平肝止痛顆粒對偏頭痛（肝陽上亢型）大鼠血漿中ET、PENK含量的影響*

秦 瑞 金 曦

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

·研究報告·

平肝止痛顆粒對偏頭痛（肝陽上亢型）大鼠血漿中ET、PENK含量的影響*

秦 瑞 金 曦△

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

目的 觀察平肝止痛顆粒對肝陽上亢型偏頭痛大鼠的鎮(zhèn)痛效果，探討其治療偏頭痛的作用機制。方法使用附子法和硝酸甘油法制作肝陽上亢偏頭痛大鼠模型，通過酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血漿中內(nèi)皮素（ET）、前腦啡肽原（PENK）含量。結(jié)果 平肝止痛顆粒高、中劑量組均能明顯減少ET含量，與模型組比較差異顯著。頭痛寧和平肝止痛顆粒中劑量組可以減少PENK含量，與模型組比較有明顯差異。結(jié)論 平肝止痛顆粒可以有效降低肝陽上亢型偏頭痛，其作用機制可能與降低血漿中ET、PENK的含量有關(guān)。

平肝止痛顆粒 偏頭痛 內(nèi)皮素 腦啡肽 鎮(zhèn)痛

偏頭痛是一種臨床常見的原發(fā)性的神經(jīng)血管疾患，臨床表現(xiàn)為發(fā)作時一側(cè)或雙側(cè)的搏動性頭痛。屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”的范疇，其證治分類為外感、內(nèi)傷。外感分為風(fēng)寒頭痛、風(fēng)熱頭痛、風(fēng)濕頭痛；內(nèi)傷分為肝陽頭痛、血虛頭痛、痰濁頭痛、腎虛頭痛、瘀血頭痛。血漿內(nèi)皮素（ET）是廣泛存在于人體血管內(nèi)皮及其他組織中的一種縮血管物質(zhì)，而偏頭痛的發(fā)病機制一般通常認(rèn)為是血管舒縮功能障礙為主。前腦啡肽原（PENK）是腦啡肽的前體，通過作用于相應(yīng)部位的阿片受體實現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。本研究觀察通過測量肝陽上亢型偏頭痛大鼠血漿中ET、PENK的含量，通過統(tǒng)計學(xué)分析，探討平肝止痛顆粒治療偏頭痛的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，清潔級，延邊大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)單位動物許可證編號：SCXK-（吉）2011-0007。實驗動物飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物室屏障系統(tǒng)內(nèi)，動物室溫度19～23℃，相對濕度45～65%，光照12 h明、12 h暗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：動物飼料及飲水飼料原料組成為玉米、豆粕、魚粉、面粉、麩皮、食鹽、磷酸氫鈣、石粉、多種維生素、多種微量元素、氨基酸等組成。購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。飼料生產(chǎn)許可證號京飼證 （2014）06054，實驗動物許可證號SCXK （京）2014-0010，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB 14924.3-2010。大鼠飲水使用凱弗隆科技有限公司生產(chǎn)的KFL-400純水機制備的純凈水。實驗受試藥物及陽性藥，平肝止痛顆粒為棕色顆粒，含4.5 g生藥/g粉，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。藥物成份：水牛角、夏枯草、藳本、蔓荊子、梔子、川芎、當(dāng)歸、黃芩、生地黃、延胡索。頭痛寧膠囊（每粒0.4 g。陜西步長制藥有限公司，批號：150631）用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成濃度為0.7%g/kg的混合液。鹽酸氟桂利嗪膠囊（每粒5 mg。天津創(chuàng)新藥業(yè)有限公司，批號：20150306）用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成濃度為4 mg/kg的混合液。附子提取物的制備：稱取制附子粗粉500 g，加10倍水浸泡30 min后加熱回流提取2次，每次提取后過濾，合計提取時間2 h，合并濾液，減壓濃縮至2500 mL，計算得到濃縮液含生藥0.2 g/mL。2）儀器：DNM酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）、JA2003B千分之一天平 （上海越平科學(xué)儀器有限公司）、JJ200精密電子天平 （常熟雙杰測試儀器廠）、Y-2000型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）、低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)有限公司）、DW-86L386海爾立式超低溫保存箱（青島海爾特殊電器）。

1.3 分組與造模 肝陽上亢大鼠模型根據(jù)Cristina［1］等報道的硝酸甘油型實驗性動物模型制作，健康大鼠70只，雌雄分開，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，5 d后留取大鼠10只，為正常對照組，其余大鼠為造肝陽上亢模型鼠。參考文獻報道方法［2］，余下各組每日按2 g/kg體質(zhì)量給予上述制備得到的附子濃縮液，持續(xù)灌胃21 d，復(fù)制肝陽上亢證模型。當(dāng)灌胃附子組出現(xiàn)頻繁打斗、雙眼結(jié)膜顏色變深、飲水量增加、提頸時尖叫甚至咬人為肝陽上亢模型復(fù)制成功標(biāo)志。模型制備成功，大鼠隨機分成模型組、鹽酸氟桂利嗪膠囊組、頭痛寧組、平肝止痛顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組。正常對照組：灌胃10 mL/kg的蒸餾水，每日1次，連續(xù)21 d。模型組大鼠：給藥15 d后，上午繼續(xù)灌胃附子濃縮液，下午灌胃10 mL/kg的蒸餾水。鹽酸氟桂利嗪膠囊組：給藥15 d后，上午繼續(xù)灌胃附子濃縮液，下午灌胃4 mg/kg鹽酸氟桂利嗪膠囊內(nèi)容物。頭痛寧組：給藥15 d后，上午繼續(xù)灌胃附子濃縮液，下午灌胃0.7 g/kg頭痛寧膠囊內(nèi)容物。平肝止痛顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組：給藥15 d后，上午繼續(xù)灌胃附子濃縮液，下午灌胃5.32 g/kg（24 g生藥/kg）、2.66 g/kg（12 g生藥/kg）、1.33 g/kg（6 g生藥/kg）平肝止痛顆粒。持續(xù)給藥至第21天。動物造模處理，于大鼠最后給藥1 h后，除正常組外，各組均按照10 mg/kg（2 mL/kg）在右肩皮下注射硝酸甘油，正常對照組則按2 mL/kg劑量右肩皮下注射生理鹽水，復(fù)制硝酸甘油偏頭痛模型。當(dāng)大鼠出現(xiàn)前肢撓頭、頻繁爬籠、煩躁不安等情況時，證實為偏頭痛模型復(fù)制成功。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察各組動物疼痛行為學(xué)，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血漿中ET、PENK含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；如果方差齊性，采用LSD檢驗；如果方差不齊，則采用Dunnett T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠撓頭次數(shù)比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠撓頭次數(shù)顯著增加，表示模型成立。平肝止痛顆粒高劑量組顯著減少大鼠撓頭次數(shù)，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01）。

表1 各組大鼠撓頭潛伏期和不同時間段撓頭次數(shù)比較（min，±s）

表1 各組大鼠撓頭潛伏期和不同時間段撓頭次數(shù)比較（min，±s）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。下同。

組別 n正常對照組 10模型組 10鹽酸氟桂利嗪膠囊組 10 60～90 90～120 1.40±1.73△△△1.30±2.84△△△20.00±14.87 23.80±29.26 30.60±27.54 34.00±26.86頭痛寧組 10 10.10±5.81△36.10±26.40 27.00±22.05 27.20±40.80 17.00±14.23平肝止痛顆粒高劑量組 10 15.28±25.29 20.80±17.99 8.36±9.67△△6.27±10.09△△6.30±11.01△△平肝止痛顆粒中劑量組 10 7.42±4.65 26.00±16.44 25.80±26.68 14.20±11.91 19.60±28.08平肝止痛顆粒低劑量組 10 7.53±4.82 43.20±48.14 30.20±26.37 44.00±47.11 17.30±18.71搔頭潛伏期 0～30 30～60 35.87±40.85△1.90±2.06△△△1.00±1.48△△△5.94±2.48 31.50±23.09 33.00±22.72 7.76±3.92 44.70±42.31 31.64±27.91

2.2 各組大鼠血漿中ET、PENK含量比較 見表2。模型組ET、PENK含量明顯高于正常對照組 （P＜0.05或P＜0.01）。平肝止痛顆粒高、中劑量組均能明顯減少ET含量，與模型組比較差異顯著（均P＜0.05）。頭痛寧和平肝止痛顆粒中劑量組可以減少PENK含量，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血漿中ET、PENK含量比較（μmol/L，±s）

表2 各組大鼠血漿中ET、PENK含量比較（μmol/L，±s）

組別 n正常對照組 12模型組 12鹽酸氟桂利嗪膠囊組 11 ET PENK 82.83±28.18 186.91±56.04 132.32±105.91 200.59±65.90 155.39±130.06 202.78±48.82頭痛寧組 11 84.44±90.50 151.11±37.96△平肝止痛顆粒高劑量組 11 41.06±6.36△146.97±69.32平肝止痛顆粒中劑量組 12 45.35±14.57△125.77±21.68△△平肝止痛顆粒低劑量組 12 65.89±63.19 165.21±53.25

3 結(jié) 論

偏頭痛是臨床常見疾病和多發(fā)病，中醫(yī)治法分為虛證和實證的不同。外感頭痛屬實證，以風(fēng)邪為主，治療上主要以疏風(fēng)，兼以散寒、清熱、化濕。內(nèi)傷頭痛多屬虛證或虛實夾雜，虛證以滋陰養(yǎng)血，益腎填精。實證以平肝、化痰、行瘀?！端貑枴わL(fēng)論》“風(fēng)系循風(fēng)府而上，則為腦風(fēng)；風(fēng)系循頭，則為目風(fēng)……新沐中風(fēng)，則為首風(fēng)”［3］。首次提出了“首風(fēng)、腦風(fēng)”病名。符合偏頭痛發(fā)病似風(fēng)，起病迅速、善行數(shù)變等特點。關(guān)于偏頭痛的發(fā)病的病因病機，胡志強等［4］提出，偏頭痛的發(fā)病其主要機制責(zé)之于肝膽失去正常疏泄作用、導(dǎo)致風(fēng)陽上擾清竅。孫建寧［5］認(rèn)為偏頭痛是因為肝膽熱結(jié)，熱極生風(fēng)，痰阻血瘀，從而導(dǎo)致清竅失和，絡(luò)脈閉塞，發(fā)而為病。肝陽上亢型主要有情緒急躁易怒，毛細(xì)血管充盈、皮膚潮紅、心率加快等客觀表現(xiàn)，以及頭暈、目眩、口苦咽干、失眠等主觀癥狀［6］。本病的病機主要是肝風(fēng)內(nèi)動、肝陽上擾。最終確立“平肝潛陽”的方法來治療偏頭痛。平肝止痛顆粒主要由水牛角、夏枯草、藁本、蔓荊子、梔子、川芎、當(dāng)歸、黃芩、生地黃、延胡索組成。方中水牛角味咸而寒，入肝、心經(jīng)，能清熱涼血、解毒、定驚；夏枯草辛、苦而寒，能入肝、膽二經(jīng)，具有清熱瀉火、散結(jié)消腫之功。兩藥相合，起到清泄肝火之功。藁本辛溫，善行顛頂，止太陽頭痛；蔓荊子味辛、苦，性微寒，能疏散頭面之風(fēng)邪。兩者合用起到疏風(fēng)止痛之功。梔子苦寒，能瀉三焦之火；黃芩苦寒，清熱燥濕、瀉火解毒；生地黃清熱生津。三者同用，瀉熱生津除煩。川芎能活血行氣，通絡(luò)止痛，為治療偏頭痛要藥；當(dāng)歸活血行血；延胡索活血、行氣、止痛。三者相互使用，能活血行血止痛。全方共用起到平肝止痛、行氣活血、疏風(fēng)清熱之功。平肝止痛顆粒從肝出發(fā)，基于偏頭痛“肝陽上亢”病機，治療上以“平肝潛陽”之法，針對肝陽上亢證型用藥，通過臨床檢驗，取得了良好療效。

本實驗選用硝酸甘油實驗性偏頭痛模型優(yōu)勢在于，動物經(jīng)濟，易于獲得；造模技術(shù)相對簡便，易于成功；造模因素具有唯一性，定量容易；可以在動物活動自如意識清楚的情況下完成行為學(xué)觀察。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為ET是一種具有強烈縮血管作用的血管活性多肽，具有強大的縮血管作用［7］。在偏頭痛發(fā)作時，大量的ET合成、釋放，導(dǎo)致血管舒縮功能失調(diào)，使腦血管痙攣而引發(fā)偏頭痛［8］。偏頭痛患者血漿中ET含量較正常高［9-10］，說明血漿ET水平的升高和持續(xù)異常共同構(gòu)成了偏頭痛的病理生理學(xué)基礎(chǔ)［11］。ET又能刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮源性血管舒張因子和前列環(huán)素，以對抗腦血管的收縮作用［12］。平肝止痛顆粒通過對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用，降低血漿ET的含量，使血管收縮達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。而內(nèi)源性ENK通過μ受體、δ受體參與構(gòu)成內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛功能［13］。中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）內(nèi)PENK在催產(chǎn)素增強電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮重要作用［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)［15］，大鼠延髓背角PENK可能通過抑制含鈣結(jié)合蛋白的傷害性感受神經(jīng)元來調(diào)節(jié)面部傷害性信息的傳遞。平肝止痛顆粒中的川芎能夠促進血小板解聚，抑制血小板釋放，改善血液循環(huán)而治療偏頭痛，另外，川芎還有鎮(zhèn)靜解痙作用［16］。總之，平肝止痛顆粒能夠明顯降低偏頭痛患者血漿ET、PENK水平，治療偏頭痛療效確切。

本研究通過測量平肝止痛顆粒對肝陽上亢型偏頭痛血漿中ET、PENK的影響，以血管源學(xué)說為基礎(chǔ)，從分子水平驗證平肝止痛顆粒平肝潛陽、通絡(luò)止痛的作用。實驗結(jié)果顯示，模型組中的ET、PENK含量明顯高于正常對照組。平肝止痛顆粒高、中劑量組均能明顯減少ET含量，與模型組比較差異顯著。頭痛寧和平肝止痛顆粒中劑量組可以減少PENK含量，與模型組比較有明顯差異。因此，我們可以得肯定平肝止痛顆粒在治療偏頭痛方面有一定的干預(yù)作用，減少血漿中ET、PENK的含量是其防治偏頭痛發(fā)作的作用機制之一。本實驗為平肝止痛顆粒作為偏頭痛的臨床治療藥物提供了相關(guān)實驗支持。

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Effect of Pinggan Zhitong Granule on ET and PENK Content in Blood Plasma of Migraine Rats with Hy-peractivity of Liver-yang

QIN Rui，JIN Xi. Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Jilin，Changchun 130117，China.

Objective：To observe the analgesic effect of Pinggan Zhitong Granule on ET and PENK content in blood plasma of migraine rats with hyperactivity of liver-yang and discuss the mechanism of its effect on migraine. Methods：Migraine rats with hyperactivity of liver-yang models were set up with Radix Aconiti Lateralis Preparata and nitroglycerin method.ET and PENK content in rats'blood plasma was detected by ELISA.Results：Compared with blank group and model group，Pinggan Zhitong Granule high dose and medium dose group could reduce ET content obviously and there was significant difference with the model group.Toutongning and Pinggan Zhitong Granule medium dose group could reduce PENK content and the result showed significant difference compared with the model group.Conclusion：Pinggan Zhitong Granule can effectively alleviate liver-yang hyperactivity migraine.Its mechanism may be related to its down-regulating effect on the ET and PENK content in blood plasma.

Pinggan Zhitong Granule；Migraine；ET；PENK；Analgesia

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0786-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.010

2017-02-08）

吉林省科學(xué)技術(shù)廳重點科技攻關(guān)項目（20150204046YY）

△通信作者（電子郵箱：1521957360@qq.com）