磁性石墨烯固相萃取—高分辨質(zhì)譜法快速測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留

崔曉娜++葛愛民++李汝春++董彥莉

摘要：采用高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了動(dòng)物源性食品中13種磺胺類藥物殘留的磁性石墨烯固相萃取-高分辨質(zhì)譜分析方法。樣品采用0.1%的甲酸/乙腈提取，目標(biāo)物通過(guò)磁性石墨烯粉吸附，除去雜質(zhì)，然后再解析目標(biāo)物的方法獲得干凈的樣品基質(zhì)。經(jīng)Waters UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱分離，液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，13種目標(biāo)物在2.0～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2>0.99）。在動(dòng)物源性食品基質(zhì)中，目標(biāo)化合物在2、5、10 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在77.8%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.1%～10.1%。該方法凈化速度快、效率高，可用于動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留篩查檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：磁性石墨烯固相萃取（MSPE）；高分辨質(zhì)譜法；動(dòng)物源性食品；磺胺

中圖分類號(hào)： TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0151-04

磺胺類藥物為合成的廣譜抗菌劑，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌有效。由于磺胺類藥物在體內(nèi)作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)任何途徑攝入的磺胺都有可能在人體中蓄積，蓄積到一定值的藥物對(duì)人體機(jī)能是有害的[1]。目前，我國(guó)對(duì)磺胺類及其增效劑的使用有比較明確的規(guī)定。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告中規(guī)定，禽肉類產(chǎn)品中磺胺類總量不得超過(guò) 0.1 mg/kg；日本肯定列表中將動(dòng)物源性食品的最低限量定為 0.02 mg/kg；歐盟2377/90/EEC中明確規(guī)定，在所有動(dòng)物源性食品中磺胺類殘留總量不能超過(guò)0.1 mg/kg[2-3]。

磁性石墨烯是由石墨烯化學(xué)制備而成，磁性石墨烯納米粒子因具有很多特殊的磁性質(zhì)，比如超順磁性、高矯頑力、低居里溫度、高磁化率等，并且在磁流體、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、催化、污染物處理等很多方面都已有廣泛的研究和實(shí)際應(yīng)用。所以石墨烯與磁性納米粒子復(fù)合成的磁性石墨烯受到了極大的關(guān)注，并為石墨烯的應(yīng)用研究發(fā)展出了新的方向[4-6]。

目前，磺胺類及其增效劑殘留的測(cè)定方法有高效液相色譜法配合紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器[7]。液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）可以在一次分析中定量和鑒定數(shù)百種目標(biāo)化合物，具有很高的選擇性和靈敏度。但是，這種方法需要采用多種已知化合物優(yōu)化儀器參數(shù)，因此不能用于篩查未知化合物?；贠rbitrap技術(shù)，Exactive 具有極高的質(zhì)量分辨率，從而保證了分析結(jié)果高質(zhì)量準(zhǔn)確度，并可以準(zhǔn)確地區(qū)分復(fù)雜樣品中同時(shí)洗脫出的具有相同質(zhì)量數(shù)的化合物，高達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)線性范圍，可輕松分析受復(fù)雜基體干擾的痕量化合物[8-10]。

本研究建立了動(dòng)物源性食品中13種具有代表性的磺胺類藥物增效劑的快速前處理和高分辨質(zhì)譜法聯(lián)用的測(cè)定方法，該方法快速、準(zhǔn)確，為監(jiān)控動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留提供了技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試劑與材料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺-5-（對(duì)）甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基異[XCZ1.tif]唑、磺胺喹[XCZ1.tif]啉，均購(gòu)自DR.公司，純度均大于99%。

1.1.2試劑與耗材乙腈，甲醇均為色譜純（Fisher）；無(wú)水硫酸鈉，分析純（煙臺(tái)市雙雙化工）；甲酸，色譜純（TEDIA）；水，GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；磁性石墨烯，實(shí)驗(yàn)室制備；硫酸銅，優(yōu)級(jí)純（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）；1-（2-吡咯偶氮）-2-萘酚（PAN），分析純（北京化學(xué)試劑有限公司）；C18粉（天津艾杰爾）。

1.1.3儀器液相色譜儀，Thermo UltiMate3000，靜電場(chǎng)軌道肼質(zhì)譜儀（Thermo EXACTIVE）；分析天平，感量0.1 mg和0.01 g各1臺(tái)；離心機(jī)，5810型（Eppendorf公司）；均質(zhì)器（T25型，IKA公司）；振蕩器（MMV-1000W，ETELA公司）；氮吹儀（N-EVAP）；渦流混勻器（IKA MS basic）。

1.1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺-5-（對(duì)）甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲基異[XCZ1.tif]唑、磺胺喹[XCZ1.tif]啉：用乙腈溶解，按純度標(biāo)示折算配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品提取

準(zhǔn)確稱取2.00（±0.02）g待測(cè)樣品置于100 mL離心管中，加入5 g無(wú)水硫酸鈉，2 g氯化鈉，10 mL 0.1% 甲酸/乙腈，均質(zhì)2 min，10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心試管中，重復(fù)提取殘?jiān)?次，取上清液合并，加入10 mL正己烷，振蕩5 min后靜置，去掉上層正己烷層。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入3 mL乙腈/水溶解，待凈化。

1.2.2樣品凈化

準(zhǔn)確稱取20 mg磁性石墨烯于10 mL離心管中，分別加入2 mL丙酮、甲醇和去離子水，依次清洗磁性石墨烯。取5 mL上清液入離心管中，渦混10 min，靜止萃取5 min。用磁鐵將磁性石墨烯聚集到離心管底部，棄去上清液，將磁性石墨烯轉(zhuǎn)移至另1個(gè)干凈的離心試管中，加入 1 mL 乙腈-氨水（體積比為95 ∶5），渦旋2 min洗脫，重復(fù)洗脫4次，合并洗脫液，氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相定容至1 mL，過(guò) 0.22 μm 濾膜，進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定分析。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水，B：甲醇，梯度洗脫程序：0→2.0 min，由5% B→20% B；2.0→6 min，由20% B→80% B；6.2 min，5% B，平衡3 min。

1.2.4質(zhì)譜條件

全掃描正離子模式（質(zhì)量范圍100～1 500）；分辨率：50 000；自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值：10e6；加熱點(diǎn)噴霧離子源條件：噴霧電壓：2 200 V，離子傳輸管溫度：280 ℃，鞘氣氣壓：32 au，氣化室溫度：200 ℃。13種化合物的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

本研究檢測(cè)的13種磺胺類藥物中磺胺-5-（對(duì)）甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶分子量相同，因此，不同目標(biāo)物的分離要考慮化合物性質(zhì)，在提高分離速度和靈敏度的同時(shí)，達(dá)到最佳的目標(biāo)物分離效果。通過(guò)比較Waters UPLC BEH C18（粒徑1.7 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（粒徑1.8 μm），以及柱長(zhǎng)分別為2.1×100 mm、3.0×100 mm的2種不同規(guī)格的色譜柱，在分離效率和目標(biāo)物響應(yīng)值方面，柱長(zhǎng)為2.1×100 mm Waters UPLC BEH C18更好一些。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

磺胺類藥物在正離子模式下響應(yīng)值較高，通過(guò)在水溶液中加入酸性溶液的方式測(cè)試其響應(yīng)值。分別比較了甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水、乙腈/10 mmol/L乙酸銨、甲醇/10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，在電噴霧源ESI+方式下，在甲醇/0.1%甲酸水溶液組成的流動(dòng)相中，質(zhì)譜的離子化效率較其他流動(dòng)相條件響應(yīng)值高，峰形好，因此本研究選擇甲醇/0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

通過(guò)改變甲醇/0.1%甲酸水不同的起始比例，經(jīng)多次進(jìn)樣分離，結(jié)果表明，在采用梯度洗脫的條件下，起始流動(dòng)相甲醇比例在5%時(shí)，磺胺-5-（對(duì)）甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺-6-（間）甲氧嘧啶能夠得到較好地分離。在本研究的色譜條件下，13種化合物的出峰情況見圖1。

2.2前處理?xiàng)l件的優(yōu)化與比較

2.2.1提取試劑的選擇

磺胺類藥物其結(jié)構(gòu)中均含有多個(gè)胺基團(tuán)，在酸性條件下容易形成正離子，因此，在提取試劑中加入酸性溶液，可以提高提取效率和離子化效果[11]。在提取試劑選擇方面，分別比較了0.1%的甲酸乙腈、0.1%的甲酸甲醇、0.1%的甲酸乙酸乙酯的提取效率，結(jié)果表明，0.1%的甲酸乙腈提取效率較高，同時(shí)加入2 g氯化鈉能夠使乙腈層和水層較好地分離，避免乳化現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.2.2凈化吸附劑的優(yōu)化

QuEChERS（分散固相萃?。┓椒ǖ脑硎峭ㄟ^(guò)吸附粉末的吸附作用而達(dá)到凈化的效果，此種凈化方法主要去除的是極性中小分子雜質(zhì)，而液質(zhì)聯(lián)用殘留分析中主要用到的電噴霧電離源（ESI源）分析的就是極性化合物，因此二者相互結(jié)合，可以發(fā)揮最大的檢測(cè)效率[12-13]。利用質(zhì)譜在全掃描方式下對(duì)ODSC18和MSPE凈化效果進(jìn)行考察，從圖2可以看出，MSPE方法凈化完后一些中極性和分子量較大的雜質(zhì)被除去，綜合比較，在雜質(zhì)凈化方面MSPE要優(yōu)于C18。

2.3磁性石墨烯凈化方法與國(guó)標(biāo)、行標(biāo)的比較

在GB/T 21316—2007中前處理凈化采用的是液液萃取方法，SN/T 3155—2012中肉及肉制品的凈化采用的是過(guò)C18固相萃取柱的方法[14-15]，根據(jù)3種前處理方法，分別添加質(zhì)量濃度為0.01 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在空白樣品當(dāng)中，磺胺類藥物的平均回收率見表2。

2.4方法的線性、精密度、檢測(cè)限和定量限

考察了試驗(yàn)方法及儀器條件的線性及精密度，選取不同的[CM（25]動(dòng)物源性食品，分別添加質(zhì)量濃度為[KG*5]2.0、5.0、10.0 μg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、RSD值見表3。

3結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜，磁性石墨烯凈化技術(shù)，建立了動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析檢測(cè)方法。采用磁性石墨烯固相萃取作為凈化材料，提高了樣品前處理效率，降低了環(huán)境污染，為監(jiān)控動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留提供了有力的技術(shù)支持。

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