射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠模型氣道炎癥及血清IL-6、IL-10水平的影響*

隋博文李明虎翟平平李明爽王 浩王 達(dá)李 成

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150040）

·研究報(bào)告·

射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠模型氣道炎癥及血清IL-6、IL-10水平的影響*

隋博文1李明虎2翟平平2李明爽2王 浩2王 達(dá)2李 成3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150040）

目的 觀察射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠模型氣道炎癥及血清白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素10（IL-10）水平的影響。方法 健康雄性SD小鼠60只，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、射干麻黃湯高、中、低劑量組，每組10只。采用卵清白蛋白（OVA）腹腔注射致敏及氣道霧化激發(fā)構(gòu)建小鼠哮喘模型，每組給予相對(duì)應(yīng)的處置。末次干預(yù)24 h后，采集腹主動(dòng)脈血、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、右肺下葉組織標(biāo)本，分別運(yùn)用ELISA法測(cè)定血清IL-6、IL-10的含量；光鏡觀察肺組織病理變化；HE染色對(duì)BALF中的細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)。結(jié)果 1）射干麻黃湯高、中、低劑量組與哮喘模型組相比：IL-10水平升高（P＜0.05）、IL-6水平下降（P＜0.05）。與地塞米松組變化趨勢(shì)相近。2）射干麻黃湯能明顯減輕BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞含量，減輕程度與地塞米松組相似。3）肺組織病理學(xué)變化哮喘模型組較空白對(duì)照組顯著改變，治療組較空白對(duì)照組呈不同程度改變、與哮喘模型組相比有一定差異。結(jié)論 射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠的氣道炎癥具有一定的拮抗作用，其機(jī)制可能與降低血清IL-6、升高IL-10水平相關(guān)。

支氣管哮喘 射干麻黃湯 氣道炎癥 IL-6 IL-10

支氣管哮喘是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與調(diào)節(jié)支氣管黏膜的慢性呼吸道疾病，以氣道炎性改變?yōu)楸举|(zhì)［1］，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。炎癥細(xì)胞及其炎性因子相互構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)性改變是哮喘研究的重要領(lǐng)域。相關(guān)研究表明，白細(xì)胞介素6（IL-6）及白細(xì)胞介素10（IL-10）與支氣管哮喘的發(fā)生密切相關(guān)［2］。射干麻黃湯是中醫(yī)學(xué)治療支氣管哮喘（寒哮證）的代表方劑之一，能有效緩解患者的臨床癥狀［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察射干麻黃湯對(duì)哮喘模型小鼠肺組織的病理學(xué)改變、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細(xì)胞的分類及計(jì)數(shù)水平變化、IL-6及IL-10的含量變化，初步探討其炎癥細(xì)胞及炎性因子的網(wǎng)絡(luò)性改變，揭示射干麻黃湯治療哮喘的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD小鼠60只，雄性，體質(zhì)量20～24 g，合格證號(hào)SCXK（黑）2013-005，購(gòu)自于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，室溫20.3～22.5℃，濕度40%～50%，飼喂鼠糧，自由飲用清潔自來水。

1.2 試藥與儀器 卵清白蛋白 （OVA）（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)）、地塞米松注射液（1 mL∶5 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20133353，天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）、射干麻黃湯藥物 （黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院天江藥局）。小鼠IL-6 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒（上海喬羽生物有限公司）；BSW-2A型超聲霧化吸入器（鞍山貝爾思科技科技有限公司）；H-2050R型超速冷凍離心機(jī) （湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS U-LBD-2，日本制造）。中藥制備：射干麻黃湯藥物組成為射干6 g，麻黃9 g，款冬花6 g，細(xì)辛3 g，紫菀6 g，五味子3 g，半夏9 g，生姜9 g，大棗3枚，使用中藥配方顆粒（江陰天江藥業(yè)），然后根據(jù)體表等效計(jì)量換算法進(jìn)行換算［4］，將天江制劑溶解于蒸餾水，配置成18.720 g/mL、7.488 g/mL、3.744 g/mL的混懸液，即射干麻黃湯高、中、低劑量溶液，存儲(chǔ)于4℃條件下，備用。

1.3 分組與造模 60只SD小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按數(shù)字表隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、射干麻黃湯高、中、低劑量組，每組10只。采用OVA腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)構(gòu)造哮喘模型。除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠均在第1、8日對(duì)小鼠行2 mL的OVA懸液 （包含100.00 mg的卵蛋白、100.00 mg的氫氧化鋁充分溶解）腹腔注射而使小鼠致敏。從第15日開始，采用超聲霧化器霧化1%OVA懸液對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)，每天霧化1次，每次0.5 h，直到小鼠出現(xiàn)神態(tài)異常、呼吸頻率加快、腹肌抽搐、以足擾鼻等動(dòng)作，連續(xù)霧化21 d?？瞻讓?duì)照組：按哮喘模型組方法及步驟，使用等量的生理鹽水代替OVA懸液行小鼠腹腔注射和霧化吸入。地塞米松組：于第15日霧化激發(fā)小鼠前30 min，開始每日灌服地塞米松，劑量為1 mg/kg。各射干麻黃湯組，于第15日霧化激發(fā)小鼠前30 min，開始給予灌服射干麻黃湯，高劑量組藥物劑量為18.720 mg/kg、中劑量組藥物劑量為7.488 mg/kg、低劑量組藥物劑量為3.744 mg/kg?？瞻讓?duì)照組和哮喘模型組從第15日霧化激發(fā)小鼠前30 min，用等體積的生理鹽水灌服。所有小鼠每日灌服2次，連續(xù)給藥21 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組小鼠在最后1次灌胃給藥24 h后，在小鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（0.35 mL/kg）進(jìn)行麻醉，行無菌開胸手術(shù)，術(shù)中盡可能避開小鼠主要血管及內(nèi)臟組織。用22 G靜脈穿刺針的套針部分行小鼠氣管插管，醫(yī)用絲線結(jié)扎小鼠右肺門根部，緩慢注射3 mL生理鹽水進(jìn)入肺腔，輕力按摩胸部1 min，以充分灌洗，緩慢回抽，收集BALF，放置于離心管中備用，如此反復(fù)操作5次。采取右肺下葉組織，并且選用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行組織固定。用注射器從腹主動(dòng)脈血管內(nèi)采集3 mL血液，并收集新鮮血液于離心管中，同時(shí)加入肝素鈉抗血液凝集，靜置2 h后，3500 r/min，離心5 min，提取血清保存在-80℃條件的冰箱中。1）肺組織病理學(xué)觀察：4%多聚甲醛溶液固定肺組織24 h后，梯度脫水，石蠟包埋48 h，5 μm厚度切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理改變。2）BALF中炎癥細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)測(cè)定：將少量的充分搖勻的BALF滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總含量，統(tǒng)計(jì)后將BALF進(jìn)行離心操作，2500 r/min離心15 min，并將沉渣制備成細(xì)胞涂片，采用HE染色法染色，鏡下統(tǒng)計(jì)200個(gè)細(xì)胞并分類計(jì)數(shù)。3）血清IL-6和IL-10含量水平測(cè)定：采用ELISA法測(cè)定其含量水平。具體操作方法及步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett T3法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠行為學(xué)改變及死亡情況 各組小鼠激發(fā)前精神狀況良好，無異常行為學(xué)表現(xiàn)。給藥并激發(fā)后，空白對(duì)造組小鼠較給藥激發(fā)前無明顯變化。哮喘模型組精神亢奮、呼吸深快、腹肌抽搐、以足擾鼻等異常動(dòng)作。與哮喘模型組相比，治療組小鼠哮喘行為呈現(xiàn)不同程度減輕，以地塞米松組與空白對(duì)照組行為表現(xiàn)差異最小，哮喘模型組與空白對(duì)照組行為表現(xiàn)差距最大。本次實(shí)驗(yàn)過程中哮喘組模型組小鼠死亡2只，射干麻黃湯低劑量組小鼠死亡1只，地塞米松組小鼠死亡1只，其余存活。

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)的影響 見圖1。空白對(duì)照組鏡下顯示氣道結(jié)構(gòu)完整，纖毛分布均勻，黏膜及平滑肌未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔無滲出物，肺組織未見病理性改變。哮喘模型組氣道壁出現(xiàn)褶皺，管腔變窄，杯狀細(xì)胞增多，黏液增加，纖毛部分脫落，黏膜下出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，周圍組織水腫，肺泡內(nèi)出現(xiàn)炎性滲出物。治療組較哮喘模型組肺組織病理改變呈現(xiàn)出不同程度減輕，其中射干麻黃湯低劑量組肺組織破壞重，地塞米松組最輕。

圖1 各組小鼠肺組織比較 （HE染色，400倍）

2.3 各組BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 見表1。哮喘模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞含量水平明顯較空白對(duì)照組高（P＜0.05），以嗜酸性粒細(xì)胞組最為顯著。射干麻黃湯高、中、低劑量組和地塞米松組中細(xì)胞總數(shù)及各類炎癥細(xì)胞數(shù)量水平較哮喘模型組顯著減少 （P＜0.05），4組治療組間數(shù)據(jù)兩兩對(duì)比，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×109/L，±s）

表1 各組BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×109/L，±s）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與哮喘模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n空白對(duì)照組 10哮喘模型組 8射干麻黃湯高劑量組 10細(xì)胞總數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞11.80±2.14 1.90±0.73 5.00±1.24 2.60±1.07 29.50±5.87*4.87±1.24*15.50±4.14*9.12±2.29*20.0±3.26△3.20±1.13△9.20±2.54 5.20±1.68△射干麻黃湯中劑量組 10 20.50±3.83△3.40±1.26△9.30±2.54△5.70±1.70△射干麻黃湯低劑量組 9 20.66±4.12△3.44±1.01△9.33±1.73△6.00±1.41△地塞米松組 9 17.44±3.04△2.55±1.33△7.33±1.00△4.44±1.13△

2.4 各組血清IL-6、IL-10和IL-6/IL-10水平比較見表2。哮喘模型組與空白對(duì)照組相比較，哮喘模型組小鼠血清IL-6含量上升 （P＜0.05），IL-10含量下降（P＜0.05），IL-6/IL-10比值升高（P＜0.05），其中以IL-6含量上升趨勢(shì)最明顯。地塞米松組和射干麻黃湯高、中、低劑量組與哮喘模型組相比較，IL-6水平降低（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05），IL-6/IL-10比值下降。治療組組間相互比較，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平和IL-6/IL-10比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平和IL-6/IL-10比較（pg/mL，±s）

組別 n空白對(duì)照組 10哮喘模型組 8射干麻黃湯高劑量組 10 IL-6 IL-10 IL-6/IL-10 8.59±2.25*11.44±1.62*0.76±0.24*13.59±2.25△8.40±1.83△1.70±0.56△10.59±2.25△11.36±1.66△0.95±0.25△射干麻黃湯中劑量組 10 11.09±1.80△10.82±2.20△1.08±0.35△射干麻黃湯低劑量組 9 11.59±1.61△10.62±1.99△1.12±0.27△地塞米松組 9 9.99±2.24△11.96±2.36△0.86±0.25△

3 討 論

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎性病理改變?yōu)樘卣鞯亩喟l(fā)性呼吸系統(tǒng)疾病。其慢性氣道炎性病理改變與多種免疫細(xì)胞異常分化、激活以及細(xì)胞因子水平紊亂有關(guān)［5］。相關(guān)研究表明，除外輔助性T細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞異?；罨瘜?dǎo)致的Th1/Th2免疫失衡是支氣管哮喘發(fā)生的機(jī)制之一，最新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）/輔助性T細(xì)胞17（Th17）亦是哮喘的重要免疫學(xué)基礎(chǔ)［6-7］。

Th17細(xì)胞是通過特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ROR-yt調(diào)控以高水平分泌IL-17的一類不同于Th1、Th2的CD4+輔助性細(xì)胞亞群［8］。IL-6是Th17細(xì)胞通過分泌IL-17炎癥介質(zhì)來誘導(dǎo)產(chǎn)生的重要炎性細(xì)胞因子［9］。相關(guān)研究表明：在炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答過程中，IL-6作為重要炎癥介質(zhì)，對(duì)急性蛋白及IgE生成有促進(jìn)作用［10］。T細(xì)胞是通過Marker Foxp3調(diào)控的一類功能性淋巴細(xì)胞群，是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，可防止自身免疫性疾?。?］。IL-10是Treg細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞因子。相關(guān)研究表明：在哮喘反應(yīng)中，IL-10對(duì)炎性反應(yīng)和自身免疫應(yīng)答起抑制作用［10-11］。

支氣管哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“哮病”的產(chǎn)生機(jī)制是內(nèi)有痰飲伏肺、外有邪氣入侵導(dǎo)致痰氣交阻，以致肺氣機(jī)紊亂，失于宣降而出現(xiàn)發(fā)作性痰鳴氣喘癥狀，臨床上尤以冷哮證居多。其以反復(fù)發(fā)作性喘息、呼吸困難、胸悶，伴咳嗽及痰鳴為主要臨床表現(xiàn)。射干麻黃湯是中醫(yī)學(xué)臨床上治療冷哮證的名方之一，通過外散表寒、內(nèi)化痰飲而發(fā)揮平喘作用。方中射干開結(jié)消痰，配伍麻黃，能宣肺利咽、降逆平喘；紫菀、款冬花、半夏溫肺化痰、降逆化飲；細(xì)辛溫逐飲邪，配伍生姜，辛溫發(fā)散，又加五味子固斂上逆之氣，鎮(zhèn)咳平喘；大棗益脾養(yǎng)胃。諸藥相配，具溫肺、利氣、開痰的作用，共奏溫肺散寒、化痰平喘之功。相關(guān)資料表明［11-12］：射干麻黃湯能有效減輕哮喘的氣道炎性病理改變。西醫(yī)藥理學(xué)研究證實(shí)，其主要是通過降低炎癥細(xì)胞數(shù)目［13-14］、加速氣管內(nèi)纖毛運(yùn)動(dòng)、降低痰液黏稠度來發(fā)揮祛痰、平喘、抗炎的功效［15-16］，進(jìn)而減輕哮喘患者上述臨床癥狀，改善肺功能。

通過本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組BLAF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞含量明顯上升，同時(shí)鏡下肺組織黏膜及平滑肌出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，給予射干麻黃湯與地塞米松干預(yù)后，無論BLAF及肺組織中炎性細(xì)胞均出現(xiàn)明顯減少，且與射干麻黃湯的劑量呈正相關(guān)，表明射干麻黃湯能有效減輕氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)組織。對(duì)腹主動(dòng)脈血中IL-6、IL-10的含量測(cè)定、比較中發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)哮喘小鼠后，IL-10水平上升（P＜0.05）、IL-6水平下降（P＜0.05）、IL-6/IL-10比值減少。表明射干麻黃湯能抑制Th17細(xì)胞生成，促進(jìn)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致Treg/Th17的平衡受到破壞。

本實(shí)驗(yàn)觀察到射干麻黃湯對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及IL-6、IL-10的水平影響，表明射干麻黃湯可能是通過抑制IL-6表達(dá)、加強(qiáng)IL-10表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Treg/ Th17的失衡，來減輕哮喘小鼠氣道慢性炎癥，但其復(fù)雜的炎癥細(xì)胞與炎性因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)性改變，有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of Shegan Mahuang Decoction on Asthma Mouse Model of Airway Inflammation and Serum IL-6and IL-10 Levels

SUI Bowen，LI Minghu，ZHAI Pingping，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective：To observe the effect of Shegan Mahuang Decoction on asthma mouse model of airway inflammation and serum IL-6 and IL-10 levels.Methods：60 healthy male SD mice were randomly divided into 6 groups：control group，asthma model group，Shegan Mahuang Decoction high，medium and low dose group and dexamethasone group with10 mice in each group.Mice models of asthma were established by intraperitoneal injection of OVA and airway atomization.Each group was given corresponding treatment.In 24 h after the last intervention，abdominal aortic blood，bronchoalveolar lavage fluid（BALF），right lower lobe tissue specimens were collected；the serum levels of interleukin（IL-6）and interleukin（IL-10）were measured by ELISA method.The pathological changes of lung tissue were observed by light microscopy，and the HE staining was used to classify and count the cells in BALF.Results：1）Compared with asthma model group，IL-10 level increased（P＜0.05），IL-6 decreased（P＜0.05）in Shegan Mahuang Decoction high，medium and low dose group.The trend of change was similar to that of dexamethasone group.2）Shegan Mahuang Decoction could significantly reduce eosinophils，neutrophils，lymphocytes content in BALF，but not as effective as dexamethasone.3）The pathological changes of lung tissue in model group was significantly more obvious than that in normal group，and the treatment groups were significantly different than the normal group，and there was a certain difference compared with the model group.Conclusion：Shegan Mahuang Decoction has certain antagonism on airway inflammation in asthmatic mice. Its mechanism may be related to the decrease of serum IL-6 and increase IL-10 level.

Bronchial asthma；Shegan Mahuang Decoction；Airway inflammation；IL-6；IL-10

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0783-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.009

2017-02-06）

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H201317）