木棉褐斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性

秦人全++林江++王洪星++王紅剛++徐羅娜++于旭東

摘要：針對(duì)在海南發(fā)生的一種木棉葉片褐斑病，為明確該病致病病原，采用形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)其致病菌進(jìn)行種類鑒定，并對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果表明，引起木棉葉片褐斑病的致病菌為半知菌亞門多主棒孢霉菌（Corynespora cassiicola）；該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最適溫度為28 ℃、pH值為7～8，光照環(huán)境對(duì)菌絲生長(zhǎng)無明顯影響，以麥芽糖為碳源、硝酸鈉為氮源比較適合該病原菌絲的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：木棉；褐斑??；病原鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S436.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0101-04

木棉Ceiba pentandra（Linn.）Gaertn.屬木棉科高大落葉喬木，原產(chǎn)于熱帶美洲和東印度群島。目前，廣泛引種于東南亞及非洲熱帶地區(qū)[1]，我國(guó)主要分布于廣西、云南、海南、廣東、四川、貴州和福建等地。其樹生長(zhǎng)迅速，加之花、根、皮、木材和種子等經(jīng)過不同工藝加工處理后均可利用，兼具經(jīng)濟(jì)、藥用和觀賞的價(jià)值[2-5]。目前，木棉在生產(chǎn)中不僅是優(yōu)良的林用木材和綠化樹種，而且其蒴果纖維更是優(yōu)良的紡織材料，其纖維與其他天然材料相比，具有不易潮濕、抗壓力強(qiáng)、保暖性好和不蛀不霉變等特性，是一種極具市場(chǎng)前景的新型生態(tài)紡織材料[6]。由于木棉兼具優(yōu)良林用、綠化和紡織等多方面的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來，我國(guó)南方地區(qū)種植面積越來越大，尤其海南在綠化寶島和打造木棉之鄉(xiāng)等相關(guān)項(xiàng)目的支持下，目前，整體種植面積已達(dá)10 000 hm2[7]。關(guān)于木棉研究，主要集中于纖維開發(fā)利用和優(yōu)良品種選育2個(gè)方面，然而隨著木棉種植面積的逐漸增大，必將導(dǎo)致病蟲害大面積發(fā)生，影響其產(chǎn)量和質(zhì)量，而且國(guó)內(nèi)外關(guān)于木棉種植中病蟲害的研究報(bào)道甚少。2014年11月在海南省儋州市木棉育苗基地大面積發(fā)生木棉褐斑病，筆者對(duì)海南多地的木棉分布區(qū)域進(jìn)行采樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害在海南已經(jīng)大面積發(fā)生。為明確木棉褐斑病病原，本試驗(yàn)通過柯赫氏法則分離純化病原菌后，采用形態(tài)學(xué)描述方法對(duì)該致病菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)致病菌進(jìn)行了生物學(xué)特性初步研究，以期為木棉褐斑病的發(fā)生及綜合防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試病樣

試驗(yàn)分離所用病樣均采集于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科教學(xué)實(shí)習(xí)基地中發(fā)病的木棉植株。

1.1.2供試藥品

葡萄糖、谷氨酸、KH2PO4、NaOH、甘露醇、NH4NO3、KNO3、KCl、蔗糖、MgSO4、脲、Ca（NO3）2、NaNO3、鹽酸、Fe2（SO4）3、可溶性淀粉均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；麥芽糖、瓊脂粉、α-乳糖均為生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1木棉褐斑病癥狀描述

通過基地觀察木棉褐斑病的典型癥狀，記錄其發(fā)病特點(diǎn)，并對(duì)典型癥狀進(jìn)行拍照。

1.2.2木棉褐斑病病原分離及致病性測(cè)定

取基地發(fā)病木棉葉片帶回實(shí)驗(yàn)室后，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離[8]。分離時(shí)取病健交界處的葉片組織，接種到PDA培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)5 d，期間取樣進(jìn)行鏡檢。然后挑取較純菌落，進(jìn)行純化處理，并對(duì)純化后的菌落、菌絲體、病原孢子等進(jìn)行形態(tài)描述和顯微拍照。根據(jù)柯赫氏法則操作步驟，采用針刺法接種菌餅的方式對(duì)溫室盆栽苗進(jìn)行致病性測(cè)定[9]，處理時(shí)以接種不帶菌的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，觀察記錄，5 d后對(duì)接種發(fā)病葉片再次進(jìn)行分離病原。

1.2.3木棉褐斑病病原鑒定

將純化病原菌用PDA培養(yǎng)基于25 ℃下培養(yǎng)產(chǎn)孢后，制作臨時(shí)玻片進(jìn)行顯微觀察。根據(jù)菌落特征，菌絲形態(tài)，分生孢子大小、形態(tài)及顏色等相關(guān)特征。查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)后，確定病原菌的分類地位[10-15]。

1.2.4木棉褐斑病病原菌生物學(xué)特性研究

1.2.4.1不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響在生長(zhǎng)良好菌落邊緣，用直徑5 mm打孔器打取菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于5、10、15、20、25、28、30、32、35、40 ℃ 10個(gè)不同溫度中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量個(gè)菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4.2不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響在無菌條件下，用滅菌的0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液，將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8個(gè)梯度。經(jīng)接種病原菌（直徑5 mm）后，置于25 ℃中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4.3不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等量α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、D-甘露糖和可溶性淀粉分別替代Czapek培養(yǎng)基中蔗糖作為碳源，配制不同碳源的培養(yǎng)基。然后接種病原菌（直徑5 mm）于不同碳源的培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4.4不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用等量的NaNO3、Ca（NO3）2、谷氨酸、酵母膏、脲和NH4NO3分別替代Czapek培養(yǎng)基中KNO3作為氮源，配制不同氮源的培養(yǎng)基。然后接種病原菌（直徑5 mm）于不同氮源的培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4.5不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響在PDA培養(yǎng)基上接種純化病原菌（直徑5 mm）后，分別置于全黑暗處理、全光照處理、光暗交替（光—暗周期12 h—12 h）3種光照環(huán)境中25 ℃培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析各重復(fù)處理間的方差值和不同處理間的顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1木棉褐斑病危害癥狀

木棉褐斑病主要危害木棉葉片及莖稈，葉片發(fā)病初期，被侵染葉片首先表現(xiàn)為暗褐色小點(diǎn)（圖1-A），后期病斑逐漸擴(kuò)大為圓形、梨形甚至橢圓形的不規(guī)則病斑，病斑邊緣褐色至暗褐色，中間褐色，病健交界處帶有明顯黃色暈圈（圖1-B）；發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，中央組織壞死變脆或穿孔，或多個(gè)病斑聯(lián)合成塊，中間灰褐色腐爛，濕度大時(shí)，葉片表面出現(xiàn)橘黃色水珠（圖1-C）。莖稈初侵染表現(xiàn)為褐色小點(diǎn)，之后病斑逐漸擴(kuò)大，成橢圓形分布在表面，呈褐色或黑色。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，中央組織變黑，周圍病斑聯(lián)合在一起。

2.2木棉褐斑病病原菌致病性測(cè)定

在木棉發(fā)病葉片上，初次分離共得到炭疽菌（Bacillus spp.）、鏈格孢菌（Alternaria spp.）、彎孢霉菌（Curvularia spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）和2種未知菌等7種病原菌。采用溫室盆栽苗菌餅接種方法，對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果表明，盆栽木棉葉片在接種3 d后，可看見接種部位出現(xiàn)褐色小病斑，并伴有擴(kuò)散趨勢(shì)（圖2-A）。連續(xù)觀察10 d后，接種葉片病斑擴(kuò)大，病健交界處出現(xiàn)明顯黃色暈圈，并伴有葉片掉落現(xiàn)象。而用不帶菌的空白培養(yǎng)基接種后僅出現(xiàn)針刺的機(jī)械損傷，呈現(xiàn)黑色小點(diǎn)，連續(xù)觀察10 d，接種部位無明顯擴(kuò)展（圖2-B）。對(duì)顯癥部位再次進(jìn)行取樣分離，所得到的病原菌與接種病原一致。接種試驗(yàn)表明，分離的病原菌是木棉褐斑病的致病菌。

2.3木棉褐斑病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

通過對(duì)病原菌培養(yǎng)菌落形態(tài)、菌絲體特征、分生孢子梗和分生孢子形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，并查閱相關(guān)病原真菌形態(tài)描述和分類文獻(xiàn)資料，初步確認(rèn)，引起木棉褐斑病的致病菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、棒孢屬（Corynespora）的多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

該病原菌在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈輻射狀向四周平展生長(zhǎng)，菌落舒展，邊緣規(guī)則，絨毛細(xì)發(fā)狀，菌落培養(yǎng)初期顏色較淺，呈灰白色，后期逐漸變?yōu)榛液稚痪z體半透明、具分枝情況，初期無色，后期淡褐色。PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的分生孢子梗直、細(xì)、長(zhǎng)、稍彎或屈膝狀，垂直著生于菌絲頂端，單生或分枝。分生孢子梗產(chǎn)孢處膨大，淺褐色至褐色。分生孢子孔出、單生或頂生，經(jīng)分離培養(yǎng)后變長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)2～3次后形態(tài)穩(wěn)定，基部膨大，頂端鈍圓，中后部分細(xì)長(zhǎng)直或稍彎，多數(shù)呈棍棒狀，平均大小38.92 μm×8.35 μm，光滑成熟分生孢子3～5個(gè)隔膜。

2.4木棉褐斑病病原菌生物學(xué)特性

2.4.1溫度環(huán)境對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響見表1，病原菌菌絲在5～40 ℃不同溫度條件下均可生長(zhǎng)，但低溫和高溫生長(zhǎng)較為緩慢，而最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，連續(xù)培養(yǎng)7 d后，菌落直徑平均值為68.8 mm，菌絲生長(zhǎng)速率為9.8 mm/d。

2.4.2不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響

從表2可以看出，病原菌菌絲在pH值為4.0～11.0范圍內(nèi)的不同酸堿環(huán)境條件下均可生長(zhǎng)，但pH值在5.0～9.0之間生長(zhǎng)比較良好，其中pH值為6時(shí)，菌落平均直徑達(dá)62.80 mm?？傮w來說，在偏堿性條件下生長(zhǎng)比較緩慢，微酸性條件下有利于菌絲生長(zhǎng)。

2.4.3不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

測(cè)定結(jié)果表明，多主棒孢霉病原菌在所選擇的5種碳源和氮源配制的培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)，但不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的差異較為明顯。從表3可以看出，所選擇的5種碳源以麥芽糖比較適合菌絲的生長(zhǎng)，培養(yǎng)5 d菌落直徑達(dá)86.60 mm，其生長(zhǎng)速率為12.37 mm/d，其次是D-甘露糖，可溶性淀粉作為碳源的生長(zhǎng)最慢，生長(zhǎng)速率僅為7.68 mm/d。氮源病原菌最適生長(zhǎng)氮源為硝酸鈉，其生長(zhǎng)速率為8.71 mm/d，其次是硝酸鈣，以硝酸銨生長(zhǎng)最慢。

2.4.4光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

通過連續(xù)培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)不同光照下病原菌菌絲的生長(zhǎng)無明顯差異，無論是在連續(xù)黑暗還是在連續(xù)光照等條件下，其菌絲菌落直徑和菌落生長(zhǎng)速率基本一致。平均生長(zhǎng)速率值分別為13.0 mm/d和 12.8 mm/d，不同處理間差異不顯著。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)木棉葉片上的發(fā)病部位經(jīng)病原菌分離純化、致病性測(cè)定和形態(tài)特征觀察，確定引起木棉褐斑病的病原菌是多主棒孢霉菌Corynespora cassiicola。該菌在自然條件下可寄生于多種植物的種子、枯死部位或土壤中，其寄主范圍廣泛，可以侵染煙草、黃瓜、番茄、木瓜、香蕉、廣藿香和一串紅等多種植物，引起植株葉片褪綠、壞死等癥狀[16-21]。多主棒孢霉菌過去作為一種次要病害未引起相應(yīng)關(guān)注，自北美熱帶地區(qū)暴發(fā)番茄棒孢霉葉斑病和橡膠棒孢霉葉斑病以來，近年來在我國(guó)已由次要病害上升為主要病害，而且危害程度日益嚴(yán)重[22]。木棉葉斑類的病害較多，危害較為嚴(yán)重的有炭疽病、擬盤多毛孢葉斑病、黑痣病和葉點(diǎn)霉圓斑病等，高拓等在云南紅河所分離的致病菌為尾孢屬真菌，其病原主要危害葉片，并未發(fā)現(xiàn)有危害樹干的情況[23]，而本試驗(yàn)中所分離的多主棒孢霉病原菌，在后期進(jìn)行危害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病原菌除危害木棉葉片外，還可危害木棉樹干，造成樹干發(fā)病部位壞死。

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同作物上的多主棒孢菌株進(jìn)行了基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究。不同作物上多主棒孢菌株的生物學(xué)特性有所不同。對(duì)該菌的相關(guān)生物學(xué)特性研究表明，多主棒孢的分生孢子可借風(fēng)、雨或農(nóng)事操作在田間傳播，遠(yuǎn)距離的傳播以種子傳播為主，而且休眠菌絲可以在種子表皮或種皮內(nèi)潛伏，成為后期危害的初侵染源。在菌落生長(zhǎng)研究中，眾多研究表明，該菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28 ℃，產(chǎn)孢最適溫度為30 ℃，而萌發(fā)溫度為15～35 ℃，萌發(fā)對(duì)濕度要求較高，相對(duì)濕度達(dá)90%以上才能萌發(fā)，水滴中萌發(fā)率最高[24-26]，因此，高溫、高濕條件有利于棒孢葉斑病的流行和蔓延。通過平行比較發(fā)現(xiàn)，張賀對(duì)巴西橡膠樹棒孢落葉病的研究結(jié)果[24]與本結(jié)果基本一致，在微酸至中性環(huán)境中生長(zhǎng)較好，但與羅霓等從番木瓜和木薯上所分離的多主棒孢霉測(cè)定結(jié)果[27-28]差異較大，原因可能是不同寄主植物上的生理小種之間的差異。由于供試碳、氮源與培養(yǎng)條件的不同，導(dǎo)致對(duì)碳源和氮源的利用之間也會(huì)有所差異。