新疆野核桃F1表型性狀與SSR標(biāo)記連鎖分析

李勤霞++張萍

摘要：以新疆伊犁鞏留縣平底圓核桃、橢圓核桃及其雜種F1，以及隨機(jī)選取的60份野核桃種質(zhì)資源為研究材料，對(duì)其表型性狀、SSR遺傳多樣性及其親緣關(guān)系進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，8個(gè)表型性狀在群體中呈連續(xù)分布，與其正態(tài)分布曲線擬合較好，彼此之間具有相關(guān)性。變異系數(shù)表明各個(gè)性狀的變異均超過10%，說明個(gè)體間的表型值變異較大。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行主成分分析，表明株高、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)、最小葉寬這5個(gè)指標(biāo)是引起野核桃表型差異較大的因子。通過10對(duì)多態(tài)性高的SSR引物共檢測(cè)出35個(gè)等位變異位點(diǎn)，變異范圍在2～6之間，平均每對(duì)SSR引物可檢測(cè)到3.5個(gè)等位位點(diǎn)。遺傳相似系數(shù)（GS）變異范圍為0.51～0.95。GS值在0.55水平上的UPGMA聚類分析可將供試的野核桃種質(zhì)資源劃分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個(gè)組。豐富的遺傳變異可為野核桃遺傳改良及分子育種提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：野核桃；遺傳多樣性；SSR標(biāo)記；表型性狀

中圖分類號(hào)： S664.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-041-05

生物體遺傳多樣性的實(shí)質(zhì)是其在遺傳物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)上的變異，表現(xiàn)在群體、個(gè)體、組織、細(xì)胞、分子水平等不同層次上[1]。以往人們常根據(jù)植株形態(tài)鑒定雜交子代，但形態(tài)學(xué)鑒定周期較長(zhǎng)，易受栽培環(huán)境影響，具有很大的局限性。近年發(fā)展起來的基于物種DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)，具有不易受環(huán)境影響、引物信息共享、鑒定速度快等優(yōu)點(diǎn)，是鑒定雜交子代的有力手段[2]。于是，將形態(tài)學(xué)與分子手段相結(jié)合的研究方法隨之興起[3]，如對(duì)不同類型小豆的SSR標(biāo)記及其性狀進(jìn)行研究[4]，對(duì)大豆[Glycine max （L.） Merr]農(nóng)藝性狀與SSR標(biāo)作進(jìn)行研究[5]，以及對(duì)桃（Amygdalus persica L.）的形態(tài)特征進(jìn)行研究[6-8]等，類似研究較多。

新疆野核桃（Juglans regia）為胡桃科胡桃屬植物，是栽培核桃的直系祖先，具有許多優(yōu)良的遺傳特性，在我國(guó)僅分布于新疆伊犁鞏留縣野核桃溝自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，是我國(guó)珍貴的天然野生資源。新疆野核桃不僅是我國(guó)重要的野生核桃資源，更是研究栽培核桃起源、進(jìn)化、自然選擇不可多得的原始材料。曾有報(bào)道，遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，林木對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力也就越強(qiáng)，而遺傳多樣性的降低或消失將導(dǎo)致林木在適應(yīng)、繁殖方面產(chǎn)生衰退，同時(shí)抵抗力也會(huì)下降[9-10]。新疆野核桃作為一種重要的林木，對(duì)其遺傳多樣性的研究顯得尤為重要。目前，關(guān)于新疆野核桃的研究較多，王肇延對(duì)其DNA的提取方法以及野核桃遺傳多樣性進(jìn)行了研究[11]；王磊等對(duì)野核桃的形態(tài)特征進(jìn)行了研究[12]；袁海濤利用野核桃的表型基礎(chǔ)數(shù)據(jù)全面構(gòu)建了新疆野核桃的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，并對(duì)其構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)的方法進(jìn)行了研究[13]；張維等對(duì)其種群動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究[14]，但對(duì)表型性狀還沒有進(jìn)行較深入研究，而表型性狀不僅是遺傳多樣性的組成部分，更為野核桃的遺傳育種提供了依據(jù)。因此，本研究將野核桃的表型性狀及SSR標(biāo)記的多態(tài)性相結(jié)合，以期了解其表型性狀的同時(shí)，更加全面地了解其形態(tài)多樣性的來源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

材料選自新疆伊犁河谷地鞏留縣西北部的野核桃溝，2014年5月下旬選取2棵長(zhǎng)勢(shì)較好且表型性狀差異較大的野核桃樹（父本：平底圓核桃，母本：橢圓核桃，兩樹相隔50 m左右）進(jìn)行人工授粉雜交，待果實(shí)成熟后，將F1種子移栽到新疆烏魯木齊縣花卉生產(chǎn)基地內(nèi)，共計(jì)培養(yǎng)幼苗368株。

1.2研究方法

1.2.1表型性狀的選取

從培養(yǎng)的F1幼苗中隨機(jī)選取60[CM）]株進(jìn)行測(cè)量，所取性狀包括株高、莖高、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、最小葉寬、最小葉長(zhǎng)、側(cè)枝長(zhǎng)。所有數(shù)據(jù)均使用游標(biāo)卡尺測(cè)量。單位均為cm。

1.2.2DNA提取與SSR試驗(yàn)過程

在苗期提取上述60株對(duì)應(yīng)幼苗的嫩葉DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的大小及降解情況，并用UVP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳的瓊脂糖凝膠觀察和拍照。將各材料的DNA濃度稀釋至30 ng/μL，于 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所用的20對(duì)SSR引物的堿基序列來源于NCBI網(wǎng)站公布的核桃SSR引物，由華大科技生物公司合成。對(duì)親本材料進(jìn)行SSR引物篩選，試驗(yàn)選出PCR擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物10對(duì)用于進(jìn)一步分析。

參照王肇延SSR反應(yīng)體系和程序[11]，經(jīng)優(yōu)化后確定反應(yīng)體系為10 μL，其中包括Mg2+ 2.5 mmol/L、引物 0.25 μmol/L、dNTPs 0.18 mmol/L、Taq酶0.5 U，模板DNA約為30 ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃ 延伸9 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Thermal Cycler S1000型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)反應(yīng)體系中加入2 μL的溴酚藍(lán)。用8%的非變性聚丙烯酰胺電泳技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)。每樣品點(diǎn)樣2.5 μL，用DYY-6C型電泳儀在65 mA恒電流下電泳約2 h，取下凝膠在搖床上進(jìn)行銀染處理（固定液搖洗13 min；加AgNO3溶液，搖床銀染 10 min；后再用雙蒸水清洗2次，洗去殘留的AgNO3；顯色液倒入直至出現(xiàn)清晰的條帶后終止反應(yīng)，最后用雙蒸水沖洗 2～3次），結(jié)果拍照保存。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 18.0軟件對(duì)F1代個(gè)體表型性狀進(jìn)行遺傳變異統(tǒng)計(jì)和分析。統(tǒng)計(jì)參數(shù)包括平均值、最大值、最小值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、偏度、峰度、變異系數(shù)，并繪制頻率分布圖。利用 Excel 對(duì)每對(duì)SSR引物擴(kuò)增的多個(gè)等位位點(diǎn)上有帶的賦值為“1”，無帶的賦值為“0”。采用NTSYS-pc2.1軟件按照非加權(quán)配對(duì)平均法（UPGMA）和SHAN程序進(jìn)行聚類分析。統(tǒng)計(jì)等位位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性信息含量（PIC）參數(shù)值，無多態(tài)性的條帶未統(tǒng)計(jì)。采用SPSS 18.0對(duì)野核桃SSR標(biāo)記基因型與株高、莖高、莖粗等性狀進(jìn)行連鎖分析，利用Pearson相關(guān)系數(shù)判斷SSR標(biāo)記與株高、莖粗、最大葉長(zhǎng)等相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)度是否顯著。[HJ1.57mm]

2結(jié)果與分析

2.1F1代群體表型性狀遺傳變異

F1群體表型性狀在個(gè)體間存在差異（表1）。其中，株高最大值是18.67 cm，最小值9.36 cm，標(biāo)準(zhǔn)差2.28 cm，變異系數(shù)15.83%。莖高最大值13.78 cm，最小值2.80 cm，標(biāo)準(zhǔn)差2.71 cm，變異系數(shù)33.29%。莖粗最大值0.53 cm，最小值 0.16 cm，標(biāo)準(zhǔn)差0.10 cm，變異系數(shù)28.58%。最大葉寬最大值12.09 cm，最小值3.22 cm，標(biāo)準(zhǔn)差1.82 cm，變異系數(shù) 23.59%。最大葉長(zhǎng)最大值20.23 cm，最小值5.65 cm，標(biāo)準(zhǔn)差3.76 cm，變異系數(shù)30.56%。最小葉寬最大值4.77 cm，最小值1.06 cm，標(biāo)準(zhǔn)差0.96 cm，變異系數(shù)34.80%。最小葉長(zhǎng)最大值13.55 cm，最小值2.35 cm，標(biāo)準(zhǔn)差2.93 cm，變異系數(shù)46.40%。側(cè)枝長(zhǎng)最大值15.42 cm，最小值5.43 cm，標(biāo)準(zhǔn)差2.38 cm，變異系數(shù)23.94%。F1個(gè)體間差異明顯，不同表型性狀的變異系數(shù)為15.83%～46.40%，變異程度最小的是株高，最大的為最小葉長(zhǎng)。各個(gè)性狀的變異均超過10%，說明個(gè)體間的表型值變異較大。

株高、莖高、莖粗、最大葉寬的偏度均為負(fù)值，分別為 -0.44、-0.07、-0.13、-0.15，表示柱形圖向正態(tài)分布區(qū)域右側(cè)偏斜。而最大葉長(zhǎng)、最小葉寬、最小葉長(zhǎng)、側(cè)枝長(zhǎng)的偏度均為正值，分別是0.51、0.24、0.81、0.35。其中，最小葉長(zhǎng)峰度的絕對(duì)值最小，說明其離散程度最小，莖粗的峰度絕對(duì)值最大，說明其離散程度最大。8個(gè)表型性狀的偏度和峰度的絕對(duì)值均小于1，符合正態(tài)分布的特點(diǎn)（表1、圖1）。

2.2表型性狀的相關(guān)性及主成分分析

2.2.1相關(guān)性分析

各性狀之間除最小葉長(zhǎng)外，相關(guān)性多數(shù)較明顯，其中，株高與莖高、莖粗、最大葉寬及側(cè)枝長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與最大葉長(zhǎng)及最小葉寬呈顯著正相關(guān)，與最小葉長(zhǎng)的相關(guān)性不顯著；莖高與株高、莖粗、最大葉寬及側(cè)枝長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，與最小葉寬相關(guān)性不顯著；莖粗與株高、莖粗、最大葉寬、最大葉長(zhǎng)及側(cè)枝長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與最小葉寬呈顯著相關(guān)，與最小葉長(zhǎng)相關(guān)性不顯著；最大葉寬與株高、莖高、莖粗、最小葉寬及側(cè)枝長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)相關(guān)性不顯著；最大葉長(zhǎng)與莖粗、最小葉長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與株高、莖高呈顯著正相關(guān)，與最大葉寬、最小葉寬及側(cè)枝長(zhǎng)相關(guān)性不顯著；最小葉寬與最大葉寬呈極顯著正相關(guān)，與株高及莖粗呈顯著正相關(guān)，與莖高、最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)及側(cè)枝長(zhǎng)相關(guān)性不顯著；最小葉長(zhǎng)與最大葉長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與莖高呈顯著正相關(guān)，與其他指標(biāo)相關(guān)性均不明顯；側(cè)枝長(zhǎng)與株高、莖高、莖粗及最大葉寬呈極顯著正相關(guān)，與其他指標(biāo)相關(guān)性不顯著（表2）。

2.2.2主成分分析

通過變異系數(shù)分析，表明野核桃表型性狀差異大小不同，在此基礎(chǔ)上，對(duì)8個(gè)表型性狀進(jìn)行了主成分分析，從而獲得了這些性狀之間的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率。研究發(fā)現(xiàn)，前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到了76535%， 足以反映出原始因子所代表的大部分信息。在第1主成分中，株高、莖粗的絕對(duì)值較大；第2主成分中，最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)絕對(duì)值較大；第3主成分中，最小葉寬的絕對(duì)值較大（表3）。通過這3個(gè)主成分分析可以確定：株高、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)、最小葉寬這5個(gè)指標(biāo)是引起野核桃表型差異較大的因子。

2.3野核桃SSR標(biāo)記分析

試驗(yàn)利用13對(duì)SSR引物對(duì)野核桃進(jìn)行分析，共篩選出10對(duì)多態(tài)性高的SSR引物，對(duì)60份野核桃種質(zhì)群體進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)等位位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)性信息含量（PIC）等進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)（表4）。10對(duì)SSR引物擴(kuò)增得到的基因片段長(zhǎng)度在100～450 bp， PCR 擴(kuò)增總計(jì)得到35個(gè)等位變異位點(diǎn)，等位位點(diǎn)數(shù)在2～6之間，平均每對(duì)SSR引物可以檢測(cè)到3.5個(gè)等位位點(diǎn)數(shù)。多態(tài)信息含量（PIC值）變化范圍為0.332～0.736，平均為0.494。

2.4SSR聚類分析

通過10對(duì)多態(tài)性SSR引物分析，60份野核桃材料的遺傳相似系數(shù)（GS）變異范圍為0.51～0.95，平均值為0.642。其中個(gè)體1和3的GS值最大（0.85）， 表明兩者的親緣關(guān)系很近。根據(jù)材料間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法對(duì)野核桃[CM（25]種質(zhì)進(jìn)行聚類分析（圖2），利用10對(duì)SSR標(biāo)記將60份野核桃種質(zhì)相互區(qū)分，在GS值為0.55水平上將所有的材料劃分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4個(gè)組，Ⅰ組包括了36份種質(zhì)材料，Ⅱ組包括6份種質(zhì)材料，Ⅲ組則包括了7份種質(zhì)材料，Ⅳ組包括11份種質(zhì)材料。

2.5SSR標(biāo)記與表型性狀的連鎖分析

標(biāo)記與性狀之間的連鎖分析，是根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)的基因型以及數(shù)量性狀的表型對(duì)個(gè)體進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著則說明標(biāo)記與數(shù)量性狀存在關(guān)聯(lián)[15]。試驗(yàn)共檢測(cè)到與8個(gè)表型性狀相連鎖的SSR標(biāo)記位點(diǎn)5個(gè)，其中與莖粗相關(guān)的標(biāo)記是SSR4，與最大葉長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)記有2個(gè)，分別是SSR5、SSR7；與最小葉寬相關(guān)的標(biāo)記有2個(gè)，分別是SSR4、SSR9；與最小葉長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)記是SSR10（表5）。

3討論

遺傳多樣性是種質(zhì)資源研究、保護(hù)和開發(fā)利用的基礎(chǔ)，不僅具有一定的理論意義，還具有重要的實(shí)際意義，對(duì)于揭示物種演化過程和進(jìn)化潛能、了解群體遺傳結(jié)構(gòu)及多態(tài)性水平有重要價(jià)值，也為物種起源的研究、親本的選配、品種的分類、保護(hù)等多個(gè)方面提供了依據(jù)。

3.1野核桃表型性狀分析

表型性狀具有直觀性的特點(diǎn)，對(duì)遺傳多樣性的研究及物種演化過程和進(jìn)化潛能、了解群體遺傳結(jié)構(gòu)及多態(tài)性有重要價(jià)值，并為物種起源研究、親本的選配、品種的分類及保護(hù)等提供依據(jù)[16]。本試驗(yàn)通過對(duì)野核桃表型性狀的研究，表明F1群體的8個(gè)表型性狀均呈正態(tài)分布，且這些性狀均可進(jìn)行后續(xù)作圖群體的QTL分析[17-18]，也說明了這些性狀可能為多基因控制的數(shù)量性狀[19]。相關(guān)性分析表明，各性狀之間除最小葉長(zhǎng)外，其他性狀相互之間相關(guān)性多顯著或極顯著，尤其是株高、莖高、莖粗、最大葉寬與其他性狀之間，以及它們相互之間的相關(guān)性多顯著或極顯著。變異系數(shù)結(jié)果表明個(gè)體間差異明顯，不同表型性狀的變異系數(shù)在15.83%～46.40%之間，變異程度最小的是株高（15.83%），最大的為最小葉長(zhǎng)（4640%）。各個(gè)性狀的變異均超過10%，說明個(gè)體間的表型值變異較大，反映出即使是同一條件下，由于遺傳漂變、自然選擇、基因突變、基因流等遺傳變異因素的影響，個(gè)體的表型仍有較大的差異，同時(shí)也說明，表型具有可塑性，由生境及內(nèi)部遺傳變異共同影響[20-21]。為了進(jìn)一步探究引起野核桃表型變異的主要因素，進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果表明，株高、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最小葉長(zhǎng)、最小葉寬這5個(gè)指標(biāo)是引起野核桃表型差異較大的因子，可以為以后野核桃的相關(guān)研究提供依據(jù)，豐富的表型性狀多樣性為野核桃的品種選育和遺傳育種的親本選擇提供了豐富的種質(zhì)資源。

3.2野核桃SSR遺傳多樣性分析

SSR標(biāo)記可從DNA水平上鑒定雜種真?zhèn)?，具備周期短、重?fù)性高、不受時(shí)間和生長(zhǎng)環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)。利用該方法輔助選擇雜種，可提高真雜種的選擇效率，有助于促進(jìn)育種進(jìn)程。另外，SSR標(biāo)記具備鑒定苗期真雜種的特點(diǎn)，所以利用SSR標(biāo)記輔助創(chuàng)建遺傳群體，可以確保所創(chuàng)建群體遺傳來源的可靠性[22]。本試驗(yàn)對(duì)單個(gè)群體中的個(gè)體進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明，60個(gè)個(gè)體分成4大類，親緣關(guān)系最近的只有1對(duì)，即個(gè)體1號(hào)和5號(hào)，表明不同的單株之間即使給予相同的外部條件進(jìn)行培養(yǎng)，其遺傳多樣性仍較為豐富。因此，可以得知各個(gè)單株即使分布在很近的地域范圍，同處在相同或相近的氣候和地域環(huán)境條件下，各自的遺傳背景卻仍存在一定的多樣性[23]。

3.3野核桃表型性狀與SSR標(biāo)記相關(guān)性分析

本研究中通過對(duì)60份野核桃種質(zhì)資源基于遺傳距離的聚類分析，在GS值0.54水平上將所有的材料劃分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4組，說明野核桃不同單株之間存在較大的遺傳差異。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表型性狀分析與SSR標(biāo)記分析聚類的結(jié)果具有顯著或極顯著的相關(guān)性。歲立云等在對(duì)中華稱猴桃和美味稱猴桃紅肉類型稱猴桃調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，2種稱猴桃親緣關(guān)系較近，有按地理來源優(yōu)先聚類的趨勢(shì)，且果實(shí)性狀數(shù)據(jù)和AFLP數(shù)據(jù)之間具有極顯著的相關(guān)性[24]。這說明同一個(gè)地理地域來源的野核桃種質(zhì)資源SSR分子標(biāo)記上的遺傳多樣性在一定程度上可以反映表型性狀上的多樣性。

總之，本試驗(yàn)通過對(duì)野核桃表型形態(tài)及SSR標(biāo)記的綜合研究，發(fā)現(xiàn)野核桃的表型形態(tài)豐富，不僅是受到自然選擇、環(huán)境等因素的影響，同時(shí)也是遺傳變異所導(dǎo)致的結(jié)果。因此，今后在對(duì)野核桃進(jìn)行品種改良和遺傳育種工作過程中，其表型性狀和分子標(biāo)記上表現(xiàn)出的豐富的遺傳變異，可以為野核桃繁育、改良及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

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