葡萄柚的組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)

葉維雁++劉惠民++李賢忠++王倩++何靜++夏賽

摘要：以葡萄柚無菌實(shí)生苗的上胚軸、下胚軸和葉片為外植體，研究其組織培養(yǎng)和植株再生技術(shù)。結(jié)果表明，葡萄柚上胚軸分化不定芽的能力最強(qiáng)；誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2 mg/L+蔗糖40 g/L，培養(yǎng)40 d后不定芽分化率為78.33%，不定芽數(shù)為3.66個；最適生根培養(yǎng)基為l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L，生根率達(dá)73.33%，生根數(shù)為1.91條/株；生根苗移栽30 d后成活率達(dá)70%以上。

關(guān)鍵詞：葡萄柚；離體培養(yǎng)；不定芽；植株再生

中圖分類號： S666.304+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0034-04

葡萄柚（Citrus paradise Macf.）屬蕓香科柑橘屬常綠植物，香港稱為“西柚”，在廣東新會一帶又稱“番柑”，是甜橙和柚的天然雜交種，結(jié)果時果實(shí)懸掛成串，簇生如葡萄，因此被稱為葡萄柚[1]，為世界四大柑橘類群（寬皮柑橘類、甜橙類、檸檬來檬類、葡萄柚和柚類）之一[2]。葡萄柚果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特、柔軟多汁、酸甜可口，口感好，可用于制備新鮮果汁、罐頭和沙拉[3]，含有豐富的維生素C、柚苷和橙柑，具有消除疲勞、清熱退火、消食、減肥和護(hù)膚等特殊功效[4]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值。

葡萄柚傳統(tǒng)種子繁殖方式的遺傳性狀易產(chǎn)生較大變異，而嫁接方式成本較高，很難滿足市場對良種苗木的大量需求。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行葡萄柚良種的快速繁殖可以克服常規(guī)方法費(fèi)時的缺點(diǎn)，還可獲得具有高度一致和優(yōu)良表型的群體，而且創(chuàng)建高效、穩(wěn)定的植株再生體系可以為葡萄柚的無病苗木繁育、誘變育種及遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)造有利條件。迄今為止，許多柑橘品種已經(jīng)在組織培養(yǎng)與再生體系的構(gòu)建上取得了成功[5-12]，而關(guān)于葡萄柚再生體系建立的報道仍很少，本試驗(yàn)以葡萄柚種子萌發(fā)的無菌苗為試材，構(gòu)建穩(wěn)定的植株再生體系，并探討幾個相關(guān)的影響因素，以期為葡萄柚的快速繁殖、品種改良和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1材料與方法

1.1無菌實(shí)生苗的獲取

2013年11月從云南省林科院西雙版納州普文葡萄柚試驗(yàn)園挑選生長結(jié)果良好的帕利斯（Perlist）品種植株，取其成熟鮮果的飽滿種子，裝入大燒杯，燒杯口用紗布封住，流水沖洗干凈表面黏液。在超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇表面滅菌 15 s，再用0.1% HgCl2浸泡20 min，無菌水沖洗8次，在無菌濾紙上剝?nèi)?nèi)外種皮，接種于1/5 WPM固體培養(yǎng)基上。1 L 0.1% HgCl2中滴加1～2滴吐溫-20，以提高HgCl2的殺菌效果[13]。21 d后，取無菌實(shí)生苗作為外植體供體。

1.2不定芽的誘導(dǎo)

1.2.1不同濃度的TDZ與NAA對不定芽誘導(dǎo)的影響

以WPM+蔗糖40 g/L為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑苯基噻二唑基脲（thidiazuron，TDZ）0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg/L，共7個處理。取21 d苗齡的無菌實(shí)生苗，在上胚軸中部切取長約1.5 cm的小段，水平接種在培養(yǎng)基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)。

1.2.2不同濃度的AgNO3對不定芽誘導(dǎo)的影響

以 WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、5.0、10 mg/L）的 AgNO3，共6個處理。取21 d苗齡的無菌實(shí)生苗，在上胚軸中部切取長約1.5 cm的小段，水平接種在培養(yǎng)基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)。

1.2.3不同濃度的蔗糖對不定芽誘導(dǎo)的影響

以WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度（20、30、40、50、60 g/L）的蔗糖，共5個處理。取21 d苗齡的無菌實(shí)生苗，在上胚軸中部切取長約 1.5 cm 的小段，水平接種在培養(yǎng)基上，每處理接種20個上胚軸小段，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)。

1.2.4不同外植體對不定芽誘導(dǎo)的影響

從21 d苗齡的無菌實(shí)生苗中分別選取上胚軸、下胚軸、葉片作為外植體，水平接種于WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AgNO3 2.0 mg/L+蔗糖40 g/L培養(yǎng)基上，共3個處理，每處理接種20個外植體，重復(fù)3次，40 d后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)。

1.3生根培養(yǎng)

當(dāng)不定芽長至約2 cm時，切下長勢較好且大小相同的單芽接種于生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以1/2 WPM+蔗糖 40 g/L+活性炭（activated carbon，AC）0.1%為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的NAA，每處理接種20個單芽，重復(fù)3次。生根培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計生根率、生根數(shù)，觀察根的生長情況，篩選出適合不定芽生根的培養(yǎng)基。

1.4煉苗移栽

挑選生長健壯的生根苗置于室內(nèi)自然光下煉苗7 d，其間逐漸松開瓶蓋，使生根苗逐漸適應(yīng)外界環(huán)境。挑選長勢較好、株高約3 cm、根長約8 cm的生根苗64株，洗凈根部的培養(yǎng)基后，移栽到由草泥炭、珍珠巖、蛭石、紅土（體積比為 2 ∶1 ∶1 ∶1）組成的混合基質(zhì)中，用多菌靈液澆透基質(zhì)，注意水分、光照、溫度的管理，30 d后統(tǒng)計成活率。

1.5培養(yǎng)條件

WPM培養(yǎng)基均添加瓊脂5 g/L；1/2 WPM培養(yǎng)基里大量元素減半，其他元素含量不變，含瓊脂5 g/L；1/5 WPM培養(yǎng)基里各元素含量均減為WPM培養(yǎng)基的1/5，含瓊脂3 g/L。pH值調(diào)至5.7±0.1，121 ℃高壓滅菌18 min后冷卻備用，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照度1 500 lx，光照時間14 h/d。

1.6數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差多重比較分析。觀測變量計算公式如下：

愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

不定芽分化率=長出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

不定芽數(shù)=長出的不定芽總數(shù)/長出不定芽的外植體數(shù)；

生根率=生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù)×100%；

生根數(shù)=長出的總根數(shù)/生根的不定芽數(shù)；

移栽成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度的TDZ與NAA對不定芽誘導(dǎo)的影響

上胚軸培養(yǎng)7 d后兩端切口處開始膨大，12 d左右在兩端切口處有少量淡綠色愈傷組織形成，但隨后愈傷組織并無明顯增加。18 d左右在兩端切口處開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，23 d左右在綠色芽點(diǎn)處開始出芽，并于30 d左右達(dá)到高峰（圖1-A），40 d后不定芽的長度達(dá)1.0～1.5 cm（圖1-B），最長的約2 cm。TDZ與NAA不同的濃度組合對不定芽分化的影響是不同的，其結(jié)果見表1。在NAA濃度為0.1 mg/L的條件下，不同濃度的TDZ均可誘導(dǎo)上胚軸產(chǎn)生愈傷組織和不定芽，但愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率及不定芽數(shù)都有所差異；而不含TDZ的培養(yǎng)基里上胚軸無愈傷組織和不定芽形成。TDZ濃度為1.5 mg/L時愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最高值，為 71.67%，顯著高于其他處理；TDZ濃度為1.0 mg/L時不定芽分化率最高，為56.67%，極顯著高于其他處理；TDZ濃度為1.0 mg/L時不定芽數(shù)最多，達(dá)到3.08個，極顯著高于其他處理。當(dāng)TDZ濃度由1.0 mg/L增加至2.0 mg/L，不定芽分化率降低，不定芽數(shù)減少。由此可見，雖然TDZ是一種強(qiáng)力的細(xì)胞分裂素，但對于葡萄柚上胚軸不定芽的分化，其濃度并不是越高越好，過高濃度的TDZ反而會抑制不定芽的分化。

2.2不同濃度的AgNO3對不定芽誘導(dǎo)的影響

如表2所示，當(dāng)AgNO3濃度為0.5～5.0 mg/L時，上胚軸的愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)均高于對照（不添加AgNO3的處理），其中AgNO3濃度為2.0 mg/L時愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)均達(dá)到最高值，分別為 85.00%、7833%、3.66個；當(dāng)AgNO3濃度由2.0 mg/L增加到 5.0 mg/L 時，愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)均明顯降低，當(dāng)AgNO3濃度增加至10.0 mg/L時，愈傷誘導(dǎo)率、不定芽分化率、不定芽數(shù)都已低于對照，表明過高濃度的AgNO3對葡萄柚上胚軸愈傷組織、不定芽的誘導(dǎo)均具有抑制作用。

2.3不同濃度的蔗糖對不定芽誘導(dǎo)的影響

蔗糖濃度對上胚軸不定芽的分化有明顯影響（表3）。當(dāng)蔗糖濃度為40 g/L時，不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽分化率和不定芽數(shù)均達(dá)到最高值，分別為76.67%和3.69個，且不定芽生長粗壯；當(dāng)蔗糖濃度為20 g/L時，不定芽分化率和不[CM（25]定芽數(shù)分別低至45.00%和1.89個，不定芽生長細(xì)弱，這可能是其后期生長中碳源和能源不足導(dǎo)致的；另一方面，高濃度（60 g/L）蔗糖抑制了不定芽的再生，不定芽分化率和不定芽數(shù)分別只有48.33%和2.11個，這可能是蔗糖濃度過高導(dǎo)致瓶內(nèi)空氣濕度變小或培養(yǎng)基滲透壓升高，形成的一些不利因素造成的。

2.4不同外植體對不定芽誘導(dǎo)的影響

不同外植體對葡萄柚不定芽的誘導(dǎo)影響很大，結(jié)果如表4所示，上胚軸和下胚軸均能分化出不定芽，而葉片始終未能分化出不定芽，其中上胚軸分化不定芽的能力最強(qiáng)，不定芽分化率達(dá)76.67%，不定芽數(shù)達(dá)到3.65個，均極顯著高于下胚軸和葉片。此外，上胚軸一般于接種23 d后開始分化形成不定芽，在28 d左右集中出芽，而下胚軸一般于接種25 d后才開始分化形成不定芽，在30 d左右集中出芽；由此可見，上胚軸的出芽時間要比下胚軸提前2 d左右，這在一定程度上也反映了上胚軸分化不定芽的能力要強(qiáng)于下胚軸，更適合作為葡萄柚不定芽誘導(dǎo)的外植體。

2.5生根培養(yǎng)

不同濃度的NAA對不定芽生根的誘導(dǎo)效果如表5所示，接種40 d后，除對照外均能誘導(dǎo)出一定數(shù)量的不定根（圖1-C），且都較粗壯，部分生根苗除有主根外，還有1～3條側(cè)根，長3～6 cm。說明添加一定量的生長素對葡萄柚不定芽的生根是必須的，其中培養(yǎng)基1/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根效果最好，生根率達(dá)73.33%，生根數(shù)為1.91條/株，均顯著高于其他培養(yǎng)基。當(dāng)NAA濃度由1.5 mg/L增加至2.0 mg/L時，生根率和生根數(shù)分別降低至58.33%和1.31條/株，說明高濃度的NAA對葡萄柚不定芽的生根產(chǎn)生抑制作用。

2.6煉苗移栽

生根苗經(jīng)煉苗后移栽至基質(zhì)（草泥炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石 ∶紅土=2 ∶1 ∶1 ∶1，體積比）中，21 d后幼苗開始長出新葉（圖1-D），30 d后成活率達(dá)70%以上。

3討論與結(jié)論

在植物的離體培養(yǎng)中，在培養(yǎng)基中添加一定量的植物生長調(diào)節(jié)劑可以調(diào)節(jié)外植體的激素水平，從而促進(jìn)不定芽的分化和再生。TDZ是一種苯基脲衍生物，細(xì)胞分裂素活性高于6-BA和KT，作為一種有效的形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑被廣泛用于植物組織培養(yǎng)[14]，范圍遍及草本植物[15-19]和木本植物[20-23]。在含有TDZ（濃度0.1～2.0 mg/L）的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)葡萄柚上胚軸不定芽的分化和形成，其中以1.0 mg/L TDZ誘導(dǎo)效果最好。高濃度的TDZ抑制葡萄柚上胚軸不定芽的分化，當(dāng)TDZ濃度大于1.0 mg/L時，不定芽分化率開始呈現(xiàn)下降的趨勢，不定芽數(shù)也開始減少。細(xì)胞分裂素和生長素按適當(dāng)?shù)谋壤M合在一起有很強(qiáng)的協(xié)同作用，一般情況下能更有效地促進(jìn)不定芽的的分化與生長，TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 的組合對葡萄柚上胚軸不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽分化率達(dá)56.67%，不定芽數(shù)達(dá)3.08個，這可能是由于TDZ 1.0 mg/L 和NAA 0.1 mg/L的濃度配比剛好達(dá)到了上胚軸直接分化不定芽的生理要求，更好地促進(jìn)了DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，細(xì)胞的生長、分裂更加旺盛，促使不定芽的再生。

AgNO3是一種較好的乙烯抑制劑，其提高不定芽再生能力已在多種植物上得到證實(shí)[24-26]。試驗(yàn)中AgNO3可明顯提高葡萄柚上胚軸的不定芽分化率，且不同濃度的AgNO3對不定芽的分化有不同的影響，培養(yǎng)基WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L中添加2.0 mg/L AgNO3最適合葡萄柚上胚軸不定芽的分化，不定芽分化率達(dá)78.33%，不定芽數(shù)達(dá)3.66個；在相同的激素配比下，不定芽分化率隨著AgNO3濃度（大于2.0 mg/L時）的升高而下降，此時AgNO3表現(xiàn)出一定的副作用；AgNO3濃度由2.0 mg/L增加至 5.0 mg/L 時不定芽分化率開始降低，不定芽數(shù)開始減少，當(dāng) AgNO3 濃度達(dá)到10 mg/L時已表現(xiàn)出抑制作用，不定芽分化率、不定芽數(shù)均低于不添加AgNO3的處理。這可能是由于過多的Ag+破壞了離子平衡，以及對植物體的毒害作用所致。

植物組織培養(yǎng)中，糖類為培養(yǎng)物生長發(fā)育提供碳源和能源，并有調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用，其中最常用的糖類是蔗糖[27]；蔗糖濃度過低，碳源和能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致不定芽生長不良；蔗糖濃度過高，導(dǎo)致不定芽失水而生長不良。葡萄柚不定芽誘導(dǎo)的最適蔗糖濃度為40 g/L，此時不定芽分化率和不定芽數(shù)分別為76.67%和3.69個。

植物組織培養(yǎng)中為獲得較高的不定芽分化率，除了篩選合適的激素組合及濃度配比外，還要選擇合適的外植體類型。以葡萄柚的上胚軸、下胚軸、葉片作為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，難易程度不同，由易到難表現(xiàn)為上胚軸>下胚軸>葉片，其中上胚軸的不定芽分化率最高，達(dá)76.67%，與蕉柑[28]、沙田柚[29]不定芽誘導(dǎo)的表現(xiàn)一致，而葉片始終未能形成不定芽，這可能是由于上胚軸、下胚軸、葉片所含內(nèi)源激素水平不同進(jìn)而對外源激素種類、濃度的要求有差別而導(dǎo)致的[30]。植物離體培養(yǎng)中不定芽的分化通常有直接發(fā)生型和間接發(fā)生型2種途徑，本研究中不定芽的分化屬于直接發(fā)生型，各試驗(yàn)組合均能誘導(dǎo)不定芽直接形成，雖然在切口表面有1圈白色松軟的愈傷組織形成，但不定芽基本都是從材料切口表面直接形成，未經(jīng)過愈傷組織階段。此外，不定芽的分化位點(diǎn)有2種，一種是在機(jī)械損傷處如切口，有觀點(diǎn)認(rèn)為機(jī)械損傷能刺激細(xì)胞分裂從而促進(jìn)組織分化，最后引起不定芽的分化和形成；另一種是在沒有機(jī)械損傷處也能產(chǎn)生不定芽，即不定芽的出現(xiàn)不以出現(xiàn)機(jī)械損傷為前提。對于葡萄柚，無論是上胚軸還是下胚軸，不定芽均在有機(jī)械損傷的兩端切面產(chǎn)生，沒有機(jī)械損傷的部位沒有不定芽的產(chǎn)生，證明葡萄柚無菌實(shí)生苗上、下胚軸不定芽的發(fā)生是以發(fā)生機(jī)械損傷為前提條件的。

離體培養(yǎng)條件下不定芽的生根通常須有生長素的誘導(dǎo)，NAA、IBA是誘導(dǎo)生根效果較好且十分常用的2種生長素。葡萄柚不定芽生根試驗(yàn)采用NAA進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，以培養(yǎng)基l/2 WPM+NAA 1.5 mg/L+AC 0.1%+蔗糖40 g/L的生根率最高，生根率達(dá)73.33%，生根數(shù)為1.91條/株，根系粗壯；生根試驗(yàn)中生根苗主根上普遍只有少量側(cè)根（0～3條）長出，不利于移栽后生根苗的存活，這可能與葡萄柚的基因型有關(guān)。關(guān)于如何誘導(dǎo)葡萄柚的離體芽苗長出有大量側(cè)根的根系，還須要作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊連珍. 葡萄柚概述[J]. 熱帶作物研究，1996（1）：67-71.

[2]姜超強(qiáng)，劉惠民. 云南引進(jìn)葡萄柚品種葉片營養(yǎng)分析[J]. 山東林業(yè)科技，2007（1）：4-6.

[3]吳海波，劉惠民. 葡萄柚的栽培及研究概況[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2005，23（1）：69-73.

[4]史海芝，劉惠民，李賢忠. 引進(jìn)美國葡萄柚果實(shí)營養(yǎng)分析[J]. 山東林業(yè)科技，2009（2）：28-31.

[5]敖小平，熊興耀，胡新喜，等. 高效的“大紅”甜橙實(shí)生苗上胚軸離體培養(yǎng)與植株再生體系的建立[J]. 植物生理學(xué)通訊，2007，43（4）：689-692.

[6]胡新喜，敖小平，鄧子牛，等. 成年態(tài)柑橘再生體系研究初報[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：11-13.

[7]張俊娥，鄧秀新. 柑橘愈傷組織植株再生及其倍性鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，26（2）：237-238.

[8]張家銀，郭琛，謝玉明，等. 椪柑成年態(tài)節(jié)間莖段再生體系的建立[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，34（2）：182-185.

[9]曾艷，鄒利娟，蘇智先，等. 坪山柚上胚軸離體再生體系的建立[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2010，18（3）：298-303.

[10]曾艷，蘇智先，鄒利娟，等. 強(qiáng)德勒紅心柚離體培養(yǎng)與植株再生體系的建立[J]. 武漢植物學(xué)研究，2010，28（2）：218-223.

[11]徐海峰，欒愛業(yè)，曾黎輝，等. 雪柑試管苗不定根高頻率誘導(dǎo)和高效再生體系的建立[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，29（1）：148-151.

[12]金建濤，賴鐘雄，劉生財，等. 尤溪金柑離體再生體系優(yōu)化及試管苗保存[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，43（3）：256-262.

[13]李浚明，朱登云. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005，20

[14]徐曉峰，黃學(xué)林. TDZ：一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑[J]. 植物學(xué)通報，2003，20（2）：227-237.

[15]Lata H，Chandra S，Wang Y H，et al. TDZ-induced high frequency plant regeneration through direct shoot organogenesis in Stevia rebaudiana Bertoni：an important medicinal plant and a natural sweetener[J]. American Journal of Plant Science，2013，4：117-128.