中藥腎毒寧顆粒對慢性腎衰大鼠腎保護作用及其機制的實驗研究*

熊榮兵張 婷何立群傅曉駿△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 金華 321017；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

·研究報告·

中藥腎毒寧顆粒對慢性腎衰大鼠腎保護作用及其機制的實驗研究*

熊榮兵1張 婷1何立群2傅曉駿1△

（1.浙江中醫(yī)藥大學附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 金華 321017；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

目的 觀察腎毒寧方對5/6腎切除大鼠的腎保護的作用。方法 將120只SD大鼠，隨機分為假手術組20只和手術組100只，手術組行5/6腎切除術。術后2周，手術組隨機分為模型組、腎毒寧低、中、高劑量組及西藥科素亞陽性對照組，各組18只。各組于術后2周分別給予生理鹽水、科素亞及相應劑量的腎毒寧顆粒灌胃。處死大鼠前留取大鼠尿標本。治療12周后處死大鼠，腹主動脈采血，取腎組織應用免疫組化方法檢測腎組織Ⅲ型膠原蛋白（C-Ⅲ）及纖維粘連蛋白（FN）表達，采用化學比色方法檢測大鼠腎組織的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），并測定大鼠的血肌酐、血尿素氮變化情況，采用ELISA方法測定大鼠腎組織的MCP-1水平。結(jié)果 與假手術組比較，模型組血肌酐、血尿素氮均顯著增加，SOD顯著下降，MDA顯著上升，C-Ⅲ及FN表達明顯（P＜0.01）；與模型組比較各治療組腎功能顯著改善，血肌酐、血尿素氮均顯著下調(diào)，C-Ⅲ及FN表達減少（P＜0.05），且呈劑量依賴關系；高劑量組與科素亞組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 腎毒寧能改善腎臟功能，抗腎纖維化，延緩腎臟病進展，其機理可能與通過抗氧化作用，下調(diào)腎臟C-Ⅲ及FN表達相關。

腎毒寧顆粒 腎纖維化 抗氧化 HO-1 MCP-1 纖維粘連蛋白

慢性腎功能衰竭（CRF）是各種慢性腎臟病患者進行性出現(xiàn)的腎小球濾過率進行性降低以及與此相關的代謝紊亂導致的一系列癥狀臨床綜合征性腎臟病。近年來，其患病率以及發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的增長趨勢［1］。慢性腎臟病在人類死亡的主要原因中占仍然居于第5位至9位之間。因此，CRF仍然是人類生存的重要威脅之一。然而目前除了血液透析等腎替代治療外無有效的治療方法。而中醫(yī)藥在治療腎衰竭方面有很大的優(yōu)勢。腎毒寧方根據(jù)慢性腎臟病“久病多瘀，久病多虛”的思想而組方，本方由丹參、桃仁等藥物組成，具有活血化瘀、益氣溫陽補腎作用［2］。該藥用于臨床治療慢性腎臟病多年，并有大量臨床實驗證明，具有很好降低患者蛋白尿，延緩腎功能不全進展作用［3］。本實驗在此基礎上采用5/6腎切除方法制作大鼠腎衰模型，觀察不同劑量的腎毒寧方對慢性腎衰大鼠的實驗影響，使用免疫組化方法檢測該藥對腎臟3型膠原蛋白 （C-Ⅲ）及纖維粘連蛋白（FN）表達影響，使用化學比色方法檢測該藥對腎臟超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）影響，并采用ELISA方法測定大鼠腎組織的單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達水平，進而闡明中藥腎毒寧方保護腎功能的作用及機理。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠120只，體質(zhì)量（140±20）g，動物許可證號：SYSK（滬）-2009-0069。

1.2 藥物及試劑 腎毒寧顆粒（主要成分：黃芪30 g，淫羊藿30 g，沉香粉2 g，丹參15 g，制大黃15 g，桃仁10 g，黃精20 g）為廣東一方制藥有限公司提供的中藥免煎顆粒。高劑量為人鼠計量20倍換算，低劑量為人鼠計量5倍換算，中劑量為鼠計量10倍換算?？扑貋啠汉贾菽硸|制藥有限公司生產(chǎn)。兔抗大鼠C-Ⅲ、FN單克隆一抗購于美國abcam公司，山羊抗兔二抗由上海威奧生物公司提供。尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、SOD、MDA試劑均購自南京建成生物工程研究所。MCP-1 Elisa試劑盒購置abcam公司。

1.3 造模與分組 SD大鼠在上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心二樓適應性飼養(yǎng)1周后，隨機取20只為正常對照組，其余為手術組。以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，備皮，用碘酒、75%酒精消毒手術區(qū)后鋪巾，距左脊肋骨1.5cm處斜向外方切口，經(jīng)后腹膜取腎，暴露腎臟，分離腎周脂肪后，弧型切除2/3腎組織（主要切除皮質(zhì)部分），用明膠海綿壓迫止血片刻，再滴加數(shù)滴纖維蛋白原和凝血酶溶液，稍等片刻，當切面上不再有活動性出血后復位剩余左腎，縫合；1周后再次手術切除整個右腎。正常SD大鼠20只，僅作背部切口，分兩次剝離左右腎包膜，保留腎臟及腎上腺，作為假手術組。2周后，大鼠隨機分組。剔除造模手術死亡的大鼠12只，每組18只，共6組。隨機分為假手術組18只，模型組18只，腎毒寧顆粒低劑量組18只，腎毒寧中劑量組18只、腎毒寧高劑量組18只，西藥組18只。

1.4 給藥方法 假手術對照組、模型對照組分別予以2 mL的蒸餾水灌胃，腎毒寧顆粒方組中藥每日灌胃，高劑量為人鼠計量20倍換算，低劑量為人鼠計量5倍換算，中劑量為鼠計量10倍換算。西藥組予科素亞每日灌胃，大鼠用量按照人鼠計量10倍劑量換算為＝100× 6/70＝8.6 mg/（kg·d），共60 d。灌胃容積控制在2 mL以下。正常組和模型組同體積生理鹽水灌胃。灌胃2個月。實驗期間各組大鼠自由攝食、飲水。

1.5 標本采集及檢測 1）腎功能及SOD和MDA的檢測。治療結(jié)束后各組大鼠首先分別置代謝籠內(nèi)留取24 h尿液，-70℃保存；末次給藥后禁食12 h，腹主動脈采血，分離血清后待測-70℃保存，并取腎皮質(zhì)加0.9%氯化鈉注射液制成勻漿，取上清液備測。觀察指標：BUN、Scr、SOD、MDA。檢測方法：全自動生化分析儀測定血BUN、血Scr水平；化學比色法測定腎皮質(zhì)SOD和MDA水平。2）腎臟組織中C-Ⅲ、FN的表達。實驗結(jié)束后處死大鼠，無菌操作取腎，去掉包膜，矢狀線正中切開，1/2腎臟用10%甲醛溶液固定，取小塊皮質(zhì)，進行脫水包埋組織，行石蠟塊4 μm厚連續(xù)切片，用免疫組化方法檢測腎臟組織C-Ⅲ、FN的表達。免疫組織化學檢測：石蠟塊4 μm厚連續(xù)切片，采用SP法，按照C-Ⅲ、FN試劑盒操作程序進行免疫組織化學染色。光鏡下觀察胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性。用ipp6.0圖像分析軟件進行分析。3）腎臟組織中MCP-1的表達。實驗結(jié)束后處死大鼠，無菌操作取腎，去掉包膜，矢狀線正中切開，取出腎組織，取小塊皮質(zhì)，稱取質(zhì)量，加入一定量的PBS，pH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?～8℃的溫度，加入一定量的PBS（pH7.4），用勻漿器將標本勻漿化，離心20 min左右（2000～3000 r/min），收集上清，分裝后待檢測，按照ELISA試劑盒方法進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，采用方差檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 假手術組大鼠體質(zhì)量增加平穩(wěn)，活動機警，皮毛致密、光滑，生長、進食及活動情況正常，各治療組及模型對照組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，反應遲緩，皮毛稀疏，生長緩慢，進食較少。死亡情況：在實驗過程中，共有6只大鼠死亡，其中腎毒寧低劑量組1只，腎毒寧中劑量組1只，腎毒寧高劑量組2只，西藥組2只。2.2 各組大鼠腎功能指標比較 見表1。經(jīng)治療2個月后，模型組大鼠的Scr、BUN顯著高于假手術對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組Scr、BUN明顯下降，有顯著差異（P＜0.05）；與腎毒寧顆粒劑低劑量組比較，腎毒寧高劑量組的Scr、BUN分別明顯下降，有顯著差異（P＜0.05），而腎毒寧高劑量組的Scr、BUN與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠治療2個月后血Scr、血BUN水平比較（±s）

表1 各組大鼠治療2個月后血Scr、血BUN水平比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05；與腎毒寧低劑量組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）假手術組 18 29.47±4.40▲6.86±0.63▲模型對照組 18 91.47±21.02*19.58±3.66*腎毒寧低劑量組 17 61.51±9.89*▲16.38±2.48*▲腎毒寧中劑量組 17 54.01±11.58*▲14.84±2.34*▲腎毒寧高劑量組 16 52.23±9.41*▲△14.47±2.03*▲△西藥組 16 55.42±11.39*▲15.13±2.58*▲

2.3 各組大鼠氧化應激指標SOD、MDA變化情況比較 見表2。經(jīng)治療2個月后，模型對照組大鼠SOD顯著低于假手術組（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組大鼠SOD均呈明顯上升趨勢（P＜0.05）；而腎毒寧高劑量組SOD與腎毒寧低劑量組比較明顯上升，有顯著差異（P＜0.05）；腎毒寧高劑量組SOD與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。經(jīng)治療2月后，模型組大鼠MDA顯高于假手術組（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組大鼠MDA均呈明顯下降趨勢 （P＜0.05），而腎毒寧高劑量組MDA與腎毒寧低劑量組比較明顯下調(diào)（P＜0.05）；腎毒寧高劑量組MDA與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠氧化應激指標SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應激指標SOD、MDA水平比較（±s）

組別 n SOD（U/mL） MDA（nmol/L）假手術組 18 133.97±32.84▲6.70±1.12▲模型對照組 18 76.71±15.76*16.71±2.11*腎毒寧低劑量組 17 101.79±16.77*▲9.82±1.85*▲腎毒寧中劑量組 17 106.96±20.17*▲9.09±1.22*▲腎毒寧高劑量組 16 117.87±22.65*▲△8.50±1.18*▲△西藥組 16 107.85±18.69*▲8.85±1.88*▲

2.4 各組大鼠腎組織中MCP-1水平的比較 見表3。經(jīng)治療2月后，與假手術組相比，模型對照組的MCP-1表達明顯升高（P＜0.01），各治療組的MCP-1表達量也上升（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組MCP-1表達明顯下調(diào)（P＜0.05），且腎毒寧隨劑量的增加，MCP-1表達量下調(diào)更明顯，但高劑量組腎毒寧與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠腎組織中MCP-1水平及FN表達量比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織中MCP-1水平及FN表達量比較（±s）

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2.5 各組大鼠腎組織中腎纖維化指標FN的表達 見表3，圖1。假手術組大鼠呈弱陽性的表達或沒有表達，而與假手術組相比，模型對照組明顯呈強陽性的表達，各治療組也均有表達，但表達弱于模型組，呈下降趨勢。

圖1 各組FN表達比較（免疫組化法，400倍）

3 討 論

腎纖維化是過量細胞外基質(zhì)在腎臟沉積，是所有慢性腎臟疾病進展到終末期腎臟病的共同通路［4］。FN由腎小管上皮細胞分泌，主要表達于腎間質(zhì)，是細胞外基質(zhì)主要成分，其主要作用為其他細胞外基質(zhì)沉積及纖維形成提供支架［3］，因此該實驗從FN在腎臟表達情況來觀察腎毒寧方抗纖維化作用及其相關作用機制。

氧化應激是腎臟疾病進展的重要因素［5-6］。氧自由基和抗氧化能力之間的不平衡存在于慢性腎臟疾病的始終，抗氧化能力減弱以及氧化應激增強在腎臟病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。氧化應激可直接作用于腎組織細胞膜的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜正常生理狀態(tài)，使腎小球毛細血管基底膜磷脂發(fā)生過氧化，導致小球基膜通透性升高，誘導腎小球足細胞凋亡，通過多種細胞因子抑制系膜細胞基質(zhì)降解，加重細胞外基質(zhì)沉積，參與內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化引起小管間質(zhì)纖維化，從而加速CRF的進程。劉曉燕等［7］研究表明慢性腎臟病患者存在嚴重的氧化應激現(xiàn)象，氧化反應增強而抗氧化能力下降，其程度隨著腎功能的減退逐漸加重。氧化應激所產(chǎn)生的氧自由基（ROS）可以誘導炎性細胞浸潤并促進其釋放多種促纖維化因子，因此氧化應激不僅可以直接導致腎臟組織結(jié)構(gòu)的損傷，而且可以加重多種疾病所致的腎臟纖維化。Kobayashi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，腎臟次全切可以導致殘余腎臟小管間質(zhì)纖維化，具體表現(xiàn)為Ⅰ、Ⅳ型膠原積聚。該研究提示疾病狀態(tài)下的腎臟氧化反應明顯增多，同時伴有明顯加重的纖維化，而抑制或清除腎臟的ROS則可能為纖維化的治療提供一種新的途徑。氧化應激參與多種疾病的病理過程，如目前研究發(fā)現(xiàn)多種藥物在治療糖尿病腎病的同時可以通過其抗氧化應激的作用來減少腎間質(zhì)纖維化的程度。Anjaneyulu等［9］發(fā)現(xiàn)地爾硫不僅可以通過阻斷鈣離子通道來減輕糖尿病腎病大鼠腎組織損傷，而且可以減少糖尿病大鼠腎臟的氧化應激，可以通過抗氧化應激來減輕間質(zhì)纖維化程度。SOD可清除氧自由基，阻斷其對機體造成的損害；MDA是ROS與生物膜脂質(zhì)中多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，由脂質(zhì)過氧化物分解而成。多數(shù)實驗均將SOD與MDA聯(lián)合在一起，評價體內(nèi)的氧化應激。本研究發(fā)現(xiàn)5/6腎切除慢性腎衰大鼠腎組織MDA含量升高、SOD活性降低，提示腎組織存在氧化與抗氧化體系的失衡。

而MCP－1是典型的信號肽，主要功能是趨化和激活單核細胞至炎癥部位，對單核細胞的趨化作用在CC亞族趨化因子中占絕對優(yōu)勢。MCP-1過度表達的情況下會導致大量巨噬細胞的趨化和激活，促進多種活性物生成。如IL-6、ICAM、AP-1、NF-κB等［10］。MCP-1作為CC趨化家族最重要的成員之一，一方面通過趨化和激活單核巨噬細胞至腎小球及腎小管區(qū)域參與內(nèi)皮細胞的損傷和沉積，另一方面通過自分泌或旁分泌的形式直接刺激腎臟細胞表達IL-1、TGF-1、а-SMA等細胞因子，加重腎血管損傷和基質(zhì)纖維化，最終引起終末期腎衰。

本病屬于中醫(yī)學“水腫”“癃閉”“虛勞”“關格”等范疇。中醫(yī)認為各種腎病日久，損及各臟腑功能，并以脾腎虛損為主，病情逐步發(fā)展而使病情加重，最后導致正氣虛衰、濁邪、瘀血雍滯腎絡，導致腎臟失去開闔的功能，濁瘀尿毒潴留于體內(nèi)，而引發(fā)本病。因而中醫(yī)益氣活血化瘀方法治療慢性腎衰就顯得尤為重要。

中藥腎毒寧顆粒由黃芪、淫羊藿、沉香粉、丹參、制大黃、桃仁、黃精組成，方中黃芪性溫，有益氣、升陽、補虛、消腫的功效，通過抗氧化、清除自由基、促進細胞代謝、利尿消腫、減少尿白蛋白排泄、促肝臟合成白蛋白、降脂、調(diào)節(jié)免疫、降血壓等作用，保護腎臟細胞免受傷害，保護殘存腎單位，延緩腎臟疾病進展的作用［11］。而筆者前期實驗研究也表明，黃芪還可在腎臟局部通過減輕炎癥細胞浸潤、減少抗纖維化細胞因子表達來減輕腎小球硬化和間質(zhì)纖維化［12］。淫羊藿性溫，有溫腎、助陽、填補精氣作用［13］。沉香性溫味辛，有行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘作用，沉香揮發(fā)油能通過增強細胞內(nèi)抗氧化酶活力，保護細胞對抗氧化損傷，減少細胞內(nèi)活性氧水平，顯著增強細胞內(nèi)抗氧化酶SOD活力，減少MDA生成，具有一定抗氧化作用。丹參微寒，有益氣補血活血之功效。大量研究顯示丹參單體具抗纖維化作用，延緩慢性腎衰竭進展［14］。丹參的脂溶性有效單體丹參酮ⅡA治療后，可使大鼠血清BUN、Cr水平降低、SOD活力明顯升高，MDA含量明顯降低。丹參酮ⅡA可以通過改善大鼠腎組織的氧化應激，減少尿蛋白、改善腎功能和延緩腎臟損害［15］。大黃性寒有清熱泄?jié)?、活血通便作用。桃仁性平而活血祛瘀，能提高腎臟血流量，改善微循環(huán)和提高組織膠原酶活性，從而促進腎內(nèi)的膠原分解、代謝，減少腎內(nèi)膠原的含量，改善腎纖維化［16］。黃精性平而益腎補精。全方共奏益氣溫陽，活血化瘀通絡之功效。

本實驗研究結(jié)果再次證實，經(jīng)治療2月后，與模型組比較，腎毒寧顆粒低、中、高劑量組均明顯降低了大鼠的血清Scr、BUN，說明腎毒寧顆粒劑具有一定的改善腎功能療效作用，有一定的腎臟保護作用。同時我們實驗觀察發(fā)現(xiàn)，隨著腎毒寧劑量的增加，其保護腎功能療效更優(yōu)，說明腎毒寧顆粒保護腎功能作用與其劑量呈現(xiàn)一定的相關性。同時實驗也觀察到，腎毒寧顆粒劑可明顯提高SOD含量，降低CRF大鼠體內(nèi)的MDA，具有明顯的抗氧化作用。腎毒寧顆粒劑降低腎臟的毒性物質(zhì)從而阻止部分氧自由基的產(chǎn)生，增加機體中的SOD的活性從而提高機體清除氧自由基的能力，減輕自由基對腎小球的損傷。腎毒寧顆粒劑具有益氣溫陽、活血化瘀之效，藥理及各項實驗研究亦證實，方中諸味藥均有抗氧化，保護腎功能作用。而我們實驗也再次觀察到，經(jīng)治療2月后，模型組及各治療組均存在一定的FN表達，進一步證實了慢性腎衰大鼠存在腎纖維化，與文獻報道相一致，也間接說明了我們造模成功。而與模型組比較，腎毒寧低、中、高劑量組的FN表達均明顯下調(diào)，且隨著腎毒寧劑量的增加，其腎組織的FN下調(diào)更明顯，再次說明了腎毒寧保護腎功能作用與其劑量呈一定的相關性。而經(jīng)治療2月后，與正常對照組比較，模型組及各治療組大鼠腎組織MCP-1表達明顯上升，進一步證實了慢性腎衰大鼠存在炎癥狀態(tài)。而與模型組比較，各治療組大鼠腎組織MCP-1表達均下調(diào)，且隨著腎毒寧劑量的增加，其腎組織的MCP-1下調(diào)更明顯，證實了腎毒寧具有一定的抗炎作用，且腎毒寧抗炎作用與其劑量呈一定的相關性。

綜上所述，我們認為，腎毒寧顆粒劑具有一定的腎保護作用，其機制可能與其通過抗氧化應激，釋放炎癥因子，從而抑制腎纖維化有一定的關系，其腎保護作用與劑量呈依賴性。這其中，中醫(yī)益氣溫陽、活血化瘀通絡法起著重要作用。但具體通過那個信號途徑、通路干預作用仍需進一步研究。

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Experimental Study on the Protective Effect of Shenduning Granule on Renal Failure Model Rats and itsMechanism

XIONG Rongbing，ZHANG Ting，HE Liqun，et al. Jinhua City Hospital of Traditional ChineseMedicine，Zhejiang，Jinhua 321017，China.

Objective：To investigate the protective effect and mechanism of Shenduning Granule on 5/6 nephrectomy model of chronic renal failure rats.Methods：120 SD rats were randomly divided into sham operation group with 20 rats and operation group with 100 rats.The operation group underwent 5/6 nephrectomy.2 weeks after surgery，surgery group were randomly divided into model group，Shenduning Granule low，medium and high dose group and Western medicine losartan positive control group，20 rats in each group.The groups were respectively given saline，losartan and corresponding dose of Shenduning Granule orally in 2 weeks after surgery.All the rats'urine was collected before execution.After 12 weeks of treatment，the rats were killed and blood samples were collected from abdominal aorta.The renal tissues were taken，typeⅢcollagen（C-Ⅲ）and smooth muscle fibronectin（FN）expression in renal tissues was examined by immunohistochemistry.Serum superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），serum creatinine，blood urea nitrogen changes in rats were detected by chemical colorimetric method.MCP-1 level in renal tissues was measured by ELISA method.Results：Compared with the sham operation group，serum creatinine，blood urea nitrogen in the model group increased significantly，SOD decreased significantly，MDA increased significantly，C-Ⅲand FN expression level was significant（P＜0.01）.Compared with the model group，the renal function significantly improved；serum creatinine，blood urea nitrogen were significantly reduced；C-Ⅲand FN expression level was down-regulated（P＜0.05）in a dose-dependent manner in all the treatment groups.There was no significant difference between high dose group and the losartan group（P＞0.05）.Conclusion：Shenduning Granule can improve renal function，ameliorate renal fibrosis and delay the progression of kidney disease.The mechanism may be related to the down-regulation of renal C-Ⅲand FN ex-pression through the antioxidant effect.

Shenduning Granule；Renal fibrosis；Antioxidant；HO-1；MCP-1；Fibronectin

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0775-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.007

浙江省自然科學基金面上項目（LY15H270001）

△通信作者（電子郵箱：xrb198510@163.com）