雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究

張小路，杜梅紅，張 全，陳紅躍，趙 林，郭偉勝

·論著·

雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究

張小路1*，杜梅紅2，張 全1，陳紅躍1，趙 林1，郭偉勝2

背景 腎透明細(xì)胞癌發(fā)病率高，治愈率低。雷公藤紅素可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。而有關(guān)雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用研究較少。目的 探討雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用及其機(jī)制，以期為探索治療腎透明細(xì)胞癌的藥物提供借鑒。方法 2015年2月—2016年5月，培養(yǎng)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和正常腎小管上皮細(xì)胞HK2細(xì)胞(簡稱腎細(xì)胞HK2細(xì)胞)。檢測不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素作用不同時間(12、24、48 h)腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞存活率；檢測不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-氟尿嘧啶(5-Fu)作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性；檢測不同濃度(0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞周期、凋亡率；檢測不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞線粒體膜電位；檢測不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-9活性，Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、細(xì)胞色素c、磷酸多核糖基核糖醇(PRRP)水平。結(jié)果 0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率隨濃度增加依次減小(P<0.05)。1.0 μmol/L雷公藤紅素作用24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于12 h時(P<0.05)；1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率隨時間增加依次減小(P<0.05)。0.5 μmol/L雷公藤紅素、1.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素，腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于1.0 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)。0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下G0/G1期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞多于S期，G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期(P<0.05)。1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于1.5 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎細(xì)胞HK2細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素(P<0.05)。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位依次增大(P<0.05)。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性依次增大(P<0.05)。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平依次升高，Bcl-2水平依次降低(P<0.05)。結(jié)論 雷公藤紅素可能通過激活caspase-3、caspase-9活性，上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平，下調(diào)Bcl-2水平來抑制腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

腎腫瘤；腺癌,透明細(xì)胞；雷公藤紅素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

張小路,杜梅紅,張全,等.雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(21)：2590-2597.[www.chinagp.net]

ZHANG X L,DU M H,ZHANG Q,et al.Effect and mechanism of celastrol on the renal clear cell carcinoma 786-0 cells[J].Chinese General Practice，2017，20(21)：2590-2597.

腎透明細(xì)胞癌是由胞質(zhì)透明或嗜酸性的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的惡性腫瘤，腫瘤內(nèi)有纖細(xì)的血管網(wǎng)。腎透明細(xì)胞癌多發(fā)生于雙側(cè)腎臟，腫瘤中常見囊腔、壞死、出血和鈣化，影像學(xué)可顯示鈣化影；其發(fā)病率較高，為60%～85%[1]。腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞源自原發(fā)性腎透明細(xì)胞癌，此細(xì)胞有微絨毛和橋粒，能在軟瓊脂中生長。雷公藤紅素是三萜類醌甲基化合物，具有抗炎、抗神經(jīng)退行性疾病作用[2]，可調(diào)節(jié)靶點腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促炎因子、細(xì)胞因子等，起到抗炎和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3-4]。而有關(guān)雷公藤紅素對于腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞作用的研究較少，特別是分子機(jī)制方面[5]。本研究旨在觀察雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞增殖、周期、凋亡的作用，并探索細(xì)胞凋亡機(jī)制，以期為探索治療腎透明細(xì)胞癌的藥物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞株、正常腎小管上皮細(xì)胞HK2細(xì)胞(簡稱腎細(xì)胞HK2細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；雷公藤紅素(純度>98%)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-9試劑盒購自GIBICO；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液、5-氟尿嘧啶(5-Fu)購自Sigma公司；Bax、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、細(xì)胞色素c、磷酸多核糖基核糖醇(PRRP)等兔抗人抗體(一抗)購自艾美捷科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀購自BD公司。

1.2 研究方法 本研究時間為2015年2月—2016年5月。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)[6]采用含10%小牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，貼壁80%時，消化并傳代。

1.2.2 檢測細(xì)胞存活率[7]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞接種于96孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，貼壁后的細(xì)胞分別采用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素處理，12、24、48 h后加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，800 r/min離心2 min(離心半徑6 cm)，棄上清液，加150 μl十二烷基硫酸鈉，振蕩8 min。測定570 nm處吸光度，計算細(xì)胞存活率。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3 檢測細(xì)胞毒性[8-9]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞，分別采用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu處理，24 h后，采用LDH法于450 nm處檢測細(xì)胞毒性。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 檢測細(xì)胞周期[10]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，貼壁后，分別采用不同濃度(0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu處理，采用70%乙醇于-20 ℃固定，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)和10 μl核糖核酸酶(RNase)，室溫下培養(yǎng)30 min，加入10 μl碘化丙啶(PI)培養(yǎng)30 min，采用FACSVerse流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 檢測細(xì)胞凋亡率[11]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，貼壁后，采用不同濃度(0、1.5、2.0 μmol/L)雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu處理，24 h后，加入胰蛋白酶消化，采用FACSVerse流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 檢測線粒體膜電位[12]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞和腎細(xì)胞HK2細(xì)胞，采用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素處理，24 h后，加入1 mmol/L羅丹明123進(jìn)行細(xì)胞染色，37 ℃染色30 min，采用FACSVerse流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 檢測caspase-3、caspase-9活性[13]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞，采用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素處理，24 h后，裂解15 min，12 000 r/min離心20 min(離心半徑3 cm)，取上清液(含30 μg蛋白)，加入90 μl探針和10 μl蛋白酶，37 ℃培養(yǎng)2 h，測定570 nm處吸光度，判定caspase-3、caspase-9活性。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8 檢測Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平[14]取對數(shù)期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞，制成3×105個/ml單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，采用不同濃度(0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤紅素處理，24 h后收集細(xì)胞；12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜；PBST洗3次，5 min/次；加入二抗，室溫孵育1 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，讀取灰度值，即Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率 不同濃度雷公藤紅素作用不同時間腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于0μmol/L雷公藤紅素，1.0、1.5、2.0μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于0.5μmol/L雷公藤紅素，1.5、2.0μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于1.0μmol/L雷公藤紅素，2.0μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于1.5μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。0.5μmol/L雷公藤紅素作用不同時間腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；1.0、1.5、2.0μmol/L雷公藤紅素作用不同時間腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.0μmol/L雷公藤紅素作用24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于12h時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.5、2.0μmol/L雷公藤紅素作用24、48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于12h時，48h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于24h時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

不同濃度雷公藤紅素作用不同時間腎細(xì)胞HK2細(xì)胞存活率組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度雷公藤紅素作用不同時間腎細(xì)胞HK2細(xì)胞存活率組內(nèi)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

Table 1 Comparison of survival rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells after treating with celastrol at different concentrations for different time

雷公藤紅素濃度(μmol/L)時間(h)12 24 48 F值P值0100.0±0.0 100.0±0.0 100.0±0.0 --0.595.1±5.0a94.3±4.7a93.4±4.7a 0.267 0.7681.088.4±4.7ab80.2±4.2abe78.4±4.6abe12.654<0.0011.580.3±2.8abc73.6±2.7abce60.2±2.2abcef143.003<0.0012.058.6±1.4abcd45.4±2.0abcde36.2±1.6abcdef404.258<0.001F值209.031402.689597.603P值<0.001<0.001<0.001

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與0.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與1.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05；與1.5 μmol/L雷公藤紅素比較，dP<0.05；與12 h比較，eP<0.05；與24 h比較，fP<0.05；-表示無此項數(shù)據(jù)

2.2 細(xì)胞毒性 不同濃度雷公藤紅素、5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5 μmol/L雷公藤紅素、1.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素，腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于1.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3 細(xì)胞周期 不同濃度雷公藤紅素、5-Fu作用下不同細(xì)胞周期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度雷公藤紅素、5-Fu作用下不同細(xì)胞周期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下G0/G1期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞多于S期，G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、5)。

Table 2 Comparison of survival rate of renal cells HK2 cells after treating with celastrol at different concentrations for different time

雷公藤紅素濃度(μmol/L)時間(h)12 24 48F值P值0100.0±0.0100.0±0.0100.0±0.0--0.597.2±4.495.8±4.497.0±4.20.2610.7731.095.4±4.796.3±3.496.2±3.70.1330.8761.593.9±2.994.1±2.197.2±4.52.7780.0822.093.2±3.393.2±2.794.5±3.00.5600.579F值1.8521.7950.925P值0.1580.1680.440

注：-表示無此項數(shù)據(jù)

Table 3 Comparison of cytotoxicity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells after treating with celastrol at different concentrations and 5-Fu

藥物腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞毒性腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性0μmol/L雷公藤紅素100.0±0.0100.0±0.00.5μmol/L雷公藤紅素108.2±0.4a108.1±0.4a1.0μmol/L雷公藤紅素109.2±1.2a107.1±1.3a1.5μmol/L雷公藤紅素110.3±1.1a109.2±2.0a2.0μmol/L雷公藤紅素215.4±2.3abcd110.1±2.2ac1.5μmol/L5-Fu220.2±2.2abcde113.3±2.1abcdeF值4511.52123.486P值<0.001<0.001

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與0.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與1.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05；與1.5 μmol/L雷公藤紅素比較，dP<0.05；與2.0 μmol/L雷公藤紅素比較，eP<0.05；5-Fu=5-氟尿嘧啶

2.4 細(xì)胞凋亡率 不同濃度雷公藤紅素、5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于1.5 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎細(xì)胞HK2細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表6)。

2.5 線粒體膜電位 不同濃度雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位大于0 μmol/L雷公藤紅素，1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位大于0.5 μmol/L雷公藤紅素，1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位大于1.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度雷公藤紅素作用下腎細(xì)胞HK2細(xì)胞線粒體膜電位比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表7)。

Table 4 Comparison of cell cycle of renal clear cell carcinoma 786-0 cells after treating with celastrol at different concentrations and 5-Fu

藥物腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞周期(期)S G0/G1 G2/MF值P值0μmol/L雷公藤紅素38.2±3.436.8±2.021.0±1.5ab46.393<0.0011.5μmol/L雷公藤紅素36.2±2.539.1±3.421.4±1.7ab39.878<0.0012.0μmol/L雷公藤紅素34.3±4.741.3±1.6a24.4±2.1ab22.5050.0021.5μmol/L5-Fu33.0±4.139.7±2.6a24.8±2.1ab17.5140.003F值1.0691.6523.406P值0.4150.2530.074

注：與S期比較，aP<0.05；與G0/G1期比較，bP<0.05

Table 5 Comparison of cell cycle of renal cells HK2 cells after treating with celastrol at different concentrations and 5-Fu

藥物腎細(xì)胞HK2細(xì)胞周期(期)S G0/G1 G2/MF值P值0μmol/L雷公藤紅素40.9±0.738.2±2.017.6±1.1ab249.496<0.0011.5μmol/L雷公藤紅素40.4±1.040.1±4.218.1±1.4ab70.532<0.0012.0μmol/L雷公藤紅素38.4±1.842.8±1.3a18.8±0.4ab291.146<0.0011.5μmol/L5-Fu37.8±1.643.3±1.2a20.3±2.0ab160.008<0.001F值3.6082.7942.182P值0.0650.1090.168

注：與S期比較，aP<0.05；與G0/G1期比較，bP<0.05

Table 6 Comparison of apoptosis rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells after treating with celastrol at different concentrations and 5-Fu

藥物腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率腎細(xì)胞HK2細(xì)胞凋亡率0μmol/L雷公藤紅素3.9±0.83.7±0.61.5μmol/L雷公藤紅素27.6±1.2a4.6±0.62.0μmol/L雷公藤紅素54.1±3.5ab4.1±0.51.5μmol/L5-Fu50.3±3.3ab5.3±0.6acF值260.2364.199P值<0.0010.046

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與1.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與2.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05

Table 7 Comparison of mitochondrial membrane potential of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells after treating with celastrol at different concentrations

雷公藤紅素濃度(μmol/L)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位腎細(xì)胞HK2細(xì)胞線粒體膜電位015.2±1.214.2±1.00.518.6±1.4a15.1±1.21.035.7±1.8ab15.2±1.51.549.8±2.2abc16.2±2.2F值268.3860.814P值<0.0010.521

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與0.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與1.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05

2.6 caspase-3、caspase-9活性 不同濃度雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性大于0 μmol/L雷公藤紅素，1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性大于0.5 μmol/L雷公藤紅素，1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性大于1.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表8)。

Table 8 Comparison of caspase-3,caspase-9 activity in the renal clear cell carcinoma 786-0 cells after treating with celastrol at different concentrations

雷公藤紅素濃度(μmol/L)caspase-3caspase-901.00±0.001.00±0.000.51.22±0.02a1.34±0.02a1.01.64±0.05ab1.52±0.02ab1.51.71±0.03abc1.85±0.05abcF值356.433492.471P值<0.001<0.001

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與0.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與1.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05；caspase=含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶

2.7 Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平 不同濃度雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平高于0 μmol/L雷公藤紅素，Bcl-2水平低于0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平高于0.5 μmol/L雷公藤紅素，Bcl-2水平低于0.5 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平高于1.0 μmol/L雷公藤紅素，Bcl-2水平低于1.0 μmol/L雷公藤紅素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表9)。

3 討論

雷公藤紅素是從中藥雷公藤的根皮當(dāng)中提取出的一種三萜類的天然產(chǎn)物[15]。2006年，中美兩國科學(xué)家通過體內(nèi)、體外抗腫瘤機(jī)制研究證實，雷公藤紅素是一種有效的抗癌活性成分，掀起了雷公藤紅素抗癌研究的熱潮[16]。研究者相繼發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素對前列腺癌、子宮癌、乳腺癌等多種癌癥的癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用[17]，提示雷公藤紅素有望成為一種新型抗腫瘤輔助藥物，然而，雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究較少。同時，本文通過比較雷公藤紅素與化療藥物5-Fu對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的作用的差異性，為雷公藤紅素成為新一代抗腫瘤輔助藥物提供依據(jù)。

表9 不同濃度雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平比較

Table 9 Comparison of the levels of Bax,Bcl-2,cytochrome c and PRRP in the renal clear cell carcinoma 786-0 cells after treating with celastrol at different concentrations

雷公藤紅素濃度(μmol/L)BaxBcl-2細(xì)胞色素cPRRP01.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.000.51.21±0.03a0.81±0.03a1.13±0.03a1.21±0.03a1.01.41±0.03ab0.42±0.04ab1.41±0.02ab1.31±0.02ab1.51.61±0.04abc0.31±0.02abc1.82±0.03abc1.52±0.03abcF值249.788395.205854.310309.253P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與0 μmol/L雷公藤紅素比較，aP<0.05；與0.5 μmol/L雷公藤紅素比較，bP<0.05；與1.0 μmol/L雷公藤紅素比較，cP<0.05；Bcl-2=B淋巴細(xì)胞瘤-2，PRRP=磷酸多核糖基核糖醇

王瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對H1975細(xì)胞增殖有較明顯的抑制作用且呈濃度和時間依賴性，能夠顯著抑制H1975細(xì)胞的侵襲能力。張乙川等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可以抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并呈濃度和時間依賴性，可以增強(qiáng)caspase-3 活性。本研究結(jié)果顯示，0、0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率隨濃度增加依次減?。?.0 μmol/L雷公藤紅素作用24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率小于12 h時；1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素作用12、24、48 h時腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞存活率隨時間增加依次減小；說明雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞增殖有較明顯的抑制作用且呈濃度和時間依賴性。0.5 μmol/L雷公藤紅素、1.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0 μmol/L雷公藤紅素；2.0 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素，腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于1.0 μmol/L雷公藤紅素；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞毒性大于0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤紅素；說明雷公藤紅素的細(xì)胞毒性小于5-Fu。0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下G0/G1期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞多于S期，G2/M期腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞少于S、G0/G1期；說明雷公藤紅素以抑制腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞、腎細(xì)胞HK2細(xì)胞處于S期為主。1.5 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素；2.0 μmol/L雷公藤紅素、1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞凋亡率大于1.5 μmol/L雷公藤紅素；1.5 μmol/L 5-Fu作用下腎細(xì)胞HK2細(xì)胞凋亡率大于0 μmol/L雷公藤紅素、2.0 μmol/L雷公藤紅素；說明雷公藤紅素對腎細(xì)胞HK2細(xì)胞安全性高于5-Fu，可以為雷公藤紅素替代5-Fu提供依據(jù)。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位依次增大，說明雷公藤紅素促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞線粒體膜電位增大。與王瑩等[18]和張乙川等[19]研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素對不同細(xì)胞均有一定抑制作用，但對不同細(xì)胞的抑制率不同，且相同劑量的雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌抑制效果較好，這可能與細(xì)胞的特性有關(guān)。

caspase-3、caspase-9活性，Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素c、PRRP水平等與細(xì)胞的生存狀態(tài)密切相關(guān)，本文通過以上分子研究雷公藤紅素對腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的促凋亡作用的大小。caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，其在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的途徑中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中caspase-3、caspase-9活性依次增大，說明雷公藤紅素促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞分泌caspase-3、caspase-9，且呈濃度依賴性。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平依次升高，與FORNER等[20]的報道一致，說明雷公藤紅素促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞分泌Bax、細(xì)胞色素c、PRRP，且呈濃度依賴性。0、0.5、1.0、1.5 μmol/L雷公藤紅素作用下腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞中Bcl-2水平依次降低，說明雷公藤紅素抑制腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞分泌Bcl-2，且呈濃度依賴性，推測可能是雷公藤紅素通過表皮生長因子受體(EGFR)通路下調(diào)了Bcl-2水平。細(xì)胞凋亡途徑中的一條是以線粒體為核心，該途徑能夠促使腫瘤細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致DNA損傷；異常細(xì)胞信號均引起促凋亡蛋白活化[21-23]，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素c，活化caspase-9和caspase-3，促進(jìn)蛋白酶水解，引起細(xì)胞凋亡。凋亡通路被Bcl-2等凋亡抑制因子調(diào)控[19]。Bax/Bcl-2發(fā)生改變，表明Bax/Bcl-2在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了作用，且線粒體膜電位減少及胞質(zhì)中細(xì)胞色素c水平升高[24]。

本文的創(chuàng)新點在于對線粒體膜電位和caspase活性進(jìn)行了測定，而以往的研究少有報道。當(dāng)然，本研究也存在一些不足之處，研究對象僅限于腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞，對于其他癌細(xì)胞類型還需進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，雷公藤紅素可能通過激活caspase-3、caspase-9活性，上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、PRRP水平，下調(diào)Bcl-2水平來抑制腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

作者貢獻(xiàn)：張小路進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；杜梅紅進(jìn)行研究的實施與可行性分析；張全進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計學(xué)處理；陳紅躍進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；張小路撰寫論文；趙林進(jìn)行論文的修訂，英文的修訂；郭偉勝負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；張小路對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect and Mechanism of Celastrol on the Renal Clear Cell Carcinoma 786-0 Cells

ZHANGXiao-lu1*,DUMei-hong2,ZHANGQuan1,CHENHong-yue2,ZHAOLin1,GUOWei-sheng2

1.DepartmentofGeneralSurgery,HenanProvinceHospitalofTCM,Zhengzhou450002,China2.DepartmentofRadiology,HenanProvinceHospitalofTCM,Zhengzhou450002,China

*Correspondingauthor:ZHANGXiao-lu,Attendingphysician;E-mail:xiaoisxiao@126.com

Background The incidence rate of renal clear cell carcinoma was high and the cure rate was low.Celastrol could regulate cytokines in tumor cells,then inhibit the proliferation of tumor cells.However,there were few studies on the effect of celastrol on the renal clear cell carcinoma 786-0 cells.Objective To explore the effect and mechanism of celastrol on the renal clear cell carcinoma 786-0 cells,in order to provide a reference for investigating drugs for the treatment of renal clear cell carcinoma.Methods From February 2015 to May 2016,renal clear cell carcinoma 786-0 cells and normal renal tubular epithelial cells HK2 cells(renal cells HK2 cells) were cultured.The survival rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells were detected after treating with celastrol at different concentrations(0,0.5,1.0,1.5,2.0 μmol/L) for different time(12,24,48 h);cytotoxicity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells were detected after treating with celastrol at different concentrations(0,0.5,1.0,1.5,2.0 μmol/L),1.5 μmol/L 5-Fu;cell cycle,apoptosis rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells were detected after treating with celastrol at different concentrations(0,1.5,2.0 μmol/L),1.5 μmol/L 5-Fu;mitochondrial membrane potential of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells were measured after treating with celastrol at different concentrations(0,0.5,1.0,1.5 μmol/L);cysteine-containing aspartic proteolytic enzymes(caspase)-3,caspase-9 activity,the levels of Bax,B lymphocyte tumor-2(Bcl-2),cytochrome c and polyribosylribitol phosphate(PRRP) in the renal clear cell carcinoma 786-0 cells were detected after treating with celastrol at different concentrations(0,0.5,1.0,1.5,2.0 μmol/L).Results The survival rate of the renal cell carcinoma 786-0 cells decreased with the increase of concentration when treated with 0,0.5,1.0,1.5,2.0 μmol/L celastrol for 12,24,48 h(P<0.05).The survival rate of the renal cell carcinoma 786-0 cells treated with 1.0 μmol/L celastrol for 24,48 h were less than that for 12 h(P<0.05);the survival rate of the renal cell carcinoma 786-0 cells treated with 1.5,2.0 mumol/L celastrol for 12,24,48 h decreased with the increase of time(P<0.05).Cytotoxicity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells treated with 0.5 μmol/L,1.0 μmol/L,1.5 μmol/L,2.0 μmol/L celastrol and 1.5 μmol/L 5-Fu were larger than 0 μmol/L celastrol(P<0.05);cytotoxicity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 2.0 μmol/L celastrol was larger than 0.5,1.0,1.5 μmol/L celastrol(P<0.05);cytotoxicity of renal cells HK2 cells treated with 2.0 μmol/L celastrol was larger than 1.0 μmol/L celastrol(P<0.05);cytotoxicity of renal cell carcinoma 786-0 cells and renal cells HK2 cells treated with 1.5 mmol/L 5-Fu was larger than 0.5,1.0,1.5,2.0 μmol/L celastrol(P<0.05).After treated with 0,1.5 mmol/L celastrol,the renal cell carcinoma 786-0 cells and renal cells HK2 cells at the G2/M phase were less than S,G0/G1phase(P<0.05);after treated with 2.0 umol/L celastrol,1.5 umol/L 5-Fu,renal clear cell carcinoma 786-0 cells,renal cells HK2 cells at G0/G1phase were more than S phase,while renal clear cell carcinoma 786-0 cells and renal cells HK2 cells at G2/M phase were less than S,G0/G1phase(P<0.05).Cell apoptosis rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 1.5 μmol/L,2.0 μmol/L celastrol and 1.5 μmol/L 5-Fu were larger than 0 μmol/L celastrol(P<0.05);cell apoptosis rate of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 2.0 μmol/L celastrol and 1.5 μmol/L 5-Fu were larger than 1.5 μmol/L celastrol(P<0.05);cell apoptosis rate of renal cells HK2 cells treated with 1.5 μmol/L 5-Fu were larger than 0 μmol/L,2.0 μmol/L celastrol(P<0.05).Mitochondrial potential of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 0,0.5,1.0,1.5 μmol/L celastrol increased in turn(P<0.05).caspase-3,caspase-9 activity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 0,0.5,1.0,1.5 μmol/L celastrol increased in turn(P<0.05).The levels of Bax,cytochrome c,PRRP of renal clear cell carcinoma 786-0 cells treated with 0,0.5,1.0,1.5 μmol/L celastrol increased in turn,while the level of Bcl-2 decreased in turn(P<0.05).Conclusion Celastrol may inhibit the proliferation of renal clear cell carcinoma 786-0 cells and induce their apoptosis by activating caspase-3,caspase-9 activity,upregulating Bax,cytochrome c,PRRP levels and down-regulating Bcl-2 level.

Kidney neoplasms;Adenocarcinoma,clear cell;Celastrol;Cell proliferation;Apoptosis

河南省科技計劃項目(142300410070)

R 737.11

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.05.y14

2017-02-29；

2017-05-29)

1.450002 河南省鄭州市，河南省中醫(yī)院普外二科

2.450002 河南省鄭州市，河南省中醫(yī)院放射科

*通信作者：張小路，主治醫(yī)師；E-mail：xiaoisxiao@126.com