現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

汪霖+邵筠喬

摘 要：昆蟲分子生態(tài)學(xué)是一門交叉學(xué)科，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究和解釋昆蟲生態(tài)學(xué)的問題。在昆蟲分子生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用較多的分子生物學(xué)標記技術(shù)有：同工酶（蛋白質(zhì)電泳）方法、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）方法、隨機擴增DNA多態(tài)性（PAPD）方法、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）及微衛(wèi)星標記方法（SSR）及單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)；技術(shù)；昆蟲生態(tài)學(xué)

中圖分類號：Q968. 1 文獻標識碼：A

分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子進化和群體遺傳學(xué)的理論、分子生物學(xué)的技術(shù)手段、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和數(shù)學(xué)的分析方法及其他學(xué)科的知識（如地理學(xué)、古氣候?qū)W等）去研究種群、進化、生態(tài)、行為、分類、生物地理演化、生物保護等學(xué)科領(lǐng)域的各種問題。它主要通過大量使用分子生物學(xué)先進的技術(shù)和方法，在分子水平上研究生態(tài)現(xiàn)象，闡明生態(tài)現(xiàn)象的分子機制。昆蟲分子生態(tài)學(xué)就是以昆蟲作為研究對象，應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)的原理與方法研究昆蟲進化和適應(yīng)機制的一門科學(xué)。它主要通過分子生物學(xué)的方法檢查昆蟲種群或個體的遺傳變異，分析和解釋遺傳變異的特點與規(guī)律，揭示遺傳變異所反應(yīng)的規(guī)律性的東西，從而進一步闡明昆蟲之間一級昆蟲與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。其研究的最典型特色是運用分子遺傳標記來檢測研究對象的遺傳變異特征，揭示昆蟲的演化規(guī)律。

在昆蟲分子生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用較多的分子生物學(xué)標記技術(shù)有：同工酶（蛋白質(zhì)電泳）方法、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）方法、隨機擴增DNA多態(tài)性（RAPD）方法、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）及微衛(wèi)星標記方法（SSR）及單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中，目前應(yīng)用最多，最簡便的是SSR和SNP技術(shù)。下面我們主要介紹在昆蟲生態(tài)學(xué)研究中幾種常用分子標記方法。

1.同工酶方法的應(yīng)用

同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶。自從Hunter和Markert創(chuàng)立同工酶酶譜技術(shù)后，同工酶譜的變化即可作為鑒定物種、研究分類與進化、遺傳與變異的重要指標。在昆蟲分子生態(tài)學(xué)發(fā)展之初，同工酶被廣泛應(yīng)用與昆蟲的分類、種群間抗性的遺傳變異等方面，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，同工酶技術(shù)已慢慢被淘汰。

2.RFLP技術(shù)的應(yīng)用

RFLP又叫作Restriction Fragment Length Polymorphism，即我們所說的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性，而且他作為第一代的生物分子類標記技術(shù)，這種技術(shù)是指通過已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶來處理不同生物個體的DNA，通過利用限制性內(nèi)切酶的多種特異性來達到獲得不同的DNA片段的目的，這種技術(shù)一般是被應(yīng)用于分子雜交，放射性同位素的顯微技術(shù)中，而且也只是主要用于研究生物遺傳的研究中，自問世以來已廣泛運用于多門生物學(xué)科研究中。

在昆蟲生態(tài)學(xué)研究中可以用于昆蟲遺傳譜圖的分析、遺傳連鎖圖的構(gòu)建及數(shù)量遺傳性狀等方面的研究。

3.RAPD技術(shù)的應(yīng)用

RAPD，俗名是隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)，它是由兩位美國科學(xué)家Wiliams和Welsh在1990年提出的，而且他們并不是研究的合作者，而是分開研究的，這種技術(shù)又被稱作任意引物PCR。對于RAPD來說，它所使用的物質(zhì)是十分不相同的，但是對于現(xiàn)存的所有引發(fā)物來說，他對于在DNA序列堿基序列上的特定結(jié)合位點來說，一旦這些特異性DNA位點達到了基因組分布的擴增條件，他就會根據(jù)DNA堿基對的配位原則，完成DNA另一條鏈的合成。

4. AFLP技術(shù)的應(yīng)用

植物基因組的AFLP中的酶切，連接和pcr問題，只要酶切出來能看到些許彌散，pcr就應(yīng)該能看出結(jié)果才對，AFLP技術(shù)的關(guān)鍵就是把握體系的問題，每一個實驗室應(yīng)該有自己的一套體系，照著做一般沒有問題，分子標記，就是純體力勞動，做得很多一般就會有結(jié)果的，這是量變到質(zhì)變的過程。 做AFLP需要用到試劑盒，但試劑盒不如自己做省事，也沒必要。除非你做的量少。但是分子標記要的就是大量重復(fù)性的勞動。因此，試劑盒不如自己做省事，也沒必要，并且試劑盒中很重要的酶往往量不夠用，比如T4連接酶和內(nèi)切酶EcoR I，除非你做的量很少，且不需要摸索體系。酶切出來能看到些許彌散，pcr就應(yīng)該能看出結(jié)果，也不一定。接頭制作和連接體系也很重要，連接時間一般影響不是很大。

5.微衛(wèi)星標記技術(shù)在昆蟲生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

微衛(wèi)星標記ms是一類由幾個（多為1-5個）堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。自1981年 Spritz 首先在珠蛋白中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列到今天微衛(wèi)星序列在生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，微衛(wèi)星標記技術(shù)走過了近 30 多年的發(fā)展變化。其中，20 世紀 80、90 年代是微衛(wèi)星技術(shù)從開始到逐漸成熟的關(guān)鍵階段。1982 年Hamada 等在研究真核生物基因組中 Z-DNA 形成時發(fā)現(xiàn)了一種新的重復(fù)因素——選擇性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys 等通過對小衛(wèi)星（minisatellite）的 DNA 指紋圖譜鑒定證明了串聯(lián)重復(fù)的 DNA 具有很高的長度差異性。與此同時，Tautz 等的研究表明，這種“神秘而簡單冶的 DNA 序列是遺傳變異的重要來源。1989 年Tautz 首次應(yīng)用了基于 PCR 的微衛(wèi)星分型技術(shù)。隨著微衛(wèi)星分子標記的廣泛使用，科研工作者對其進化、功能及在基因組中的分布等研究的了解迅速增加。近年來，微衛(wèi)星分子標記也被廣泛應(yīng)用于昆蟲學(xué)研究的各個領(lǐng)域。截至 2012 年 6 月，共有 16396個昆蟲上微衛(wèi)星位點在 NCBI中記錄，其中雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲的微衛(wèi)星登錄數(shù)量最多，占75%。 這些微衛(wèi)星被廣泛應(yīng)用于昆蟲遺傳作圖、種群遺傳學(xué)研究、個體親緣關(guān)系鑒定等方面。

6.SNP在昆蟲分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性標記，又稱單核苷酸多態(tài)性，指DNA序列中單個堿基的差別，堿基對由于排列方式不同，結(jié)合不同脫氧核苷酸對，這些核苷酸對構(gòu)成密碼子，密碼子則以不同的排列順序編碼蛋白質(zhì)，從而形成自然界多種多樣的生命。SNP在基因組可以劃分為兩種形式：

一是基因編碼區(qū)的功能性突變，主要分布在基因編碼區(qū)，故又稱為cSNP，這類SNP較少，其變異率僅占周圍序列的1/5，但因其在遺傳疾病研究中具有重要意義而備受關(guān)注；

二是遍布于基因組的大量堿基變異。就現(xiàn)在來說，SNP技術(shù)已經(jīng)開始廣泛用于昆蟲分子生態(tài)學(xué)，包括昆蟲種間鑒定，遺傳圖譜的分析、入侵害蟲種群間親緣關(guān)系的區(qū)分等研究。

生態(tài)學(xué)的發(fā)展，SNP技術(shù)的萌芽是古人生態(tài)意識的總和，在古時，古人并不了解整個自然界，但是他們通過長期的打魚，農(nóng)牧以及狩獵積累了大量的樸素的生態(tài)學(xué)知識，比如說農(nóng)作物的生長與季候的關(guān)系、常見的動物有哪些習(xí)性等等，在公園前四世紀時，希臘學(xué)者亞里士多德就曾經(jīng)粗略的描述了動物有種不同的棲息地，還根據(jù)動物生活棲息地的特點將其分為了水棲和路棲，根據(jù)它的食性分成肉食和草食，還有雜食動物等等。隨著人類社會的發(fā)展，人們對于生態(tài)的認識不再僅僅局限于以往的知識積累，人們通過自己的主動探究從而能夠獲得有關(guān)于自然界的種種知識，最后能夠形成一個全面的生態(tài)學(xué)理念極其生態(tài)學(xué)系統(tǒng)的認知應(yīng)用。本文通過描述幾種技術(shù)在昆蟲生態(tài)系統(tǒng)的運用從而得到現(xiàn)在科技在生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用等等相關(guān)關(guān)系，這種應(yīng)用不僅使各種技術(shù)得到提高，還對我們生態(tài)系統(tǒng)的探索起著極大的作用。

參考文獻

[1]郭曉霞，鄭哲民，于廣志.同工酶在昆蟲分類和進化研究中的意義[J].昆蟲知識，2000，37（6）：371-374.

[2]陳輝.RFLP和RAPD遺傳標記技術(shù)及其在昆蟲學(xué)中的應(yīng)用[J].陜西林業(yè)科技，1999（1）：49-52.