌水平變化，進(jìn)而通過腸-胰島軸調(diào)節(jié)胰島內(nèi)分泌功能，改善血糖[10，11]。RYGB手術(shù)對2型糖尿病胰島素敏感性影響的研究結(jié)論并不一致。肝、肌肉及脂肪(外周組織)是胰島素的主要作用靶點，為了評價RYGB手術(shù)對胰島素敏感性的影響，本研究采用高胰島素-正血糖鉗夾結(jié)合示蹤劑，觀察了RYGB術(shù)后不同時間2型糖尿病大鼠肝及外周組織胰島素敏感性的變化。

我們使用肝胰島素敏感指數(shù)評估肝胰島素敏感性，肝胰島素敏感指數(shù)為肝葡萄糖生成與空腹胰島素乘積的倒數(shù)。RYGB術(shù)后2周肝胰島素敏感指數(shù)增加1倍，這與Dunn等對肥胖伴或不伴有2型糖尿病患者的研究結(jié)果一致，RYGB術(shù)后肝胰島素抵抗減輕有助于早期糖代謝的改善[12]。我們通過高濃度胰島素抑制肝糖輸出，用鉗夾最后30 min葡萄糖輸注率的平均值M值評估外周組織(主要為肌肉組織)胰島素敏感性的變化[9]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與RYGB假手術(shù)組大鼠比較， RYGB術(shù)后2周大鼠外周胰島素敏感性有改善，但沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異，直到術(shù)后4周M值顯著升高。我們的研究結(jié)果提示，RYGB術(shù)后肝胰島素抵抗改善對2型糖尿病術(shù)后早期血糖下降發(fā)揮重要作用，而肝及外周胰島素敏感性持續(xù)增強(qiáng)有助于2型糖尿病術(shù)后血糖的長久緩解。

RYGB術(shù)后大鼠體重下降，體內(nèi)脂肪含量顯著降低，瘦體質(zhì)量沒有明顯變化。同時，脂代謝紊亂狀態(tài)(包括高甘油三酯，高總膽固醇及高游離脂肪酸)在術(shù)后短時間得以糾正，RYGB手術(shù)改善了2型糖尿病糖脂代謝異常[13]。我們觀察了RYGB手術(shù)對胰島素和C-肽分泌水平的影響，與其他研究結(jié)果一致[14]，RYGB術(shù)后2周大鼠空腹胰島素和C-肽濃度已經(jīng)低于對照組大鼠，表明與胰島素抵抗相關(guān)的胰島素分泌代償增高減輕。

我們進(jìn)一步探討了RYGB手術(shù)改善肝及外源組織胰島素敏感性的可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RYGB手術(shù)減少肝及骨骼肌內(nèi)甘油三酯沉積，即降低組織脂毒性[15]，與術(shù)后肝及外周胰島素敏感性上調(diào)密切相關(guān)。

總之，本研究利用高胰島素-正血糖鉗夾結(jié)合示蹤劑，觀察了RYGB術(shù)后不同時間肝及外周組織胰島素敏感性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RYGB術(shù)后肝胰島素敏感性增強(qiáng)對早期血糖下降起重要作用，而肝及外周組織胰島素抵抗持續(xù)改善有助于2型糖尿病術(shù)后血糖長期穩(wěn)定于正常水平。RYGB手術(shù)減少肝及骨骼肌脂肪沉積是術(shù)后肝及外周組織胰島素敏感性上調(diào)的重要機(jī)制之一。

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Roux-en-Y gastric bypass increases hepatic and peripheral insulin sensitivity in rats with type 2 diabetes mellitus

LIU Hong-yuan, MA Nan-xi, MA Rui, HE Bing*

(Department of Endocrinology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the effects of Roux-en-Y gastric bypass (RYGB) on hepatic and peripheral insulin sensitivity in rats with type 2 diabetes and their possible mechanisms. Methods 5-6 week old SPF male Sprague-Dawley rats were divided into 2 groups: diabetic RYGB group (n=21) and diabetic RYGB sham group (n=7). The hyperinsulinemic-euglycemic clamp with tracer infusion was completed at 2, 4, and 8 weeks postoperatively to assess the insulin sensitivity. The lipid content in liver and muscle tissue was examined. Results Postoperatively, the diabetic RYGB group had significant decreases in weight, fat mass, and RYGB had a profound effect on the plasma lipid profile. Two weeks after surgery, the hepatic insulin sensitivity index was significantly improved and the hepatic triglyceride was decreased in the RYGB group (P<0.05). The significant increased insulin sensitivity was not detected until four weeks after RYGB surgery, the M value was significantly increased and the TG content in the muscle tissue was significantly decreased (P<0.05). Conclusions The increased insulin sensitivity after RYGB occurs earlier in the liver than in the muscle and both may contribute to the long-term remission of type 2 diabetes. Reduced lipid content in hepatocytes and skeletal muscle cells after RYGB may contribute to the improved insulin sensitivity in these cells.

Type 2 diabetes mellitus; Obesity; Insulin resistance; Roux-en-Y gastric bypass; Rats

HE Bing. E-mail:hb3h@hotmail.com

國家自然基金面上項目(NO.81570765)；遼寧省科學(xué)技術(shù)基金(NO.2015020539)。

劉紅媛(1992-)，女，碩士，研究方向：胃旁路術(shù)改善胰島素抵抗機(jī)制研究。E-mail： 594966484@qq.com

何冰(1973-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事脂毒性胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制及干預(yù)研究。E-mail:hb3h@hotmail.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0270-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.007

2016-09-18